T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

1. Gene Targeting Design- <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bestellen Sie eine entsprechende BAC-Klon für den genomischen Region von Interesse. Damit dies isogen zu der Art von ES-Zellen zu modifizieren zB werden RPCI-23 und-24 RPCI BAC-Klone zur Gen-Targeting mit C57BL / 6-ES-Zellen. </li><li> Bewerben konventionellen Gen-Targeting-Kriterien bei der Gestaltung des Targeting-Vektors. Wichtige Parameter sind, ob die Änderung erforderlich ist konstitutiv oder bedingte zu sein, die Definition kritischer Exons (CE) zum Löschen in einem Gen-Knockout-Strategie und den Abstand und die Anordnung der Intron-Kassetten. Hinweis: Jeder von ihnen ist im Detail an anderer Stelle 10 diskutiert. </li><li> Wählen genomischen Regionen jeweils von 5-6 kb flankieren das Ziel Modifikationsstelle. HINWEIS: Die Größe des subklonierten Einsatz ist daher typischerweise 10-12 kb, obwohl die obere Grenze kann so hoch wie 80 kb mit einer niedrigen Kopien Subklonierung Plasmid p15A dergleichen sein, pBR322 usw. und bis zu 200 kb einer BACVektor. </li></ol> 2. Multiplex Recombineering Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Design-Oligos zur Plasmidrückgrat (Subklonierung Plasmid) und den selektierbaren Marker (Insertionskassette). Entwerfen jedes Oligos, daß er 180 bp HA flankierenden genomischen Zielstelle und 20 bp der spezifischen Anfangssequenz des Einschubkassette oder Subklonieren Plasmid (Figur 2) enthält. HINWEIS: Homologiearme sollten keine sich wiederholenden Elemente enthalten, werden Vorhandensein von repetitiven Elementen in falscher Ausrichtung und Subklonierung führen. Repetitive Elemente können mit Web-basierte Tools wie die &#39;&#39; Wiederholen Masker &#39;&#39; erkannt werden. </li><li> Umfassen eine einzigartige Restriktionsenzym (RE) vor Ort auf eine der Vektor Oligos, die Gen-Targeting-Vektor für die ES-Zell-Targeting (Abbildung 2) zu linearisieren. </li><li> Überprüfen Oligo Parameter unter Verwendung eines Oligo Analyzer Programm. Achten Sie darauf, Sekundärstrukturen in der Primerregion zu vermeidens. </li><li> Kürzere HA (50 bp) der Einschubkassette wird toleriert und führt zu geringeren Anzahl von Rekombinanten jedoch sicherzustellen, dass die Subklonierung Plasmid HA immer mehr (180 bp). </li><li> Bestimmen Sie die Ausrichtung der genomischen DNA-Inserts des jeweiligen BAC-Klon mit Web-basierte Tools wie &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Stellen Sie die Richtung der Replikation von Oris, indem Sie die Karte von der BAC Plasmidrückgrat im BAC-Bibliothek Konstruktion. HINWEIS: Oris ist in der Regel gegenüber dem Transkriptionsrichtung des Chloramphenicol (Chl) Marker für alle gängigen BAC-Plasmide. </li><li> Hinzufügen zwei terminalen Phosphorothioat (PTO) Bindungen an das 5&#39;-Ende des Oligos, die entgegengesetzt zu der Richtung der Replikation auf dem BAC-Klon ist. Hinzufügen eines 5&#39;-Phosphat Modifikation der Rückwärts Oligo (Abbildung 2). HINWEIS: Die asymmetrische phosphorthioiertes PCR-Kassette auf Red Verdauung erzeugt ss-DNA-Zwischenprodukt, das die Hauptverzögerungsstrang kannder Replikationsgabel. HINWEIS: Maximal Multiplex Rekombinationsfrequenz mit den Folgestrangs geschützt Kassetten beobachtet. Führende Strang geschützt oder Dual geschützt Kassetten können gleichwertige Rekombination Effizienz irgend loci nicht zu produzieren. </li><li> Bestellen Oligos mit PAGE oder HPLC-Reinigung. </li></ol> 3. BAC Klon Transformation mit pSC101 BADgbaA Recombineering Plasmid. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Um die E. machen coli-Stamm mit dem BAC Rekombination beherrschen, verwandeln es mit der pSC101 BADgbaA Plasmid, das die Red Gene 16. HINWEIS: Die pSC101 BADgbaA Plasmid enthält die Rot-RecA-Gene unter der Kontrolle des Arabinose-induzierbaren araC-P BAD-Promotor, ein Tetracyclin-Selektionsmarker und dem temperaturempfindlichen pSC101-Replikon. <ol><li> Erstechen eine sterile Pipettenspitze in der BAC-Agar-Kultur und impfen 5,0 ml LB-Medium (LB), pH 8,0, 12,556; g ml -1 Chl. Wachsen bei 37 ° C für 5 Stunden unter Schütteln bei 200 rpm. </li><li> Kühlen Sie 10% (v / v) Glycerin-Lösung, Mikrozentrifugenröhrchen und Elektroporationsküvetten auf Eis. Kühlen eines gekühlten große Zentrifuge und Mikro bis 4 ° C. </li><li> Bestimmen Sie die optische Dichte (OD) der Kultur mit einem Spektralphotometer und Messung der Extinktion bei 600 nm. Bereiten elektro Zellen (wie unten beschrieben), wenn ein OD 600 Lesung von 0,3 bis 0,8 erreicht wird. </li><li> Spin down Zellen in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in einer großen Zentrifuge bei 1.216 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Wash-Zellen mit 1 ml gekühltem 10% Glycerin und Spin-down-Zellen bei 17.949 × g für 20 sec bei 4 ° C. Führen Sie den Waschschritt insgesamt 3 mal. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 ul 10% Glycerin und fügen 10-200 ng der Plasmid pSC101 BADgbaA Rekombinationstechnologie. Besorgen Sie sich eine Einzelzellsuspension durch Pipettierennach oben und unten mehrere Male und dann übertragen Sie die Zellen in ein vorgekühltes 1 mm Lücke Elektroporationsküvette. </li><li> Elektroporation der Zellen mit einem Wert von 1,8 kV, 25 &amp; mgr; F und 200 Ω. HINWEIS: Überprüfen Sie die richtigen Einstellungen für jede Marke von Elektroporator. Eine Zeitkonstante der Elektroporation unter 4 zeigt die Anwesenheit von Salz und anderen Verunreinigungen. </li><li> Der Zellen sofort erholen in 1 ml LB und Übertragen der Zellen in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wachsen die BAC GBAA Kultur bei 30 ° C für 2 Stunden unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die pSC101 BADgbaA Plasmid verloren, wenn die Zellen bei 37 ° C aufgrund der Inaktivierung des temperaturempfindlichen RepE Replikationsfaktor gezüchtet. Wachsen GBAA Zellen bei 30 ° C, um die Rekombination Funktionen aufrecht zu erhalten. </li><li> In 9 ml LB, die 12,5 &amp; mgr; g ml -1 Chl und 4 ug ml -1 Tetracyclin (Tet) auf den wiederhergestellten BAC GBAA Kultur. Wachsen dieBAC GBAA Kultur O / N bei 30 &#160; ° C unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die Transformationseffizienz von Elektroporation der supercoiled Plasmid GBAA ausreichend hoch ist, um eine Sättigung Wachstums O / N in flüssigen Medien zu ermöglichen. </li></ol></li></ol> 4. Vorbereitung der Insertion Kassetten und Subklonierung Plasmide <ol style="margin-left: 40px;"><li> HA in die Einschubkassette (n) und die Subklonierung Plasmid einzubauen, führen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der langen modifizierten Oligos, wie unten beschrieben. <ol><li> Optional: Plasmid Verschleppung in die Rekombination Reaktion zu vermeiden, verwenden Sie ein R6K Herkunft oder ähnlich engen Wirtsbereich Plasmidmatrize die Insertionskassette verstärken. </li><li> Alternativ Arisierung der Plasmid-Vorlage mit einem RE-Digest (Tabelle 2). Wählen Sie ein RE, die außerhalb der PCR-Amplifikation Region schneidet und hitzeinaktiviertem. Hitze inaktiviert die RE wie vom