Das bakterielle CRISPR-Cas9-System hat die experimentellen Möglichkeiten für Life-Wissenschaftler erheblich erhöht. Mehrere CRISPR-Ansätze hängen jedoch von der gleichzeitigen Abgabe mehrerer Führungs-RNAs in einzelne Zellen ab. Das GRNA-Klonen der String-Baugruppe ermöglicht die einfache und schnelle Generierung von Multiplex-gRNA-Expressionsvektoren in einem einzigen Klonschritt.
Aber STAgR ist nicht nur einfach, es ist auch effizient, billig und einfach anzupassen. Um zu beginnen, fügen Sie die N20 gRNA Sequenzen zu den vorwärts ampliflifikationsprimern für STAgR DNA String als Überhänge. Fügen Sie sense gRNA-Sequenzen fünf Prime zur Vorwärtsgrundierung, Gerüst-Vorwärtsgrundierung, für ein herkömmliches Gerüst oder zu SAM-Vorwärtsgrundierung für ein MS2-haltiges Gerüst hinzu.
Als Nächstes fügen Sie die umgekehrte Komplement N20 gRNA Sequenzen zu den Reverse Primer-Sequenzen hinzu, indem Sie RP-Primer auswählen, abhängig von den verwendeten Promotoren und Strings. Um mit der Erzeugung der einzelnen Klonfragmente für Gibson Assembly zu beginnen, übertragen Sie 10 Mikroliter des Hochtreuepuffers in ein Rohr. Fügen Sie einen Mikroliter von 10 millimolaren dNTPs und 0,25 Mikroliter der beiden 100 mikromolaren Überhanggrundierungen hinzu.
Fügen Sie 10 Nanogramm der DNA-Vorlagenzeichenfolge oder des Vektors und 1,5 Mikroliter DMSO hinzu. Fügen Sie genügend Wasser hinzu, um das endige Volumen auf 49,5 Mikroliter zu bringen, und fügen Sie dann 0,5 Mikroliter HF-Polymerase hinzu. Inkubieren Sie die Reaktionen auf einem Thermocycler, wie im Textprotokoll beschrieben.
Danach nehmen Sie einen 5,5 Mikroliter Aliquot aus der PCR-Reaktion. Fügen Sie allen Aliquots Ladefarbstoff hinzu und laden Sie ihn auf ein 1%Agarose-Gel. Laden Sie eine geeignete DNA-Leiter für die Dimensionierung, und führen Sie das Gel in einem geeigneten Gel-Laufpuffer bei 120 Volt für 30 Minuten.
Während das Gel läuft, fügen Sie fünf Mikroliter des Puffers hinzu, der mit dem Restriktionsenzym bereitgestellt wird, und 0,5 Mikroliter DpnI zu den verbleibenden 44,5 Mikrolitern Vektor-PCR-Reaktion, um Restplasmid-Vorlage zu entfernen, die während der PCR verwendet wird. 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Amplicons die richtige Größe haben.
Um mit der DNA-Reinigung zu beginnen, fügen Sie 1,8 Mikroliter Magnetperlen pro einem Mikroliter PCR-Produkt hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten. Bei Raumtemperatur zwei Minuten inkubieren. Mit einem Magneten trennen Sie die Perlen in DNA-Fragmenten von der Restflüssigkeit.
Spülen Sie das Pellet mit 70% Ethanol, ohne es vollständig wieder aufzuhängen, um die Perlen zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche ein weiteres Mal. Mit einer Pipette das gesamte Ethanol entfernen und die Pelletluft trocknen lassen.
Dann fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter Wasser, und Pipette nach oben und unten, um zu mischen und lösen Sie das Pellet. Verwenden Sie einen Magneten, um die Perlen von der Flüssigkeit zu trennen. Übertragen Sie den klaren Überstand auf eine neue Röhre.
Verwenden Sie anschließend ein Spektralphotometer, um die DNA-Konzentrationen zu bestimmen. Bereiten Sie zunächst den 5x isothermalen Reaktionspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Kombinieren Sie für den Gibson Assembly Master Mix 320 Mikroliter des 5x isothermen Reaktionspuffers mit 697 Mikroliter Wasser.
