Wir danken Mitglieder der Wobus Labor für kritische Anmerkungen und Anregungen. Die Arbeit im Labor von CEW wurde von Start-up-Fonds von der University of Michigan, eine berufliche Entwicklung Zuschuss von der NIH / NIAID Regional Center of Excellence für die Bio-Verteidigung und Emerging Infectious Diseases Research (RCE) Program, Region V &#39;Great finanziert Lakes &#39;RCE (NIH Auszeichnung 1-U54-AI-057153) und NIH R01 AI080611. MBG-H. wurde durch die Experimentelle Immunologie (NIH T32 A1007413-16) und die molekularen Mechanismen in Mikrobielle Pathogenität (NIH T32 A1007528) Ausbildungsstipendien an der University of Michigan finanziert. JBC wurde von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brasilien finanziert.

Ein. Kultivierung der Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 <ol><li> Pflegen RAW 264.7-Zellen (ATCC, Katalog # TIB-71) in DMEM-10 Medien, die von hoher Glucose DMEM besteht mit 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin. Zellen werden typischerweise in 175 cm 2 Gewebekulturflaschen mit 35 ml Medium pro Kolben gehalten und bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Gewebekultur-Inkubator. Jedoch kann eine beliebige Größe Kolben mit einem Volumen von Medien, die für die Größe des Fadens verwendet werden. </li><li> Um Zellen aufgeteilt: absaugen die alten Medien, fügen Sie 10 ml frisches DMEM-10 Medien zu den Zellen, und dann kratzen die Zellen aus dem Boden des Kolbens mit einem Zellschaber. Anschließend werden die Zellen in eine homogene Lösung durch Aufstellung Zellen in einer 10 ml Pipette und kräftig Zusammendrücken der Zellen durch die Pipettenspitze prEssed gegen den Boden des Kolbens. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 3 mal so die Zellen nicht mehr verklumpen. Überprüfen durch Lichtmikroskopie, dass eine einzelne Zellsuspension generiert wurde. Dann wird 1 ml (1:10 Verdünnung oder ~ 1x10 7 Zellen) - 2 ml (1:5 Verdünnung oder ~ 2x10 7 Zellen) der Zellsuspension auf eine neue 175 cm 2-Kolben, und bringen das Endvolumen von Medien bis 35 ml. </li><li> Split Zellen, wenn sie nahezu konfluenten (~ 1x10 8 Zellen total/175 cm 2-Kolben) sind: alle drei Tage, wenn beginnend mit einer 1:10-Verdünnung oder alle zwei Tage, wenn beginnend mit einer 1:5-Verdünnung. Verwenden Lichtmikroskopie die Zellmorphologie vor der Spaltung Zellen zu überprüfen. Die meisten der Zellen aussehen sollte rund und nicht aktiviert. Aktivierte Zellen Granulat und / oder verlängerten spindly Morphologie mit Anhängsel. Lassen Sie sich nicht Zellen überwuchern wie diese Zellen normalerweise nicht bilden kann Plaques. Verfolgen Sie die Passage-Nummer und häufig beginnen durch Auftauen einen unteren Durchgang Aliquot von Zellen. (Wir verwenden Durchgang 30 als Cut-off). </li></ol> 2. Infect RAW 264,7 Zellen mit MNV Inokulum <ol><li> Seed RAW 264,7 Zellen in 6-Well-Platten (3,5 cm Durchmesser) mit einer Dichte von 1x10 6 lebensfähigen Zellen / ml in DMEM-10 Medien, und 2 ml dieser Suspension in jede Vertiefung. Es ist wichtig zu Zellen gleichmäßig verteilt in Vertiefungen entweder durch Schwenkplatten von Hand wenigstens 10 mal oder durch Verwendung einer Vorrichtung zum Schaukeln ~ 10 min. Nicht schwenken die Platten, da dies die Zellen-Cluster führen in der Mitte des Brunnens. Ort Platten in eine Gewebekultur-Inkubator (bei ​​37 ° C und 5% CO 2). Erlauben Zellen über Nacht oder für mindestens 4 Stunden befestigen bei 37 ° C Zellen sollten 60 - 80% konfluent für die Plaque-Assay und gleichmäßig durch die gut verteilt. </li><li> Am