Hersteller, Produzent empfohlenacturer. </li><li> Einrichten der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines High-Fidelity DNA Polymerase hotstart Systems. Bereiten Sie ein PCR-Mastermix so detailliert (Tabelle 3). Führen Temperaturwechsel, wie dargestellt (Tabelle 3). </li></ol></li><li> Analyse der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Last 1-5 ul jeder PCR auf ein 1% (w / v) Agarosegel, das 0,5 mg ml -1 Ethidiumbromid (EtBr). HINWEIS: Die Anwesenheit von nicht-spezifischen Amplifikationsprodukte nicht in der Rekombinationstechnologie Reaktion stören. In einigen Fällen jedoch können Primer-Dimere Rekombinationstechnologie Effizienz verringern. </li><li> Reinige PCR-Produkte unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kits. <ol><li> Optional: Entfernen Sie die Plasmidmatrize von PCRs durch Behandlung mit DpnI gefolgt von PCR-clean-up. Eluieren der DNA in einem minimalen Volumen von sterilem, deionisiertem Wasser (wie vom Hersteller empfohlen). HINWEIS: Die Zugabe von DpnI zu PCR-Reaktionen führt zu einer verringerten Effizienz der Spaltung von th ungereinigteme methylierte Plasmid-DNA-Vorlage. </li></ol></li><li> Quantifizierung PCR amplifizierte DNA durch Agarose-Gel-Analyse gegen einen bekannten Satz von DNA-Standards zB λ HindIII Verdau oder durch Verwendung eines ND-Spektrophotometer. </li></ol> 5. Subklonierung Plus-Insertion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verdünnen Sie die O / N BAC GBAA Kultur 50-fach durch Zugabe von 200 ul in 10 ml LB + Chl + Tet. Wachsen bei 30 &#160; ° C unter Schütteln bei 200 Upm für 1 h 50 min. Gehören Probe als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Kühlen aller Rekombinationstechnologie Materialien und Ausrüstung auf 4 ° C, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben. </li><li> Gießen LB Agar pH 8 Platten, die das korrekte Konzentration des geeigneten selektiven Antibiotikums (en), die die Auswahl des DNA-Fragments, das für die Auswahl der Subklonierungsvektor (Tabelle 4) sowie eingeführt wird ermöglicht. HINWEIS: Einige Antibiotika sind pH-empfindlich. Verwenden LBAgar pH 8 in der Regel. </li><li> Eine 10% ige (w / v) Lösung von L-Arabinose. Filtersterilisieren durch einen 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter. HINWEIS: Arabinose induziert die Expression der Proteine ​​von der Rekombination GBAA Plasmid. </li><li> Überprüfen Sie die OD der BAC GBAA Kultur mit einem Spektralphotometer. Sobald eine OD600 von 0,25-0,3 erreicht ist, induzieren die Rekombination Proteinen wie im folgenden Schritt beschrieben. </li><li> Gib 200 ul der 10% Arabinose Lösung auf 10 ml der BAC Kultur bis zu einer Endkonzentration von Arabinose von 0,2% zu erreichen. Gehören nicht-induzierten Kultur (ohne Arabinose), die als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie die BAK-Kultur zu einem 37 &#160; ° C Schüttelinkubator und induzieren Red Ausdruck für 45 min Schütteln bei 230 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die Expression von Red Proteine ​​ineffizient bei 30 ° C. </li><li> Spin down Zellen und wäscht mit 10% Glycerin 3-mal, wie in Schritt 3.1.5 beschrieben. </li><li> Fügen 600-1,000 ng von jedem der Subklonierung Plasmid und die Insertion Kassette (n) zu der Rekombinationstechnologie Reaktion. Fügen Sie einen Vektor nur und Vektor plus Einzeleinsatz steuert, um die Rekombination Kompetenz und Integrität des Vektors und den Kassetten zu überprüfen. </li><li> Besorgen Sie sich eine Einzelzellsuspension durch Auf- und Abpipettieren. Führen