Unser Protokoll bietet eine Pipeline für die präzise Integration und einfache visuelle Erkennung von CRISPR-Bearbeitungen sowie ein Beispiel für Post-Edit-Phänotypisierung. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die einfache CRISPR-Bearbeitungserkennung, die eine effiziente und vereinfachte Identifizierung erfolgreicher Bearbeitungen ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache Generierung und Charakterisierung von krankheitsassoziierten Varianten im Zebrafisch.
Hier untersuchen wir das Long-QT-Syndrom. Folgestudien zu pharmazeutischen Therapien sind dann möglich. Beginnen Sie mit dem Entwurf von zwei sgRNA-Leitfäden, um die Knock-in-Zielortsequenz zu entfernen, indem Sie den Zebrafisch-Ortholog für das interessierende Gen identifizieren.
Verwenden Sie Ensembl, um die Zielstelle innerhalb der interessierenden Gensequenz zu lokalisieren, einschließlich der Flankensequenz mit zwei Kilobasen, die zur Erstellung der Vorlage verwendet wurde. Verwenden Sie ein Design-Software-Tool wie CRISPOR und wählen Sie Danio Rerio-Spezies und Cas-Enzym aus. Für den Zwei-sgRNA-Ansatz wählen Sie eine sgRNA vor dem Zielexon und eine zweite sgRNA innerhalb des unmittelbaren Downstream-Introns.
Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten sgRNAs eine hohe Spezifität und eine geringe vorhergesagte Off-Target-Bindung aufweisen. Verwenden Sie CRISPOR-Rankings, um Leitfäden mit minimaler Off-Target-Bindung zu identifizieren. Identifizieren Sie nun die wahrscheinlichsten potenziellen Off-Target-Stellen für die PCR-basierte Sanger-Sequenzierung der Genotypisierung.
Nach der Auswahl der beiden sgRNAs erhalten Sie das umgekehrte Komplement für jeden, zwei komplementäre Oligos, die der Mutation vorausgehen, und zwei komplementäre Oligos stromabwärts der Mutation. Fügen Sie kompatible Restriktionsstellen auf jedem Oligo hinzu, um die Anleitung in das Plasmid Ihrer Wahl zu integrieren. Für die Integration der ausgewählten Führungssequenzen in das DR274-Plasmid erzeugen Sie einen Überhang mit einer BSA1-Restriktionsstelle mit fünf Primzahlen und konstruieren die BSA1-Erkennungsstellen an den fünf Hauptenden der Führungslinien.
Als nächstes entwerfen Sie die exogene Vorlage für HDR im Zebrafisch, indem Sie zwei Sequenzfragmente auswählen, die das M-venöse YFP-Reportergen flankieren, das im PKHR5-Plasmid untergebracht ist. Teilen Sie die Vorlage in zwei Segmente, um sie auf beiden Seiten des M-venösen YFP-Reportergens einzufügen. Stellen Sie sicher, dass sich die geteilte Stelle in einem Intron befindet, um zu vermeiden, dass die Codierungssequenz unterbrochen wird.
Integrieren Sie alle erforderlichen Modifikationen, die im Manuskript erwähnt werden, um das Klonen in das PKHR5-Plasmid zu erleichtern. Injizieren Sie die Embryonen etwa 40 Minuten nach der Befruchtung in das Einzellstadium. Nach drei Tagen Befruchtung betäuben Sie die Zebrafischlarve, indem Sie sie in eine 25-Millimeter-Petrischale mit 0,3% MS222 geben, bis sie ihren selbstaufrichtenden Reflex verlieren.
Nach der Anästhesie die Larve in die Vertiefung einer 24-Well-Platte geben. Mit einem Mikroskop, das GFP oder YFP nachweisen kann, suchen Sie nach Reportergenfluoreszenz in den Augen der Larve. Nachdem Sie die Bilder der Larve aufgenommen haben, dokumentieren Sie das Vorhandensein oder Fehlen der Reportergenexpression.
Um eine genaue und präzise HDR-Genbearbeitung zu bestätigen, führen Sie eine Genotypisierung durch, indem Sie die Larve drei Tage nach der Befruchtung betäuben, wie zuvor gezeigt, und die genomische DNA mit der Hotshot-Methode aus dem Schwanzclip isolieren. Fügen Sie den herausgeschnittenen Schwanzclip zu 15 Mikrolitern 25 Millimolar-Natriumhydroxid hinzu und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, dann neutralisieren Sie ihn mit 1,5 Mikrolitern Tris-Salzsäure. Zentrifugieren Sie bei 13, 800 mal G für 30 Sekunden und behalten Sie den Überstand mit der extrahierten genomischen DNA.
Erholen Sie sich die Larve in E3-Medien und bringen Sie sie in das Haltungssystem zurück, wenn weitere Studien beabsichtigt sind. Verwenden Sie die extrahierte genomische DNA als Vorlage, um PCR-basierte Sanger-Sequenzierung von On-Target- und potenziellen Off-Target-Sites durchzuführen. Stellen Sie sicher, dass das On-Target-Primer-Design die Mutationsstelle und die nächstgelegene sgRNA-Bindungsstelle erfasst.
Entwerfen Sie einen separaten Sequenzierungsprimer, um den Übergang vom eingefügten Homologiearm und dem Zielgen zu erkennen, um die Integration in das interessierende Gen zu bestätigen. Entwerfen Sie Primer, um die drei wichtigsten potenziellen Off-Target-Standorte zu sequenzieren. Stellen Sie On- und Off-Target-Genotypisierung, Herzfrequenz, Perikarddimensionen, EKG-Phänotypisierung und Reportergendaten zusammen, die für jeden Zebrafisch identifizierbar sind.
Die YFP M venöse Reportergenexpression wurde auf den Inseln beobachtet und fungierte als positiver Reporter für eine erfolgreiche Template-Integration. Es wurde festgestellt, dass Reportergen-positive Fische die präzise Bearbeitung G2A haben, die die R56Q-Variante in ZKCNH6A einführt. Die Messung der Perikarddimensionen als Verhältnis der Augenpartie ist hier dargestellt.
Ein Trend der Bradykardie mit zunehmendem Perikardödem im Zusammenhang mit den Störungen der kardialen Repolarisation bei Zebrafischen wurde in den R56Q-Gen-editierten Larven beobachtet. EKG-Aufzeichnung von einem Zebrafischlarvenherz drei Tage nach der Befruchtung wird hier gezeigt. Der wichtigste Aspekt dieses Ansatzes ist das Leitliniendesign, wie es bei CRISPR-Verfahren häufig der Fall ist.
Effektive Anleitungen sind für erfolgreiche CRISPR-Bearbeitungen unerlässlich. Alternative CRISPR-Methoden können befolgt werden, was mehr Präzision oder andere Funktionalitäten ermöglicht. Zusätzlich können große Gene eingefügt werden, wie z.B. ein primer Editierkomplex, der ein in vivo induzierbares Editiersystem bereitstellt.