nächsten Tag bereiten die Virusinokulum, die aus MNV-infizierten Zellen in Gewebekultur oder aus homogenisiertem Gewebe oder Stuhlproben von MNV-infizierten Mäusen sein kann. Bei der Verwendung von Gewebeproben, erbsengroße piECEs von Gewebe werden in 2 ml Schraubverschluss Röhrchen mit sterilem Silicakügelchen in 1 ml DMEM-10 unter Verwendung eines gewebespezifischen Homogenisator (; Roche zB MagnaLyser) homogenisiert. Kotproben für sollte nicht mehr als 3 fäkalen Pellets in 1 ml Medium homogenisiert werden. Alle Proben werden dann eingefroren (bei -80 ° C) und einmal vor der Durchführung des Plaque-Assay aufgetaut. </li><li> Planen 10-fachen Verdünnungen des Virus Inokulum in komplettem DMEM-5-Medium, das aus DMEM / High Glucose, 5% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 besteht U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin. </li><li> Zehnfachen Reihenverdünnungen in 24-Well-Platten werden hergestellt: Eine Repetierpipette dient 1,35 ml Medium in mehreren Mulden zu verzichten, wird der 10 -1 Verdünnung durch Mischen 1,35 ml Medium und 0,15 ml Virus-enthaltende Probe gemacht, und dann 0,15 ml der 10 -1 Verdünnung auf 1,35 ml Medium zugegeben, um das 10 -2 dilutio machenn und so weiter. Es ist wichtig, zu ändern Tipps jedes Mal, wenn Sie eine neue Verdünnung. Ein Mehrkanalpipette können die Verdünnungen von mehreren Proben zu einem Zeitpunkt machen mit zwei Spitzen Einpassen in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte übertragen ein Gesamtvolumen von 0,15 ml pro Vertiefung (siehe 3A) werden. </li><li> Eine typische Verdünnungsbereich für Gewebehomogenaten und fäkale Ãœbersetzungssystem 10 -1 bis 10 -3. Allerdings neigen Plaques aus diesen Proben kleiner zu sein im Vergleich zu denen aus Gewebekultur Proben. Weiterhin kann in einigen Fällen eine 1:100 Verdünnung von Kotproben benötigt wird, um ausreichend verdünnt heraus keine toxischen Bestandteile der Fäkalien, die Zellmonoschicht stören kann und behindern so die Fähigkeit, Plaques zu zählen. Die Verdünnung von Gewebekultur Lysaten hängt vom Zeitpunkt des Interesses während des viralen Lebenszyklus. Verdünnungen, die nach oben bis 10 -9 kann an der Spitze der Infektion benötigt werden. </li><li> Nachdem die serielle Verdünnungen hergestellt werden, beschriften Sie die 6-Well-Plattes mit RAW 264,7 Monoschichten (aus Abschnitt 2.1) mit der Probe Namen und Verdünnungen als überzogen. Eine Platte zu einer Zeit, entfernen Sie alle Medien durch Ausklopfen it out oder Absaugen es. Unmittelbar danach 0,5 ml einer verdünnten Probe zu einem gut, dann mit einem doppelten gut wiederholen, bevor Sie mit dem nächsten Verdünnung. Sobald alle drei Verdünnungen werden mit einer Platte, Schwenkscheibe hin und her von Hand hinzugefügt, um sicherzustellen, dass alle Zellen wurden abgedeckt. Behandeln einer Platte zu einem Zeitpunkt, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen. </li><li> Nach Zugabe von 0,5 ml der Verdünnungen in jede Vertiefung, stapeln Platten aufrecht und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Da das Volumen jeder Vertiefung hinzugefügt, um nicht ausreicht, um die Monoschicht vollständig abzudecken, müssen die Platten sanft hin und her geschwenkt werden von Hand alle 10-15 min oder auf einer schaukelnden Vorrichtung (~ 18 Schwingungen pro min). Dies verhindert, dass Zellen vor dem Austrocknen. </li></ol> 3. Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (SeaPlaque) Overlay Vorbereitung <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hinweis: Es ist ratsam, mehrere Flaschen mit autoklavierten SeaPlaque Agarose vorbereitet haben vor der Zeit. Agarose kann in einer Mikrowelle vor Gebrauch wieder aufgeschmolzen werden. <ol><li> Den Gehalt an Überlagerung für das Gesamtvolumen der Platten erforderlich, bevor die Inkubation 1 Stunde beendet ist. Das Volumen benötigt wird, 2 ml / well oder 12 ml/6-well Platte. Bereiten Agarose (siehe Abschnitt 3.2) und Medien (siehe Abschnitt 3.3) getrennt. </li><li> Um die Agarose vorzubereiten, auszusetzen 3 g SeaPlaque Agarose in einem Gesamtvolumen von 100 ml destilliertem Wasser (3% w / v) in einer Glasflasche. Autoklaven für 20-30 min. (Wenn Agarose wurde bereits vor Hand, re-melt Agarose in der Mikrowelle zubereitet.) Es ist wichtig, SeaPlaque Agarose auf 42 ° C im Wasserbad vor Gebrauch, denn wenn die Agarose zu heiß ist, wird es die Zellen zu töten äquilibrieren. Stellen Sie sicher Wasserstand ist gleich oder höher als das Niveau der Agarose zu unerwünschten Verfestigung zu vermeiden. </li><li> Um die Medien vorzubereiten: make 100 ml 2x MEM-Medium, das sich aus2x MEM, 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin. Äquilibrieren Medien auf 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Mischen sowohl die Agarose und die SeaPlaque 2x MEM-Medien gemeinsam in eine sterile Flasche im Verhältnis 1:1 unmittelbar vor Überlagern der infizierten Zell-Monolayer. Wenn mehr als 200 ml Overlay wird benötigt, Split Volumen in mehrere Flaschen und halten in 37 ° C warmes Wasserbad bis zum Gebrauch. </li><li> Am Ende des 1-stündigen Inkubation (siehe Abschnitt 2.7), absaugen Inokulum off jeder Vertiefung. Langsam 2 ml Overlay an den Rand jeder Vertiefung durch Platzieren der Pipettenspitze gegen die Wand von jeder Vertiefung. Bis zu 5 Platten gleichzeitig ohne Austrocknen Zellen behandelt werden. </li><li> Erlauben der Overlay für etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur vor dem Setzen in die aufrechte Platten Gewebekultur-Inkubator verfestigen. Inkubieren Platten für 48 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> NachDie Inkubationszeit, Plaketten schwach sichtbar, die mit bloßem Auge sind, so überprüfen ungefärbten Platten auf das Vorhandensein von Plaques. Wenn keine Plaques sichtbar sind, für weitere 4 Stunden inkubieren und erneut prüfen. Allerdings sollte die maximale Inkubationszeit nicht mehr als 72 Stunden. </li></ol> 4. Visualisierung der Plaques durch Neutral Red Staining <ol><li> Zu jedem 97 ml 1 × PBS (Gewebekultur Grade, Mg 2 + -,; zu Plaques sichtbar zu machen, wird die neutrale rote Färbung Lösung durch Zugabe von 3 ml Neutralrot (Sigma, Katalog # N2889 0,33% w / v in DPBS) hergestellt Ca 2 + - frei; Gibco, Katalog # 10010). Berechnen des Volumens der Neutralrot Färbelösung für das Experiment benötigt: 12 ml Neutralrot Färbelösung werden für jede Platte mit 6 Vertiefungen notwendig. Dann fügen Sie 2 ml in jede Vertiefung. Obwohl einige Plaque Assayprotokolle die Agarose Stecker aus den Vertiefungen entfernt werden müssen, in diesem Protokoll das Neutralrot Färbelösung wird direkt auf der Auflage aufgenommen. </li><li> Nach einer Stunde incubation bei 37 ° C, prüfen Sie, ob Plaques sichtbar mit Neutralrot Färbelösung noch im Brunnen. Wenn Plaques sind nicht ohne weiteres ersichtlich, ermöglichen die Färbung für einen anderen hr fortsetzen. Weiter Inkubation bis Plaques sichtbar sind. (Hinweis:. Färbung für mehr als 3 Stunden ist nicht optimal, und wenn keine Plaques in der positiven Kontrollprobe sichtbar sind nach 3 Stunden der Färbung, die