Elektroporation in Schritt 3.1.7 und anschließende Erholung in 1 ml LB bei 37 ° C für 1 Stunde für Multi-copy Plasmiden oder in 10 ml LB 3 h für BAC-Vektoren beschrieben, bei 37 ° C. </li><li> Platte verschiedene Verdünnungen der Kultur gewonnen zB 90%, 10%, 1% auf die duale Selektions Agarplatten wachsen bei 37 &#160; ° C für 16 Stunden. </li></ol> 6. Analyse von Rekombinanten <ol style="margin-left: 40px;"><li> Optional: Wählen Sie 6 bis 12 Kolonien und durchzuführen, Kolonie-PCR mit einem HA flankierenden Primer und einen Einsatz spezifischer Primer. Fügen Sie die Subklonierung Plasmid und das Einsetzen cassette Plasmid sowie die Mutter BAC-Klon als negative Kontrollen. <ol><li> Führen Agarosegel-Analyse der Kolonie PCRs. Identifizieren positiver Klone durch die Anwesenheit von einem hellen Band an der erwarteten Größe. HINWEIS: Der hohe Wirkungsgrad des SPI Klonens erzeugt meist richtig Rekombinanten. </li></ol></li><li> Wählen Kolonien in 5 ml LB pH 8, der die selektive Antibiotikum und wachsen O / N bei 37 ° C. </li><li> Bereiten DNA-Minipreps Verwendung einer Säule Reinigungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten BAC Miniprep DNA unter Verwendung von Standard Phenol-Chloroform-Isolation oder ein ähnliches Protokoll. </li><li> Führen RE verdaut, auf dem Miniprep-DNA. Separate DNA durch Agarose-Gelelektrophorese. Analysieren RE Mustern, um die Klone, die die erwarteten Fragmente Größen der richtigen Zielvektor zu identifizieren. Wähle eine RE, die eindeutig diskriminiert zwischen dem Vektor fehlt Einlage (n) und dem Vektor, der die Einlage (n). </li><li> Optional: Zellen, die frei von der BAC, die immer noch in der E. vorhanden sind erhalten coli nach Rekombination, verwenden Sie die Miniprep-Plasmid-DNA, um DH5alpha oder DH10B E. verwandeln coli-Zellen. </li><li> Führen Sie die DNA-Sequenzierung über den HA und Insertionskassette zu Oligosynthese Fehler zu überprüfen. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue.">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li><li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells.">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).</li><li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+use+of+YACs,+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals.">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li><li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+trimming:+minimizing+clone+overlaps.">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

Der Bau der ES-Zelllinien und Maus-Modellen ist historisch beteiligten Gene Targeting unter Verwendung von Plasmid-Konstrukte, die die modifizierte Allel 4 enthalten. Jedoch ist die Konstruktion dieser Komplex das Gen-Targeting-Vektoren hat sich als eine erhebliche Engpass bei der rechtzeitigen Herstellung derartiger Modelle. Die Entwicklung der Rekombination auf der Basis der Konstruktion des Vektors Strategien hat verbesserte Vektor-Design und effizienter Vektor Montage erlaubt. Dennoch aktuellen Rekombination Protokolle beinhalten noch mehrere Schritte erfordern Zwischen Plasmidreinigung und verschiedene Bakterienstämme. Subklonierung und Einfügen bietet einen neuartigen Ansatz zur Konstruktion des Vektors, die in einem Elektroporation Ereignis in der Wohn BAC Wirtsstamm durchgeführt werden können. Die Nützlichkeit der SPI in Gen-Targeting wurde hier eine Vielzahl von Vektor-Konstruktionsanwendungen getestet. In allen hier betrachteten Fällen erwiesen SPI effizient zu sein und die richtige rekombinante Plasmid wurde hergestellt.In der