Wir danken Mitglieder der Wobus Labor für kritische Anmerkungen und Anregungen. Die Arbeit im Labor von CEW wurde von Start-up-Fonds von der University of Michigan, eine berufliche Entwicklung Zuschuss von der NIH / NIAID Regional Center of Excellence für die Bio-Verteidigung und Emerging Infectious Diseases Research (RCE) Program, Region V &#39;Great finanziert Lakes &#39;RCE (NIH Auszeichnung 1-U54-AI-057153) und NIH R01 AI080611. MBG-H. wurde durch die Experimentelle Immunologie (NIH T32 A1007413-16) und die molekularen Mechanismen in Mikrobielle Pathogenität (NIH T32 A1007528) Ausbildungsstipendien an der University of Michigan finanziert. JBC wurde von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brasilien finanziert.

Ein. Kultivierung der Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 <ol><li> Pflegen RAW 264.7-Zellen (ATCC, Katalog # TIB-71) in DMEM-10 Medien, die von hoher Glucose DMEM besteht mit 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin. Zellen werden typischerweise in 175 cm 2 Gewebekulturflaschen mit 35 ml Medium pro Kolben gehalten und bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Gewebekultur-Inkubator. Jedoch kann eine beliebige Größe Kolben mit einem Volumen von Medien, die für die Größe des Fadens verwendet werden. </li><li> Um Zellen aufgeteilt: absaugen die alten Medien, fügen Sie 10 ml frisches DMEM-10 Medien zu den Zellen, und dann kratzen die Zellen aus dem Boden des Kolbens mit einem Zellschaber. Anschließend werden die Zellen in eine homogene Lösung durch Aufstellung Zellen in einer 10 ml Pipette und kräftig Zusammendrücken der Zellen durch die Pipettenspitze prEssed gegen den Boden des Kolbens. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 3 mal so die Zellen nicht mehr verklumpen. Überprüfen durch Lichtmikroskopie, dass eine einzelne Zellsuspension generiert wurde. Dann wird 1 ml (1:10 Verdünnung oder ~ 1x10 7 Zellen) - 2 ml (1:5 Verdünnung oder ~ 2x10 7 Zellen) der Zellsuspension auf eine neue 175 cm 2-Kolben, und bringen das Endvolumen von Medien bis 35 ml. </li><li> Split Zellen, wenn sie nahezu konfluenten (~ 1x10 8 Zellen total/175 cm 2-Kolben) sind: alle drei Tage, wenn beginnend mit einer 1:10-Verdünnung oder alle zwei Tage, wenn beginnend mit einer 1:5-Verdünnung. Verwenden Lichtmikroskopie die Zellmorphologie vor der Spaltung Zellen zu überprüfen. Die meisten der Zellen aussehen sollte rund und nicht aktiviert. Aktivierte Zellen Granulat und / oder verlängerten spindly Morphologie mit Anhängsel. Lassen Sie sich nicht Zellen überwuchern wie diese Zellen normalerweise nicht bilden kann Plaques. Verfolgen Sie die Passage-Nummer und häufig beginnen durch Auftauen einen unteren Durchgang Aliquot von Zellen. (Wir verwenden Durchgang 30 als Cut-off). </li></ol> 2. Infect RAW 264,7 Zellen mit MNV Inokulum <ol><li> Seed RAW 264,7 Zellen in 6-Well-Platten (3,5 cm Durchmesser) mit einer Dichte von 1x10 6 lebensfähigen Zellen / ml in DMEM-10 Medien, und 2 ml dieser Suspension in jede Vertiefung. Es ist wichtig zu Zellen gleichmäßig verteilt in Vertiefungen entweder durch Schwenkplatten von Hand wenigstens 10 mal oder durch Verwendung einer Vorrichtung zum Schaukeln ~ 10 min. Nicht schwenken die Platten, da dies die Zellen-Cluster führen in der Mitte des Brunnens. Ort Platten in eine Gewebekultur-Inkubator (bei ​​37 ° C und 5% CO 2). Erlauben Zellen über Nacht oder für mindestens 4 Stunden befestigen bei 37 ° C Zellen sollten 60 - 80% konfluent für die Plaque-Assay und gleichmäßig durch die gut verteilt. </li><li> Am nächsten Tag bereiten die Virusinokulum, die aus MNV-infizierten Zellen in Gewebekultur oder aus homogenisiertem