Plaque-Assay funktionierte nicht richtig) Nach der Färbung ist komplett absaugen Neutralrot Färbelösung , die Gewährleistung der Agarose Stecker ist nicht gestört, und fahren Sie dann mit Zählen der Plaques. </li><li> Graf Plaques, indem Platte umgedreht auf einem Lichtkasten und Kennzeichnung einen Punkt auf gezählt Plaques um doppelte Zählungen zu vermeiden. Wählen Sie die Verdünnung auf Plaques in Brunnen, wo Plaques klar getrennt sind gezählt (dh keine sichtbare Anzeichen von Plaques Zusammenschmelzen). Wenn möglich, zählen Plaques an zwei Verdünnungen. Es ist wichtig anzumerken, dass Plaquegröße kann zwischen MNV Stämmen Virusinokulum variieren und hängt von derZustand der RAW 264,7 Zellen während der Plaque-Assay. </li><li> Wenn keine Plaques sichtbar in einem Bohrloch, entweder es keinen Virus in der Probe oder die Menge des Virus war unter der Nachweisgrenze der Plaque-Assay. In diesem Fall die Vertiefungen färben Rot mit einer ähnlichen Farbe wie andere Plaque-enthaltenden Vertiefungen. Alternativ wird die Abwesenheit von Plaques auch beobachtet, wenn es zu viele Viruspartikel in einer gegebenen Verdünnung sind. Dies führt zur Lyse der gesamten Monoschicht und Brunnen erscheinen orange / gelb. </li><li> Berechnen Virustiter. Fügen Sie die Anzahl der Plaques sowohl in Vertiefungen in einer einzigen Verdünnung und multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor (dh 1 ml, wenn 2 Brunnen mit 0,5 ml infiziert sind). Das ergibt die Menge der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) in Ihrem Inokulum Volumen von 1 ml. Zum Beispiel, wie in Abbildung 4 auf der 10 -2 Verdünnung, muss man auch (mit &quot;II&quot;) 14 Plaques und die anderen auch (mit &quot;V&quot;) hat 17 Plaques. Somit wird der Virustiter 14 seinx10 2 + 17x10 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Infectious MNV-1-Partikel quantifiziert mit einem Plaque-Assay wie schematisch in Abbildung 1 dargestellt werden. 2A zeigt ein Brunnen mit einer Monoschicht von RAW 264,7 Zellen nur vor der Infektion, während 2B zeigt drei sichtbaren Plaques durch römische Zahlen angegeben I, II und III in einem Brunnen. Einzelne Schritte des Assays sind in den Figuren 3A bis F 3A zeigt die Herstellung der 10-fach Verdünnungsreihe einer virushaltigen Probe. 3B zeigt die Übertragung von Verdünnungen auf Wells einer 6-Well-Platte zu duplizieren. Abbildung 3C zeigt die Vorrichtung, die zum Schaukeln RAW 264.7-Zellen mit dem Inokulum bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert 3D zeigt Zellen mit dem SeaPlaque wobei überlagert:. MEMMischung. 3E zeigt eine Platte bei Raumtemperatur, damit das Overlay zu verfestigen, während 3F zeigt Zellen mit einem 0,01% Neutralrot-Lösung 48 h später angefärbt. Nach der Färbung Zellen für 1-3 h und Absaugen der Neutralrot Färbelösung sind Plaques sichtbar und können gezählt werden (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des MNV Plaque-Assay-Protokoll. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Bilder eines Well einer Monoschicht vor der Infektion und nach der Bildung von Plaques. A) RAW 264.7-Zellen wurden über Nacht kultiviert und bebilderten unter einem Lichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. B) Zellen wurden mit einer 0,01% Neutralrot-Lösung nach 48 h angefärbtr der Infektion und visualisiert unter einem Lichtmikroskop bei 4facher Vergrößerung. Römische Zahlen I, II und III zeigen drei sichtbaren Plaques. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Bilder der verschiedenen Plaqueassay Schritte. A) MNV-1 Inokulum wird in 10-fach-Verdünnungen zubereitet. B) Inokulum wird Zellmonoschichten in zwei Vertiefungen aufgenommen. C) Zellen und Inokulum werden durch Schaukeln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. D) Die Zellen werden mit einem 1:1 Gemisch aus Agarose und 2x SeaPlaque MEM-Medium überschichtet. E) Die Platten werden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, damit die Auflage sich zu verfestigen. F) Die Färbung der Zellen mit dem Neutralrot Färbelösung 48 Stunden nach der Infektion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Abbildung 4. MNV-1 Formen Plaques in Zelle monolayers. Hier dargestellt ist eine repräsentative Plaqueassay Platte 48 h nach der Infektion, ausgesucht Plaques mit Neutralrot Färbelösung nach 1 Stunde Inkubation angefärbt. Die Platte zeigt Doppelbestimmung von drei 10-fache Verdünnungen. Wells mit römischen Zahlen I und IV der 10-1 Verdünnung entsprechen markiert; II und V der 10-2 Verdünnung entsprechen; III und VI des 10-3 Verdünnung entsprechen. Der virale Titer der Probe wird unten (siehe Abschnitt 4.5 für Einzelheiten der Berechnung) angegeben.

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	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Plaque Assay-Verfahren für MNV-1 dargestellt ist hier ein Weg zur Quantifizierung infektiösen MNV Teilchen. Durch Befolgen der Schritte Assay in 3 dargestellt, kann man erhalten reproduzierbare viralen Titern. Die Nachweisgrenze des Tests hängt von der ausgehend Verdünnung verwendet. Beim Starten mit einer 1:10 Verdünnung der Probe, wie oben beschrieben, ist die Nachweisgrenze des Plaque-Assay 10 pfu (dh 1 Plaque sichtbar am 10 -1-Verdünnung). Da jeder Plaque stellt einen einzigen Virus, kann die Plaque-Assay auch zur klonalen Populationen von MNV durch Abheben isolierte Plaques und Propagieren sie wie zuvor beschrieben 1 zu reinigen. Zusätzlich kann Plaqueaufreinigungen auch verwendet, um eine einzelne Viruspopulation aus gemischten Viruspopulationen abzutrennen. Eine Beschränkung der Verwendung eines Plaque-Assay zum Nachweis von MNV Infektion ist, dass nicht alle Stämme MNV Plaques bilden 4. Jedoch kann es möglich sein, die überwunden inability einiger MNV-Stämme, die von Tieren isoliert, um Plaques durch serielles Passagieren diese Viren in Gewebekultur 7 bilden. Eine Alternative zu dem Plaque-Assay ist, um infektiöse Partikel über die TCID 50-Technik 3, 4 zu messen. Dieser Assay quantifiziert die Menge des Virus benötigt, um CPE in 50% der inokulierten Gewebekulturzellen nach Endpunkt Verdünnungen und dauert 1 Woche für MNV 4 abzuschließen produzieren. Zusätzlich dazu, dass langsamer als ein Plaque-Assay ist die TCID 50-Test auch nicht so empfindlich (Nachweisgrenze = 200 TCID 50 / ml) auf Grund der Toxizität von Gewebeproben zu RAW 264.7 Zellen 4. Obwohl kritischen Schritte im Protokoll über das Protokoll beschrieben wurden, bietet der folgende Abschnitt eine Zusammenfassung zur Fehlersuche zu erleichtern. Der wichtigste Schritt in der Protokoll stellt sicher, dass RAW 264.7 Zellen lebensfähig bleiben während des Assays zur Virusreplikation unterstützen. Dies kannin jeder Stufe des Assays über Lichtmikroskopie beobachtet werden. Zelllebensfähigkeit wird auf zweierlei Weise gewährleistet. Erstens sollte darauf geachtet werden, nicht zu lassen Zellen austrocknen beim Umgang Platten werden. Somit werden die Platten einzeln inokuliert geschaukelt während der Infektion Periode und zu schließen, wenn sie nicht behandelt werden, bleiben. Zweitens Lösungen auf