Mehrzahl der Fälle wurden die mehrere unterschiedliche Kassetten richtig im Targeting-Vektor inseriert. Große DNA-Kassetten und Vektoren wurden leicht in dem SPI-Protokoll aufgenommen und zeigte die Flexibilität dieses Systems. SPI beruht auf der Verwendung langer Homologiesequenzen und Phosphorothioat (PTO) Schutz der linearen DNA-Kassetten. PTO Modifikation verleiht Schutz gegen Exonukleasen zu der linearen DNA 20,21 und die lange HA erhöht Rekombinationseffizienz zu Multiplexing ermöglichen. Synthese von längeren Oligo-Sequenzen erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit des Ansammelns Fehler insbesondere Deletionen. Mutationen im Oligo kann besonders nachteilig sein, wenn sie zu decken Protein kodierenden Regionen. DNA-Sequenzierung über den HA und die das gesamte Länge des eingelegten Kassette ist empfehlenswert, um Klone mit allen Sequenzänderungen zu eliminieren. Verwendung eines High-Fidelity-DNA-Polymerase-System wird auch vorgeschlagen, um die Einführung eines zu vermeideny PCR-Fehler. Die Länge und Zusammensetzung der HA des Subklonierung Plasmid kritischer ist relativ zu der Einschubkassette (Daten nicht gezeigt). Für besonders empfindliche Anwendungen wie Bau von Knockin-Vektoren, in denen alle Mutationen in Exon Regionen werden nicht toleriert, kann der HA des Insertionskassette gekürzt werden (50 bis 120 bp) Probleme mit langen Oligos assoziiert zu vermeiden. Insertionskassette können unmodifiziert oder dual phosphorthioiertes (wenn die anhand der Richtung der Replikation nicht verfügbar ist) gelassen werden. Aber Multiplexen in diesen Fällen immer noch erfordert lange geschützt HA Subklonierung Plasmide. Eine Einschränkung dieser besonderen Strategie ist die Senkung der Multiplexing Effizienz, die möglicherweise Auswirkungen kann SPI Klonen an verschiedenen Loci. Die Länge der Insertionskassette und dem Subklonieren Plasmid ist ein weiterer wichtiger Parameter bei der SPI Klonen. Größere DNA-Moleküle zu elektroporieren weniger wirksam, und die Wirkung ist kumulativ, da die Wiederquirement alle Kassetten in der gleichen Zelle einzuführen (Daten nicht gezeigt). Multiplexing ist am effizientesten mit kleineren Einschubkassetten. DNA-Fragmente größer als 3 kb stellen auch eine Grenze für Red vermittelte ssDNA Verarbeitung, die effizienteste bis zu 3 kb 30 ist. Eingefügt Kassetten mehr als 3 kb sind Dual reseziert und weniger effizient rekombinieren über eine Beta-unabhängigen Weg 20. Daher wird Screening von Kolonien ausreichen, um die korrekte Klon identifiziert in diesen Fällen wichtig. Eine längere Dauer der Rekombination nach der Elektroporation erhöht auch die Chancen für eine Erholung der richtige Klon in schwierigen SPI Übungen. Bis zu vier kleine Kassetten (&lt;1,5 kb) können gleichzeitig mit dem SPI-Prozess eingeführt werden, wenn die Multiplexeffizienz mit jedem zusätzlichen Kassette verringert (Daten nicht gezeigt). Jedoch spiegelt dies das Ergebnis einer optimalen SPI Experiment und sinnvoll, die Grenzwerte des Multiplexens beachten, wenn viele große Kassetten ist. </p&gt; Die Entwicklung von Genom-Editing-Tools wie Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -cas9 Endonuklease-System hat die Schaffung neuer Genom-Modifikationen aktiviert werden und hat zu einer effizienteren Genomtechnik 36 geführt. Jedoch haben diese neueren Technologien Gen-Targeting-Vektoren ergänzt, anstatt sie verdrängt. Es ist vorgesehen, dass die CRISPR-cas System könnte Antibiotika-Selektion zu ersetzen und zu verfeinern die Multiplex-Rekombination Protokoll.