Gewebe oder Stuhlproben von MNV-infizierten Mäusen sein kann. Bei der Verwendung von Gewebeproben, erbsengroße piECEs von Gewebe werden in 2 ml Schraubverschluss Röhrchen mit sterilem Silicakügelchen in 1 ml DMEM-10 unter Verwendung eines gewebespezifischen Homogenisator (; Roche zB MagnaLyser) homogenisiert. Kotproben für sollte nicht mehr als 3 fäkalen Pellets in 1 ml Medium homogenisiert werden. Alle Proben werden dann eingefroren (bei -80 ° C) und einmal vor der Durchführung des Plaque-Assay aufgetaut. </li><li> Planen 10-fachen Verdünnungen des Virus Inokulum in komplettem DMEM-5-Medium, das aus DMEM / High Glucose, 5% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 besteht U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin. </li><li> Zehnfachen Reihenverdünnungen in 24-Well-Platten werden hergestellt: Eine Repetierpipette dient 1,35 ml Medium in mehreren Mulden zu verzichten, wird der 10 -1 Verdünnung durch Mischen 1,35 ml Medium und 0,15 ml Virus-enthaltende Probe gemacht, und dann 0,15 ml der 10 -1 Verdünnung auf 1,35 ml Medium zugegeben, um das 10 -2 dilutio machenn und so weiter. Es ist wichtig, zu ändern Tipps jedes Mal, wenn Sie eine neue Verdünnung. Ein Mehrkanalpipette können die Verdünnungen von mehreren Proben zu einem Zeitpunkt machen mit zwei Spitzen Einpassen in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte übertragen ein Gesamtvolumen von 0,15 ml pro Vertiefung (siehe 3A) werden. </li><li> Eine typische Verdünnungsbereich für Gewebehomogenaten und fäkale Ãœbersetzungssystem 10 -1 bis 10 -3. Allerdings neigen Plaques aus diesen Proben kleiner zu sein im Vergleich zu denen aus Gewebekultur Proben. Weiterhin kann in einigen Fällen eine 1:100 Verdünnung von Kotproben benötigt wird, um ausreichend verdünnt heraus keine toxischen Bestandteile der Fäkalien, die Zellmonoschicht stören kann und behindern so die Fähigkeit, Plaques zu zählen. Die Verdünnung von Gewebekultur Lysaten hängt vom Zeitpunkt des Interesses während des viralen Lebenszyklus. Verdünnungen, die nach oben bis 10 -9 kann an der Spitze der Infektion benötigt werden. </li><li> Nachdem die serielle Verdünnungen hergestellt werden, beschriften Sie die 6-Well-Plattes mit RAW 264,7 Monoschichten (aus Abschnitt 2.1) mit der Probe Namen und Verdünnungen als überzogen. Eine Platte zu einer Zeit, entfernen Sie alle Medien durch Ausklopfen it out oder Absaugen es. Unmittelbar danach 0,5 ml einer verdünnten Probe zu einem gut, dann mit einem doppelten gut wiederholen, bevor Sie mit dem nächsten Verdünnung. Sobald alle drei Verdünnungen werden mit einer Platte, Schwenkscheibe hin und her von Hand hinzugefügt, um sicherzustellen, dass alle Zellen wurden abgedeckt. Behandeln einer Platte zu einem Zeitpunkt, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen. </li><li> Nach Zugabe von 0,5 ml der Verdünnungen in jede Vertiefung, stapeln Platten aufrecht und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Da das Volumen jeder Vertiefung hinzugefügt, um nicht ausreicht, um die Monoschicht vollständig abzudecken, müssen die Platten sanft hin und her geschwenkt werden von Hand alle 10-15 min oder auf einer schaukelnden Vorrichtung (~ 18 Schwingungen pro min). Dies verhindert, dass Zellen vor dem Austrocknen. </li></ol> 3. Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (SeaPlaque) Overlay Vorbereitung <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hinweis: Es ist ratsam, mehrere Flaschen mit autoklavierten SeaPlaque Agarose vorbereitet haben vor der Zeit. Agarose kann in einer Mikrowelle vor Gebrauch wieder aufgeschmolzen werden. <ol><li> Den Gehalt an Überlagerung für das Gesamtvolumen der Platten erforderlich, bevor die Inkubation 1 Stunde beendet ist. Das Volumen benötigt wird, 2 ml / well oder 12 ml/6-well Platte. Bereiten Agarose (siehe Abschnitt 3.2) und Medien (siehe Abschnitt 3.3) getrennt. </li><li> Um die Agarose vorzubereiten, auszusetzen 3 g SeaPlaque Agarose in einem Gesamtvolumen von 100 ml destilliertem Wasser (3% w / v) in einer Glasflasche. Autoklaven für 20-30 min. (Wenn Agarose wurde bereits vor Hand, re-melt Agarose in der Mikrowelle zubereitet.) Es ist wichtig, SeaPlaque Agarose auf 42 ° C im Wasserbad vor Gebrauch, denn wenn die Agarose zu heiß ist, wird es die Zellen zu töten äquilibrieren. Stellen Sie sicher Wasserstand ist gleich oder höher als das Niveau der Agarose zu unerwünschten Verfestigung zu vermeiden. </li><li> Um die Medien vorzubereiten: make 100 ml 2x MEM-Medium, das sich aus2x MEM, 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin. Äquilibrieren Medien auf 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Mischen sowohl die Agarose und die SeaPlaque 2x MEM-Medien gemeinsam in eine sterile Flasche im Verhältnis 1:1 unmittelbar vor Überlagern der infizierten Zell-Monolayer. Wenn mehr als 200 ml Overlay wird benötigt, Split Volumen in mehrere Flaschen und halten in 37 ° C warmes Wasserbad bis zum Gebrauch. </li><li> Am Ende des 1-stündigen Inkubation (siehe Abschnitt 2.7), absaugen Inokulum off jeder Vertiefung. Langsam 2 ml Overlay an den Rand jeder Vertiefung durch Platzieren der Pipettenspitze gegen die Wand von jeder Vertiefung. Bis zu 5 Platten gleichzeitig ohne Austrocknen Zellen behandelt werden. </li><li> Erlauben der Overlay für etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur vor dem Setzen in die aufrechte Platten Gewebekultur-Inkubator verfestigen. Inkubieren Platten für 48 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> NachDie Inkubationszeit, Plaketten schwach sichtbar, die mit bloßem Auge sind, so überprüfen ungefärbten Platten auf das Vorhandensein von Plaques. Wenn keine Plaques sichtbar sind, für weitere 4 Stunden inkubieren und erneut prüfen. Allerdings sollte die maximale Inkubationszeit nicht mehr als 72 Stunden. </li></ol> 4. Visualisierung der Plaques durch Neutral Red Staining <ol><li> Zu jedem 97 ml 1 × PBS (Gewebekultur Grade, Mg 2 + -,; zu Plaques sichtbar zu machen, wird die neutrale rote Färbung Lösung durch Zugabe von 3 ml Neutralrot (Sigma, Katalog # N2889 0,33% w / v in DPBS) hergestellt Ca 2 + - frei; Gibco, Katalog # 10010). Berechnen des Volumens der Neutralrot Färbelösung für das Experiment benötigt: 12 ml Neutralrot Färbelösung werden für jede Platte mit 6 Vertiefungen notwendig. Dann fügen Sie 2 ml in jede Vertiefung. Obwohl einige Plaque Assayprotokolle die Agarose Stecker aus den Vertiefungen entfernt werden müssen, in diesem Protokoll das Neutralrot Färbelösung wird direkt auf der Auflage aufgenommen. </li><li> Nach einer Stunde incubation bei 37 ° C, prüfen Sie, ob Plaques sichtbar mit Neutralrot Färbelösung noch im Brunnen. Wenn Plaques sind nicht ohne weiteres ersichtlich, ermöglichen die Färbung für einen anderen hr fortsetzen. Weiter Inkubation bis Plaques sichtbar sind. (Hinweis:. Färbung für mehr als 3 Stunden ist nicht optimal, und wenn keine Plaques in der positiven Kontrollprobe sichtbar sind nach 3 Stunden der Färbung, die Plaque-Assay funktionierte nicht richtig) Nach der Färbung ist komplett absaugen Neutralrot Färbelösung , die Gewährleistung der Agarose Stecker ist nicht gestört, und fahren Sie dann mit Zählen der Plaques. </li><li> Graf Plaques, indem Platte umgedreht auf einem Lichtkasten und Kennzeichnung einen Punkt auf gezählt Plaques um doppelte