Dies ist ein detailliertes Protokoll zur Zusammenstellung von Multi-Gen-Plasmiden mit dem Yeast MoClo Kit. Diese Methode ermöglicht das bequeme Klonen einer Vielzahl von Multigen-Klassenkameraden. Es ist ideal für die Erzeugung einer großen Bibliothek von verwandten Teilen.
Beginnen Sie mit dem Einrichten des Golden Gate-Reaktionsmixes. Fügen Sie 20 Femtomole jedes PCR-Produkts und den Eintragsvektor, einen Mikroliter 10X T4 Ligase Puffer, 0,5 Mikroliter Esp3I und 0,5 Mikroliter T4 Ligase hinzu. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Mikroliter zu bringen.
Führen Sie dann die Klonreaktion aus. Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix durch Hitzeschock in den DH5-Alphastamm oder gleichwertige escherichia coli chemisch kompetente Zellen. Verteilen Sie die Zellen auf einer lb Platte mit 35 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol.
Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach 16 bis 18 Stunden nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie bei vier Grad Celsius für etwa fünf Stunden, um das superfolder grüne fluoreszierende Protein oder sfGFP für eine intensivere grüne Farbe entwickeln zu lassen. Um die Platte zu abschirmen, legen Sie sie auf einen ultravioletten oder blauen Lichttransilluminator.
Die sfGFP enthält Kolonien wird unter dem UV-Licht fluoreszieren. Die grünen Kolonien sind negativ, weil sie das ungeschnittene Teilplasmid enthalten. Die weißen Kolonien sind wahrscheinlich positiv.
Das Klonen ist erfolgreich, wenn es 30 bis 100% weiße Kolonien gibt. Montieren Sie einen Zwischenvektor mit dem linken Verbinder, dem sfGFP-Aussetzer, dem rechten Stecker, einem Hefeauswahlmarker, einem Hefeursprung der Replikation und dem Teilplasmid mit einem mRFP1, einem E.coli-Ursprung und dem Ampicillin-resistenten Gen. Führen Sie die Klonreaktion aus, wie im Textmanuskript beschrieben.
Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix in den DH5-Alpha-Stamm und verteilen Sie dann die Zellen auf einer lb-Platte mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Carbenicillin oder Ampicillin. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach 16 bis 18 Stunden die Platte aus dem Brutkasten nehmen.
Die Platte wird sowohl blassrote als auch hellgrüne Kolonien enthalten. Halten Sie es bei vier Grad Celsius für etwa fünf Stunden, um die mRFP1 und sfGFP reifen zu lassen. Verwenden Sie einen UV- oder Blaulichttransilluminator, um die grünen Kolonien zu identifizieren, die den potenziell korrekten Zwischenvektor enthalten.
Streifen Sie die grünen Kolonien auf einer lb Carbenicillin Platte und inkubieren bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag, streifen Sie sie wieder auf einer Chloramphenicol-Platte und inkubieren bei 37 Grad Celsius über Nacht. Die Kolonien, die auf Chloramphenicolplatten wachsen, enthalten falsch zusammengesetzte Plasmide.
Nachdem der Zwischenvektor erfolgreich montiert wurde, fahren Sie mit der Montage der Transkriptionseinheiten fort. Diese vierteilige Baugruppe enthält den Zwischenvektor, einen Promotor, ein CDS und einen Determinator. Reinigen Sie die Plasmide, erfassen Sie ihre Konzentrationen und verdünnen Sie jedes Plasmid auf 20 Femtomole DNA pro Mikroliter.
Nach der Durchführung der Klonreaktion, transformieren Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in die DH5 alpha oder gleichwertige E.coli-fähige Zellen und verplatten sie auf LBN-Carbenicillin. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach 16 bis 18 Stunden die Platte aus dem Brutkasten nehmen und bei vier Grad Celsius für etwa fünf Stunden aufbewahren, um die sfGFP reifen zu lassen.
Verwenden Sie einen UV- oder einen Blaulichttransilluminator, um die nicht fluoreszierenden weißen Kolonien zu identifizieren, die die potenziell korrekten Transkriptionseinheiten enthalten. Stellen Sie einen Zwischenvektor für die Multigenplasmide zusammen, wie im Textmanuskript beschrieben. Dann transformieren Sie den gesamten Klonreaktionsmix in DH5-Alphazellen und verzieren Sie sie mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin auf lb.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Führen Sie rote und grüne farbbasierte Screening, dann Streifen und wachsen die grünen Kolonien auf einer lb Kanamycin-Platte auf Fehlbaugruppen zu überprüfen, wie zuvor gezeigt. Als nächstes montieren Sie das Multi-Gen-Plasmid, indem Sie eine Klonreaktion einrichten, wie im Textmanuskript beschrieben.
Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in DH5-Alpha-Zellen und platten Sie sie auf lb Kanamycin. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Führen Sie dann das Grün-Weiß-Screening wie zuvor beschrieben durch.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um ein integratives Multi-Gen-Plasmid zu konstruieren, um den ADE2-Lokus zu stören. Vier reproduzierte und ein integratives Multigenplasmide wurden zusammengesetzt. Das Verhältnis der potenziell korrekten Kolonien für das Intermediär-Vektorklonen betrug 1,83%Sobald das Zwischenplasmid geklont wurde, betrug die Erfolgsrate der Zusammenstellung von Multigenplasmiden aus dem Zwischenprodukt 93,77%Die vernachlässigbare Anzahl positiver weißer Kolonien zeigt eine suboptimale Zusammensetzung von Multigenplasmiden.
Nach der Umwandlung in Hefe wuchsen die Kolonien, die Beta-Carotin und Lycopin produzierten, am dritten Tag. Vier Kolonien von jedem Teller wurden auf frische Teller gestreift und für zwei weitere Tage angebaut. Die Carotinoide wurden durch UV-Vis-Spektrophotometrie extrahiert und quantifiziert.
BTS1/ERG20 führt allein mit ERG20 zu einer 35-fach höheren Beta-Carotin-Produktion. Ebenso ist die Produktion von Lycopin mit BTS1/ERG20 etwa 16,5-fach höher als bei ERG20 allein. Das multigene integrative Plasmid wurde zur Störung des ADE2-Lokus verwendet, entweder mit einer gRNA und ohne Helfer-DNA oder mit gRNA und einem multigenintegrativen Plasmid als Helfer-DNA.
Nach drei bis vier Tagen wurden rote Kolonien auf der YPD-Platte mit Nourseothricin beobachtet, was darauf hindeutet, dass ADE2 erfolgreich gestört wurde. Beim Versuch dieser Methode ist das Wichtigste, sich daran zu erinnern, die DNA-Konzentrationen genau zu messen und Pipette sorgfältig zu messen, während dieser Reaktionsmix eingerichtet wird. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Hefe Metabolic Engineering, eine große Anzahl von Genen und Promotern für maximale Produktausbeute zu vermessen.