Zellen gegeben sein sollte äquilibriert ~ 37 ° C. Weiterhin ist es von entscheidender Bedeutung für die Gesundheit der RAW 264.7-Zellen, um sie in Medien, die Serum endotoxinarm (&lt;10 EU / ml), die Aktivierung von Zellen begrenzt zu halten. Darüber hinaus haben wir einen höheren Ausfallrate der Plaque-Assay unter Verwendung von Zellen beobachtet, wenn von dem Durchgang 30 oder höher. Obwohl dies wird wahrscheinlich von Labor zu Labor unterschiedlich ist, ist es wichtig, eine positive Kontrolle gehören (zB eine Probe mit einem bekannten viralen Titer), um reproduzierbare Titer zu gewährleisten, vor allem bei höheren Durchgang RAW 264,7 Zellen. Um die Verwendung von höheren Durchgang Zellen zu begrenzen, ist es ratsam, Fläschchen frühen passa einfrierenge-Zellen nach Erhalt der RAW 264,7 Zellen und starten Sie eine neue Kultur aus den gefrorenen Flaschen häufig. Starting over mit niedrigen Durchgang Zellkulturen wird auch hilfreich sein, wenn die Zellen veränderte Eigenschaften, wie Fehler zu haften, Veränderungen in der Zellmorphologie (zB von Runde zu spindly und ausbreiten), oder wenn Mykoplasmen-Kontaminationen festgestellt wurde ausstellen. Ein weiterer wichtiger Punkt, um die Aufmerksamkeit zu zahlen, ist zu gewährleisten, dass Pipettenspitzen zwischen den Proben und während Verdünnungen geändert werden. Dadurch wird sichergestellt, genaue Verdünnungsreihen und verhindern eine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Derjenige Schritt im Protokoll wo dieselbe Pipettenspitze wieder verwendet werden kann, wenn serielle Verdünnungen der gleichen Probe zu den Vertiefungen zugegeben. In diesem Fall, sollte man von den meisten verdünnten Inokulum für die am wenigsten zu starten, und kräftig und Abpipettieren bei der Ausarbeitung eines neuen Verdünnung. Die Plaque-Assay-Protokoll ist änderbare mehrere Modifikationen. Eine Änderung, die vorgenommen, wenn t werdenhier sind nicht genügend Zellen zum Impfen Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung ist, lediglich einen einzigen Bohrung für jede Verdünnung zu inokulieren. Da jedoch das Inokulum Volumen 0,5 ml, die Zahl der Plaques muss dann um einen Faktor von 2 bis zu pfu / ml normalisieren multipliziert. Die Plaque-Assay kann auch für den Einsatz mit jedem anderen adhärenten Zelllinie, die die Replikation von MNV unterstützen angepasst werden, und dies hat für die murine Mikroglia BV-2-Zelllinie 8 beschrieben worden. Andere Modifikationen, die implementiert werden können, sind Anpassungen, die für Plaque-Assay-Protokolle für andere Viren entwickelt beschrieben wurden. Im Falle von MNV, haben die folgenden Änderungen bereits erfolgreich umgesetzt; die Verwendung von Methylzellulose statt Sea Plaque Agarose 9 und Färbung der Zellen mit Kristallviolett oder Methylenblau anstelle von Neutralrot 10, 11. Insgesamt kann dieses Protokoll leicht angepasst je nach Bedarf auf andere Plaque-bildenden Viren zu quantifizieren oder für oth werdener Viren, die lytische Infektionen in RAW 264,7 Zellen verursachen, so dass es ein nützliches Werkzeug, um infektiöse Viruspartikel in der Regel quantifizieren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM / Hohe Glukose </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x Penicillin und Streptomycin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-Glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutralrot 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirkonia / Silica-Beads </td><td> BioSpec Produkte </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modell 