Zählungen zu vermeiden. Wählen Sie die Verdünnung auf Plaques in Brunnen, wo Plaques klar getrennt sind gezählt (dh keine sichtbare Anzeichen von Plaques Zusammenschmelzen). Wenn möglich, zählen Plaques an zwei Verdünnungen. Es ist wichtig anzumerken, dass Plaquegröße kann zwischen MNV Stämmen Virusinokulum variieren und hängt von derZustand der RAW 264,7 Zellen während der Plaque-Assay. </li><li> Wenn keine Plaques sichtbar in einem Bohrloch, entweder es keinen Virus in der Probe oder die Menge des Virus war unter der Nachweisgrenze der Plaque-Assay. In diesem Fall die Vertiefungen färben Rot mit einer ähnlichen Farbe wie andere Plaque-enthaltenden Vertiefungen. Alternativ wird die Abwesenheit von Plaques auch beobachtet, wenn es zu viele Viruspartikel in einer gegebenen Verdünnung sind. Dies führt zur Lyse der gesamten Monoschicht und Brunnen erscheinen orange / gelb. </li><li> Berechnen Virustiter. Fügen Sie die Anzahl der Plaques sowohl in Vertiefungen in einer einzigen Verdünnung und multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor (dh 1 ml, wenn 2 Brunnen mit 0,5 ml infiziert sind). Das ergibt die Menge der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) in Ihrem Inokulum Volumen von 1 ml. Zum Beispiel, wie in Abbildung 4 auf der 10 -2 Verdünnung, muss man auch (mit &quot;II&quot;) 14 Plaques und die anderen auch (mit &quot;V&quot;) hat 17 Plaques. Somit wird der Virustiter 14 seinx10 2 + 17x10 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Infectious MNV-1-Partikel quantifiziert mit einem Plaque-Assay wie schematisch in Abbildung 1 dargestellt werden. 2A zeigt ein Brunnen mit einer Monoschicht von RAW 264,7 Zellen nur vor der Infektion, während 2B zeigt drei sichtbaren Plaques durch römische Zahlen angegeben I, II und III in einem Brunnen. Einzelne Schritte des Assays sind in den Figuren 3A bis F 3A zeigt die Herstellung der 10-fach Verdünnungsreihe einer virushaltigen Probe. 3B zeigt die Übertragung von Verdünnungen auf Wells einer 6-Well-Platte zu duplizieren. Abbildung 3C zeigt die Vorrichtung, die zum Schaukeln RAW 264.7-Zellen mit dem Inokulum bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert 3D zeigt Zellen mit dem SeaPlaque wobei überlagert:. MEMMischung. 3E zeigt eine Platte bei Raumtemperatur, damit das Overlay zu verfestigen, während 3F zeigt Zellen mit einem 0,01% Neutralrot-Lösung 48 h später angefärbt. Nach der Färbung Zellen für 1-3 h und Absaugen der Neutralrot Färbelösung sind Plaques sichtbar und können gezählt werden (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des MNV Plaque-Assay-Protokoll. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Bilder eines Well einer Monoschicht vor der Infektion und nach der Bildung von Plaques. A) RAW 264.7-Zellen wurden über Nacht kultiviert und bebilderten unter einem Lichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. B) Zellen wurden mit einer 0,01% Neutralrot-Lösung nach 48 h angefärbtr der Infektion und visualisiert unter einem Lichtmikroskop bei 4facher Vergrößerung. Römische Zahlen I, II und III zeigen drei sichtbaren Plaques. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Bilder der verschiedenen Plaqueassay Schritte. A) MNV-1 Inokulum wird in 10-fach-Verdünnungen zubereitet. B) Inokulum wird Zellmonoschichten in zwei Vertiefungen aufgenommen. C) Zellen und Inokulum werden durch Schaukeln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. D) Die Zellen werden mit einem 1:1 Gemisch aus Agarose und 2x SeaPlaque MEM-Medium überschichtet. E) Die Platten werden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, damit die Auflage sich zu verfestigen. F) Die Färbung