Der Einsatz rekombinanter Viren ist eine leistungsstarke Technologie, um sowohl die Virusreplikationsmechanismen zu entschlüsseln als auch Entwicklungsplattformen für Impfstoffe bereitzustellen. Ebenso ist die Erzeugung von qualitativ hochwertigen Virusbeständen für jede virale Studie von der grundlagendsten Forschung bis zu den angewandten Studien von entscheidender Bedeutung. Die Rettung rekombinanter Viren, die optimale Ernte, das Einfrieren und die Titration von RSV-Beständen sind entscheidende Methoden für alle virologischen Studien.
Sie können als traditionell betrachtet werden, bleiben aber heikel und erfordern spezifisches Fachwissen. Am Tag vor der Transfektion bSR-T7/5-Zellen in vollständigem Medium bei 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter Konzentration aussetzen. Verteilen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension pro Brunnen in einer Sechs-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid, bis sie am nächsten Tag 80-90% Konfluenz erreichen. Um jedes Virus zu retten, mischen Sie zuerst aufgetaute Reverse-Genetik-Vektoren in einer Röhre, dann gehen Sie zur Transfektion, nach dem Transfektionreagenz-Hersteller-Protokoll. Als nächstes fügen Sie 250 Mikroliter des reduzierten Serummediums zu den gemischten Vektoren hinzu.
In einem anderen Rohr 10 Mikroliter dieses Transfektionsreagenzes in 250 Mikroliter des reduzierten Serummediums verdünnen. Sanft wirbeln beide Röhren und warten Sie für fünf Minuten. Mischen Sie den Inhalt beider Rohre und warten Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.
In der Zwischenzeit spülen Sie die BSR-T7/5-Zellen mit einem Milliliter des reduzierten Serummediums ab und verteilen Sie 1,5 Milliliter an minimalen essentiellen Medienantibiotika frei, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum pro Brunnen. Bei Bedarf bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung inkubieren. Nach der 20-minütigen Inkubation 500 Mikroliter der Transfektionsmischung in jeden Brunnen geben.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung für drei Tage. Um die Rettungseffizienz zu überwachen, beobachten Sie bei GFP Fluoreszenz unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung einmal pro Tag. Am dritten Tag der Transfektion kratzen Zellen in jedem Brunnen der transfizierten BSR-T7/5 Sechs-Well-Platte.
Übertragen Sie Zellen und Überstand von jedem Brunnen in eine sterile Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhre. Um das gerettete Virus aus den Zellmembranen zu lösen, wirbeln Sie jede Röhre mindestens 30 Sekunden lang kräftig aus. Für die erste Verstärkung der geretteten Viren, entfernen Sie zuerst das Kulturmedium aus der HEp-2-Platte, die am Vortag gesät wurde, dann schnell 500 Mikroliter pro Brunnen der frischen Passage-Null-Virussuspension hinzufügen.
Legen Sie die HEp-2-Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden auf eine Wippe, um sanft zu rühren. Um die erste Passage der geretteten Viren zu produzieren, entsorgen Sie 500 Mikroliter des Inokulums und fügen Sie zwei Milliliter MEM mit 2%FCS hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für drei Tage.
Um die Infektion unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung zu überwachen, beobachten Sie die GFP-Fluoreszenz der HEp-2-Zellen, die einmal pro Tag mit der Passage-Null-Suspension infiziert sind. Beobachten Sie unter einem Hellfeldmikroskop das Auftreten von kleiner Synzytia und Zellablösung, die den zytopathischen RSV-Effekt widerspiegelt. Um die geretteten Viren zu verstärken, verdünnen Sie zunächst die virale Suspension des FCS-freien MEM, um eine Drei-Milliliter-Suspension bei 50 000 PFU pro Milliliter zu erhalten, und entfernen Sie dann das Medium aus dem HEp-2-Kolben.
Fügen Sie schnell die drei Milliliter virale Suspension hinzu und inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius auf einer Wippe Für weiche Serregung für zwei Stunden. Als nächstes entfernen und entsorgen Sie das Inoculum und fügen Sie 15 Milliliter MEM mit 2%FCS hinzu. Bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für zwei bis vier Tage inkubieren.
Um den richtigen Zeitpunkt für die Ernte der Viren zu schätzen, überprüfen Sie die Zellmorphologie und GFP-Fluoreszenz unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass dies in der Regel der Fall ist, wenn 50% bis 80% der HEp-2-Zellschicht aufgrund der zytopathischen RSV-Wirkung, die zwischen 48 und 72 Stunden nach der Infektion auftritt, abgetrennt wird. Als nächstes kratzen Sie alle Zellen mit einem Zellschaber.
Sammeln Sie sowohl die Zellen als auch den Überstand zusammen und übertragen Sie sie in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Fügen Sie 1/10 des Volumens der 10X RSV-Konservierungslösung hinzu. Wirbeln Sie die Rohre kräftig für fünf Sekunden und Zentrifuge für fünf Minuten bei 200 mal g, um die Suspension zu klären.