Die Entwicklung von Gen-Targeting-Technologien, hat den Bau von Zelllinien und Maus-Modellen ermöglicht, verschiedene biologische Systeme 1-3 zu untersuchen. Ein Schlüssel der ersten Stufe in der Modifikation einer genomischen Sequenz ist die Gestaltung und Konstruktion eines Gen-Targeting-Vektor 4. Targeting-Vektoren sind Plasmidkonstrukte, die das Allel von Interesse, die die gewünschten Modifikationen (n) durch einen Selektionsmarker (beispielsweise Neomycin) flankiert tragen und langen genomischen Regionen für effiziente homologe Rekombination in Säugerzellen 5 erforderlich. Präzise Genveränderung durch Einbringen des Targeting-Vektors in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) 6 oder somatischen Zellen 7, dadurch gelöst, dass eine homologe Rekombination zwischen identischen Abschnitte der DNA-Sequenz auf dem Zielvektor und den genomischen Locus resultiert in der Übertragung von der beabsichtigten Modifikation um das Genom durch Genkonversion 8. Solche modified ES-Zellen können in der Maus Blastozysten injiziert werden, um Nachkommen (Chimären) herstellen, die dann übertragen können diese modifizierten Allele über die Keimbahn 9. Ein alternativer Weg, um transgene Mäuse zu erzeugen beinhaltet die Mikroinjektion eines Genexpressionsvektor in einzelligen Maus Zygoten, die der zufälligen Integration des Vektors in das Genom der Maus 10 führt. Traditionelle Methoden der Vektorkonstruktion wurden auf herkömmliche verlassen &#39;cut and paste&#39; Klonen Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligasen, um die verschiedenen Selektionsmarker und genomische Fragmente in einen Vektor-Rückgrat zu klonen. Jedoch ist eine inhärente Begrenzungsfaktor herkömmlicher Klonen die Positionierung und die Wahl der Restriktionsstellen, vor allem bei längeren DNA-Sequenzen. Dies erfordert häufig mehrere Subklonierungsschritte und führt auch fremde DNA-Sequenzen in den Vektor, die oft zu einer geringeren Effizienz des Gen-Targeting. Recombineering (rekombinogenen gerineering) ist ein DNA-Engineering-Technologie, die diese Einschränkungen überwunden durch die Verwendung der homologen Rekombination (HR) durch Phagen Rekombination Proteine ​​in E. vermittelte coli-Zellen 11,12. Da jede Region eine homologe Sequenz kann als Substrat Rekombination dienen, werden die Beschränkungen der Verfügbarkeit von Restriktionsstellen entfernt wurde. Große DNA-Sequenzen können nahtlos direkt in vivo modifiziert werden, so auch ihre strukturelle Integrität bewahren 13. Recombineering ist sehr effizient mit kurzen Homologien (50 bp) 14 und damit Homologiearme (HA) können bequem in synthetische Oligo-Sequenzen integriert werden. In einem typischen Experiment Rekombinationstechnologie, einem Oligo oder einem Doppelstrang-DNA (dsDNA) Fragment, HA in Rekombinationstechnologie kompetente E. elektroporiert coli-Zellen, welche die Ziel entweder auf dem Chromosom oder auf einem Plasmid 15 angeordnet. Die Rekombination Potential wird durch induzierbare Expression des Red rec tragenenombination Proteine ​​der Phagen 16,17 bzw. die RecET Proteine ​​der rac Prophagen 18. Die Rot / RecE Exonuklease wandelt lineare dsDNA zu einer Einzelstrang-DNA (ssDNA) Zwischen, die dann von ihrem Partner, Rot / RecT, eine einzelsträngige Glühen Protein (SSAP) 19 gebunden. Das Tempern eines langen ssDNA oder eine kurze Oligo an seinen komplementären Zielsequenz auf der Folgestrang der Replikationsgabel und führt zum Einbau der Sequenz an der Targetstelle. Verzögerungsstrang ssDNA Rekombination ist die Grundlage für die hohe Effizienz der Rekombination und können durch die &quot;Beta&quot; Rekombinationsmodell 20,21 beschrieben. Ein typischer Workflow Rekombination zum Aufbau einer Gen-Targeting-Vektor umfasst eine der beiden folgenden Strecken. Ein Weg beinhaltet Subklonieren der gewünschten genomischen Region von einem Maus-BAC-Klons