der Zellen mit dem Neutralrot Färbelösung 48 Stunden nach der Infektion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Abbildung 4. MNV-1 Formen Plaques in Zelle monolayers. Hier dargestellt ist eine repräsentative Plaqueassay Platte 48 h nach der Infektion, ausgesucht Plaques mit Neutralrot Färbelösung nach 1 Stunde Inkubation angefärbt. Die Platte zeigt Doppelbestimmung von drei 10-fache Verdünnungen. Wells mit römischen Zahlen I und IV der 10-1 Verdünnung entsprechen markiert; II und V der 10-2 Verdünnung entsprechen; III und VI des 10-3 Verdünnung entsprechen. Der virale Titer der Probe wird unten (siehe Abschnitt 4.5 für Einzelheiten der Berechnung) angegeben.

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Plaque Assay-Verfahren für MNV-1 dargestellt ist hier ein Weg zur Quantifizierung infektiösen MNV Teilchen. Durch Befolgen der Schritte Assay in 3 dargestellt, kann man erhalten reproduzierbare viralen Titern. Die Nachweisgrenze des Tests hängt von der ausgehend Verdünnung verwendet. Beim Starten mit einer 1:10 Verdünnung der Probe, wie oben beschrieben, ist die Nachweisgrenze des Plaque-Assay 10 pfu (dh 1 Plaque sichtbar am 10 -1-Verdünnung). Da jeder Plaque stellt einen einzigen Virus, kann die Plaque-Assay auch zur klonalen Populationen von MNV durch Abheben isolierte Plaques und Propagieren sie wie zuvor beschrieben 1 zu reinigen. Zusätzlich kann Plaqueaufreinigungen auch verwendet, um eine einzelne Viruspopulation aus gemischten Viruspopulationen abzutrennen. Eine Beschränkung der Verwendung eines Plaque-Assay zum Nachweis von MNV Infektion ist, dass nicht alle Stämme MNV Plaques bilden 4. Jedoch kann es möglich sein, die überwunden inability einiger MNV-Stämme, die von Tieren isoliert, um Plaques durch serielles Passagieren diese Viren in Gewebekultur 7 bilden. Eine Alternative zu dem Plaque-Assay ist, um infektiöse Partikel über die TCID 50-Technik 3, 4 zu messen. Dieser Assay quantifiziert die Menge des Virus benötigt, um CPE in 50% der inokulierten Gewebekulturzellen nach Endpunkt Verdünnungen und dauert 1 Woche für MNV 4 abzuschließen produzieren. Zusätzlich dazu, dass langsamer als ein Plaque-Assay ist die TCID 50-Test auch nicht so empfindlich (Nachweisgrenze = 200 TCID 50 / ml) auf Grund der Toxizität von Gewebeproben zu RAW 264.7 Zellen 4. Obwohl kritischen Schritte im Protokoll über das Protokoll beschrieben wurden, bietet der folgende Abschnitt eine Zusammenfassung zur Fehlersuche zu erleichtern. Der wichtigste Schritt in der Protokoll stellt sicher, dass RAW 264.7 Zellen lebensfähig bleiben während des Assays zur Virusreplikation unterstützen. Dies kannin jeder Stufe des Assays über Lichtmikroskopie beobachtet werden. Zelllebensfähigkeit wird auf zweierlei Weise gewährleistet. Erstens sollte darauf geachtet werden, nicht zu lassen Zellen austrocknen beim Umgang Platten werden. Somit werden die Platten einzeln inokuliert geschaukelt während der Infektion Periode und zu schließen, wenn sie nicht behandelt werden, bleiben. Zweitens Lösungen auf Zellen gegeben sein sollte äquilibriert ~ 37 ° C. Weiterhin ist es von entscheidender Bedeutung für die Gesundheit der RAW 264.7-Zellen, um sie in Medien, die Serum endotoxinarm (&lt;10 EU / ml), die Aktivierung von Zellen begrenzt zu halten. Darüber hinaus haben wir einen höheren Ausfallrate der Plaque-Assay unter Verwendung von Zellen beobachtet, wenn von dem Durchgang 30 oder höher. Obwohl dies wird wahrscheinlich von Labor zu Labor unterschiedlich ist, ist es wichtig, eine positive Kontrolle gehören (zB eine Probe mit einem bekannten viralen Titer), um reproduzierbare Titer zu gewährleisten, vor allem bei höheren