35 Speed ​​Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lyser Instrument </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Raw 264,7 Zelllinie </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Gewebekultur-Inkubator </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Murine Norovirus (MNV) ist das einzige Mitglied des Norovirus Gattung, die effizient wächst in Gewebekultur 1, 2. Zelllyse und cytopathischen Effekt (CPE) während MNV-1-Infektion von murinem dendritische Zellen oder Makrophagen 1 beobachtet. Diese Eigenschaft der MNV-1 kann verwendet werden, um die Anzahl der infektiösen Partikel in einer bestimmten Probe durch Durchführen einer Plaque-Assay 1 zu quantifizieren. Die Plaque-Assay beruht auf der Fähigkeit von MNV-1 an Zellen zu lysieren und die Löcher in einer konfluenten Zellmonolayer, die aufgerufen werden 3 Plaques bilden. Mehrere Techniken können verwendet werden, um virale Infektionen in Gewebekultur, geerntet Gewebe, klinischen und Umweltproben nachzuweisen, aber nicht alle Maßnahme die Zahl der infektiösen Partikel (zB qRT-PCR). Ein Weg, um infektiöse virale Partikel zu quantifizieren ist, um eine Plaque-Assay 3, welche im Detail unten beschrieben wird ausgeführt. Eine Variation des MNV Plaque-Assay ist die fluorescent Fokus Assay, wobei MNV Antigen in Zellmonoschichten 4 immungefärbt wird. Dieser Assay kann schneller sein, da virale Antigen-Expression vorausgeht Plaquebildung. Es ist auch nützlich zum Titrieren Viren nicht in der Lage, Plaques zu bilden. Jedoch erfordert das fluoreszierende Fokus Assay zusätzliche Ressourcen über die des Plaque-Assay, wie Antikörper und einem Mikroskop, um Fokus-bildenden Einheiten zu zählen. Infektiöse MNV kann auch durch Bestimmung der 50% Gewebekultur infektiöser Dosis (TCID 50) 3 quantifiziert werden. Dieser Assay misst die Menge des Virus erforderlich ist, um CPE in 50% der Gewebekulturzellen inokuliert durch Titrationsverdünnung 5 herzustellen. Allerdings ist seine Nachweisgrenze höher im Vergleich zu einem Plaque-Assay 4. In diesem Artikel beschreiben wir einen Plaque-Assay-Protokoll, das verwendet wird, um effektiv die Anzahl von infektiösen MNV vorhandenen Partikel in biologischen oder Umweltproben 1, 4, 6 kann. Diese Methode ist based auf die Herstellung von 10-fache serielle Verdünnungen von MNV-haltigen Proben, die verwendet werden, um eine Monoschicht von permissiven Zellen (murine Makrophagen RAW 264.7-Zellen) zu inokulieren werden. Virus läßt auf die Zellmonoschicht für einen gegebenen Zeitraum befestigen und dann abgesaugt vor dem Abdecken Zellen mit einem Gemisch von Agarose und Zellkulturmedien. Der Agar ermöglicht die Ausbreitung von viralen Nachkommen zu benachbarten Zellen bei gleichzeitiger Begrenzung Ausbreitung auf weit entfernten Zellen. Folglich werden infizierten Zellen lysiert und Form Löcher in der Monoschicht als Plaques bekannt. Bei ausreichender Ausbreitung des Virus, Plaques sichtbar geworden folgenden Färbung der Zellen mit Farbstoffen, wie Neutralrot, Methylenblau, Kristallviolett oder. Bei niedrigen Verdünnungen, stammt jedes Plaque von einem infektiösen Viruspartikel und seiner Nachkommen, die auf benachbarte Zellen ausbreiten. Somit Zählen der Anzahl der Plaques erlaubt es, Plaque-bildenden Einheiten (PFU) in der unverdünnten Probe 3 zu berechnen.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.2K Aufrufe.  University of Michigan, Ann Arbor. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

Serie: Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;