in ein Plasmid, gefolgt von dem sequentiellen Einführen LoxP Rekombinationsstelle, einen Selektionsmarker <sbis&gt; 22 etc. oder die alternative Route beinhaltet gezielt den BAC genomischen Locus mit den verschiedenen Zielvektorelemente durch mehrere Runden von Rekombination 10,23 und Subklonierung des modifizierten Locus in ein Plasmid durch Lücke Reparatur Klonen 24,25. Variationen zu diesem Thema wurden in verschiedenen High-Throughput-Rekombination Rohrleitungen im Rahmen der großen Maus Produktionsprogramme 26,27 verwendet. Diese Verfahren umfassen jedoch komplizierte und langwierige Stufen erfordern die Verwendung von speziellen Vektoren und E. coli-Stämmen (zB Cre-exprimierenden Zellen) und nutzen die eine oder mehrere Zwischenschritte der Vektor DNA Aufreinigung und Rücktransformation (Tabelle 1). Subklonierung und Einfügen (SPI) ist eine neue Technik, die Beta-Rekombination Rekombination und Reparatur Lücke Klonierung in einem einzigen Prozess (Abbildung 1) verbindet. SPI Vektor Montage ist einfach, schnell und flexibel und bietet deutliche Verbesserung gegenüber Standard recombiEngineering nähert (Tabelle 1). Hier zeigen wir, wie einfach und Nutzen des Einsatzes von SPI für verschiedene Vektorkonstruktion Anwendungen mit besonderem Schwerpunkt auf den Aufbau Nicht-Standard-und herausfordernde Vektor-Designs. Testfälle enthalten den Bau eines fluoreszierenden Reporter Knockin Vektor, eine doppelte Fotos mit Namensproteinexpression Knockin Vektor, ein BAC fluoreszierenden Reportervektor und eine Knockout-Vektor. Verschiedentlich die Forderung, einen Zelloberflächenrezeptor zu lokalisieren, zu reinigen, eine Kernproteinkomplex Diese untersucht oder bedingt abzutragen die Expression eines Gens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:941px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:315px;">Antibiotics except Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">Ampicillin, A9518-5G; 
			Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; 
			Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Invivogen:&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ant-zn-1</td>
			<td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">C57BL/6 BAC clones</td>
			<td style="width:127px;">CHORI: https://bacpac.chori.org/&#160;</td>
			<td style="width:216px;">RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td>
			<td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">KOD hotstart DNA polymerase system</td>
			<td style="width:127px;">Millipore: https://www.merckmillipore.com</td>
			<td style="width:216px;">71086-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:315px;">Long oligos</td>
			<td style="width:127px;">IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td>
			<td style="width:216px;">IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td>
			<td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">MinElute PCR purification kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">28004</td>
			<td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">QIAPrep Spin Mini Prep kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">27104</td>
			<td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:127px;">NEB: https://www.neb.com</td>
			<td style="width:216px;">DpnI: R0176L</td>
			<td>See NEB website for a list of RE.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

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Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.3K Aufrufe.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Serie: Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Forschung

Biologie

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Eine neue Methode für die Kultur und polarisierte Stimulation der menschlichen Darmschleimhaut Explantate

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...