Durchgang RAW 264,7 Zellen. Um die Verwendung von höheren Durchgang Zellen zu begrenzen, ist es ratsam, Fläschchen frühen passa einfrierenge-Zellen nach Erhalt der RAW 264,7 Zellen und starten Sie eine neue Kultur aus den gefrorenen Flaschen häufig. Starting over mit niedrigen Durchgang Zellkulturen wird auch hilfreich sein, wenn die Zellen veränderte Eigenschaften, wie Fehler zu haften, Veränderungen in der Zellmorphologie (zB von Runde zu spindly und ausbreiten), oder wenn Mykoplasmen-Kontaminationen festgestellt wurde ausstellen. Ein weiterer wichtiger Punkt, um die Aufmerksamkeit zu zahlen, ist zu gewährleisten, dass Pipettenspitzen zwischen den Proben und während Verdünnungen geändert werden. Dadurch wird sichergestellt, genaue Verdünnungsreihen und verhindern eine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Derjenige Schritt im Protokoll wo dieselbe Pipettenspitze wieder verwendet werden kann, wenn serielle Verdünnungen der gleichen Probe zu den Vertiefungen zugegeben. In diesem Fall, sollte man von den meisten verdünnten Inokulum für die am wenigsten zu starten, und kräftig und Abpipettieren bei der Ausarbeitung eines neuen Verdünnung. Die Plaque-Assay-Protokoll ist änderbare mehrere Modifikationen. Eine Änderung, die vorgenommen, wenn t werdenhier sind nicht genügend Zellen zum Impfen Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung ist, lediglich einen einzigen Bohrung für jede Verdünnung zu inokulieren. Da jedoch das Inokulum Volumen 0,5 ml, die Zahl der Plaques muss dann um einen Faktor von 2 bis zu pfu / ml normalisieren multipliziert. Die Plaque-Assay kann auch für den Einsatz mit jedem anderen adhärenten Zelllinie, die die Replikation von MNV unterstützen angepasst werden, und dies hat für die murine Mikroglia BV-2-Zelllinie 8 beschrieben worden. Andere Modifikationen, die implementiert werden können, sind Anpassungen, die für Plaque-Assay-Protokolle für andere Viren entwickelt beschrieben wurden. Im Falle von MNV, haben die folgenden Änderungen bereits erfolgreich umgesetzt; die Verwendung von Methylzellulose statt Sea Plaque Agarose 9 und Färbung der Zellen mit Kristallviolett oder Methylenblau anstelle von Neutralrot 10, 11. Insgesamt kann dieses Protokoll leicht angepasst je nach Bedarf auf andere Plaque-bildenden Viren zu quantifizieren oder für oth werdener Viren, die lytische Infektionen in RAW 264,7 Zellen verursachen, so dass es ein nützliches Werkzeug, um infektiöse Viruspartikel in der Regel quantifizieren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM / Hohe Glukose </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x Penicillin und Streptomycin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-Glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutralrot 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirkonia / Silica-Beads </td><td> BioSpec Produkte </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modell 35 Speed ​​Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lyser Instrument </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Raw 264,7 Zelllinie </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Gewebekultur-Inkubator </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Murine Norovirus (MNV) ist das einzige Mitglied des Norovirus Gattung, die effizient wächst in Gewebekultur 1, 2. Zelllyse und cytopathischen Effekt (CPE) während MNV-1-Infektion von murinem dendritische Zellen oder Makrophagen 1 beobachtet. Diese Eigenschaft der MNV-1 kann verwendet werden, um die Anzahl der infektiösen Partikel in einer bestimmten Probe durch Durchführen einer Plaque-Assay 1 zu quantifizieren. Die Plaque-Assay