Übertragen Sie den Überstand in ein 50-Milliliter-Rohr. Wirbel kurz und aliquot die Suspension in kryogenen Röhren mit alkoholbeständigen Tags gekennzeichnet. Tauchen Sie die Röhre mindestens eine Stunde lang in vorgekühlten, minus 80 Grad Celsius Alkohol ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.
Um eine Plaque-Titration Assay durchzuführen, machen Sie zuerst 2X minimum wesentliche Medium durch Verdünnung kommerziellen 10X MEM mit sterilem Wasser und Zugabe von L-Glutamin, 1 000 Einheiten pro Milliliter Penicillin, und ein Milligramm pro Milliliter Streptomycin. Schütteln Sie die Verdünnung kräftig und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, dann fügen Sie 900 Mikroliter des FCS-freien MEM zu sechs Röhren hinzu. Tauen Sie das Virus aliquots und wirbeln sie kräftig für fünf Sekunden.
Um serielle Verdünnungen zu machen, fügen Sie zuerst 100 Mikroliter des Virus zu 900 Mikroliter des Mediums in der ersten Röhre hinzu. Legen Sie die Kappe auf das Rohr und mischen Sie seinen Inhalt durch Wirbeln für ein paar Sekunden, dann fügen Sie 100 Mikroliter der ersten Verdünnung zu 900 Mikroliter des Mediums in der zweiten Röhre. Setzen Sie die Kappe auf das Rohr und Wirbel.
Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zum sechsten Rohr. Schreiben Sie den Virusnamen und die vollständigen Verdünnungen auf die HEp-2 12-Well-Platten. Fügen Sie eine Markierung hinzu, die zu der Platte und ihrer Abdeckung passt, da sie während der Färbung getrennt werden können.
Entfernen Sie das Medium von den Platten und verteilen Sie 400 Mikroliter einer Verdünnung pro Brunnen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden für Virusadsorption. Bereiten Sie während der Virusadsorption das mikrokristalline Cellulose-Overlay vor, indem Sie zunächst den pH-Wert des 2X MEM auf etwa 7,2 mit einer sterilen Natriumbicarbonatlösung auf 7,5 % nach dem Farbindikator einstellen.
Um 100 Milliliter des Overlays zu erhalten, fügen Sie 10 Milliliter 2X MEM, 10 Milliliter 2,4% monokristalline Cellulosesuspension und 80 Milliliter des MEM mit 2%FCS und kräftig mischen. Am Ende der zweistündigen Inkubation zwei bis drei Milliliter der Überlagerung zu jedem Brunnen der 12-Well-Platten hinzufügen, ohne das Inokulum zu entfernen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für sechs Tage.
Um die Zellen mit kristallvioletter Lösung zu färben, schütteln Sie zunächst sanft die Platten, um die mikrokristalline Cellulose-Overlay abzunehmen. Entfernen Sie die Überräube und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X PBS, dann fügen Sie ein bis zwei Milliliter der kristallvioletten Lösung und warten Sie 10 bis 15 Minuten. Entfernen Sie die Lösung, die für die nachfolgende Plattenfärbung wiederverwendet werden kann.
Berechnen Sie schließlich die Virustitter als Bruchteil der Anzahl der sichtbaren Plaques in den Brunnen der Trockenenplatten und des Inokulumvolumens und der Verdünnung. Die Durchführung eines Plaque-Assays auf die Negativkontrolle, transfiziert mit nur der Expression Plasmide von N, P, L, und M2-1 ergab keine Plaque bei der niedrigsten Verdünnung. Die Titer, die aus den transfizierten Zellen gewonnen wurden, sollten über 100 PFU pro Milliliter liegen, wenn die Rettung effizient war.
Die Titer stiegen über die Passagen auf eine Million bis 10 Millionen PFU pro Milliliter in Durchgang eins oder zwei. Dank dieser fluoreszierenden Viren kann die Hemmung der RSV-Expression durch siRNA, die auf das Protein N und das Zellprotein IMPDH abzielt, leicht beobachtet und gemessen werden. Im Gegensatz dazu wurde ein starkes GFP-Signal an Kontrollzellen beobachtet, die mit nicht zielgerichteter siRNA transfiziert wurden, oder Zellen, die mit siRNA gegen das zelluläre Protein GAPDH transfiziert wurden, und gemessen.
Ebenso ermöglichten diese Viren eine einfache Beobachtung der Hemmung der RSV-Multiplikation durch eine antivirale Wirkstoffverbindung. Die Verfolgung des fluoreszierenden Proteins M2-1 in HEp-2-infizierten Zellen zeigte IBs und IB-assoziierte Granulate als sehr dynamische Strukturen. IBs wurden als mobile und kugelförmige Strukturen beobachtet, die in der Lage sind, zu verschmelzen und größere kugelförmige Einschlüsse zu bilden.
IB-assoziierte Granulate durchliefen kontinuierliche Montage-Demontage-Zyklen mit der Bildung von kleinen IB-assoziierten Granulaten, die wuchsen, zu großen IB-assoziierten Granulaten verschmolzen und dann verschwanden. Das Protokoll der Plaquetitration von RSV mit mikrokristalliner Zellulose-Overlay kann leicht an andere Zellen und/oder andere Viren angepasst werden. Es erfordert eine Anpassung der Konzentration der mikrokristallinen Cellulose.