beruht auf der Fähigkeit von MNV-1 an Zellen zu lysieren und die Löcher in einer konfluenten Zellmonolayer, die aufgerufen werden 3 Plaques bilden. Mehrere Techniken können verwendet werden, um virale Infektionen in Gewebekultur, geerntet Gewebe, klinischen und Umweltproben nachzuweisen, aber nicht alle Maßnahme die Zahl der infektiösen Partikel (zB qRT-PCR). Ein Weg, um infektiöse virale Partikel zu quantifizieren ist, um eine Plaque-Assay 3, welche im Detail unten beschrieben wird ausgeführt. Eine Variation des MNV Plaque-Assay ist die fluorescent Fokus Assay, wobei MNV Antigen in Zellmonoschichten 4 immungefärbt wird. Dieser Assay kann schneller sein, da virale Antigen-Expression vorausgeht Plaquebildung. Es ist auch nützlich zum Titrieren Viren nicht in der Lage, Plaques zu bilden. Jedoch erfordert das fluoreszierende Fokus Assay zusätzliche Ressourcen über die des Plaque-Assay, wie Antikörper und einem Mikroskop, um Fokus-bildenden Einheiten zu zählen. Infektiöse MNV kann auch durch Bestimmung der 50% Gewebekultur infektiöser Dosis (TCID 50) 3 quantifiziert werden. Dieser Assay misst die Menge des Virus erforderlich ist, um CPE in 50% der Gewebekulturzellen inokuliert durch Titrationsverdünnung 5 herzustellen. Allerdings ist seine Nachweisgrenze höher im Vergleich zu einem Plaque-Assay 4. In diesem Artikel beschreiben wir einen Plaque-Assay-Protokoll, das verwendet wird, um effektiv die Anzahl von infektiösen MNV vorhandenen Partikel in biologischen oder Umweltproben 1, 4, 6 kann. Diese Methode ist based auf die Herstellung von 10-fache serielle Verdünnungen von MNV-haltigen Proben, die verwendet werden, um eine Monoschicht von permissiven Zellen (murine Makrophagen RAW 264.7-Zellen) zu inokulieren werden. Virus läßt auf die Zellmonoschicht für einen gegebenen Zeitraum befestigen und dann abgesaugt vor dem Abdecken Zellen mit einem Gemisch von Agarose und Zellkulturmedien. Der Agar ermöglicht die Ausbreitung von viralen Nachkommen zu benachbarten Zellen bei gleichzeitiger Begrenzung Ausbreitung auf weit entfernten Zellen. Folglich werden infizierten Zellen lysiert und Form Löcher in der Monoschicht als Plaques bekannt. Bei ausreichender Ausbreitung des Virus, Plaques sichtbar geworden folgenden Färbung der Zellen mit Farbstoffen, wie Neutralrot, Methylenblau, Kristallviolett oder. Bei niedrigen Verdünnungen, stammt jedes Plaque von einem infektiösen Viruspartikel und seiner Nachkommen, die auf benachbarte Zellen ausbreiten. Somit Zählen der Anzahl der Plaques erlaubt es, Plaque-bildenden Einheiten (PFU) in der unverdünnten Probe 3 zu berechnen.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.5K Aufrufe.  University of Michigan, Ann Arbor. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

Serie: Plaque Assay for Murine Norovirus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Forschung

Umwelt

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Immunologie und Infektion

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Assays für die spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Plaque-Assay: Eine Methode zur Bestimmung des Virustiters als Plaque bildende Einheiten (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Mikrobiologie

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

Source: Madrigal, J. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61048">Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

Ein Assay zur Quantifizierung der Bindung von humanen Norovirus-VLPs an Darmbakterien

1. VLP-bacteria Attachment Assay
CAUTION: Human norovirus VLPs are a biosafety level (BSL)-2 hazard, and all work involving VLPs should be performed in a ...