Fügen Sie 3 Mikroliter T5 Exonuklease, 20 Mikroliter DNA-Polymerase und 160 Mciroliter Taq DNA-Ligase hinzu. 7,5 Mikroliter des Assembly Master Mix in ein frisches Rohr geben. Fügen Sie dann 2,5 Mikroliter Insert in Vektor hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben.
Inkubieren Sie die Proben bei 50 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten. Danach Proben auf Eis oder bei 20 Grad Celsius für die nachfolgende Transformation lagern. Wenn Sie bereit sind, die Bakterien zu transformieren, tauen Sie chemisch kompetente TOP10 E.Coli-Bakterien auf Eis auf.
Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter des Gibson Mix zu 50 Mikrolitern kompetenter Bakterien hinzu und mischen Sie, indem Sie sanft den Boden des Rohres streichen. 30 Minuten auf Eis bebrüten. Legen Sie das Rohr 45 Sekunden lang in ein 42 Grad Celsius Wasserbad oder einen Wärmeblock, um die Bakterien zu erhitzen.
Dann legen Sie die Rohre wieder auf Eis. Fügen Sie den Bakterien 250 Mikroliter SOC-Medium hinzu und lassen Sie sie sich 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Schüttel-Inkubator erholen. Nachdem sich die Bakterien erholt haben, platten Sie sie auf 1,5%LB Agar-Platten, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthalten.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius über Nacht. Bereiten Sie zunächst mindestens zwei Sätze von 200 Mikroliter-PCR-Reaktionsröhren für jedes Konstrukt vor. Füllen Sie einen der Sätze von Reaktionsröhren mit 100 Mikroliter LB Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält.
Mit einer sterilen Pipettenspitze das biologische Material aus einer Bakterienkolonie abkratzen und an der Unterseite eines leeren 200-Mikroliter-PCR-Reaktionsrohrs verteilen. Übertragen Sie die Pipettenspitze sofort auf das zweite entsprechende Reaktionsrohr, das LB-Medium enthält. Wirbeln Sie die Spitze herum, um sicherzustellen, dass einige der Bakterien auf die LB-Medien übertragen werden.
Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für den späteren Gebrauch. Bereiten Sie dann 10 Mikroliter PCR Master Mix pro Reaktionsröhre vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie 10 Mikroliter des PCR Master Mix zu den beschrifteten PCR-Reaktionsröhren hinzu, ohne das LB-Medium.
Mit einem Thermocycler die Reaktionen, wie im Textprotokoll beschrieben, inkubieren. Danach fügen Sie den verstärkten Fragmenten Ladefarbstoff hinzu und laden Sie sie auf ein 1%Agarose-Gel. Laden Sie eine geeignete DNA-Leiter für die Dimensionierung, und führen Sie das Gel in einem geeigneten Gel-Laufpuffer bei 120 Volt für 30 Minuten.
Berechnen Sie die theoretische Größe des Amplicons, indem Sie die einzelnen Größen der verwendeten Promotoren, gRNA-Gerüste und die Anzahl der N20-Sequenzen addieren. Identifizieren Sie anhand der Ergebnisse der Kolonie PCR die bakteriellen Klone, basierend auf der richtigen Bandgröße und ob sie wahrscheinlich korrekte Vektoren aufweisen. Mit der entsprechenden 100-Mikroliter-Kultur impfen Sie eine 2,5-Milliliter-LB-Kultur über Nacht, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält.
12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie dann ein kommerzielles Plasmid-Mini-Kit, um die Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Bei diesem Verfahren wird das String-Assembly-gRNA-Klonen verwendet, um schnell gRNA-Expressionsplasmide zu erzeugen.
Ein typisches Ergebnis der PCRs, die verwendet werden, um die STAgR-Stücke zu erhalten, ist hier zu sehen. Die sechs Amplicons stellen lineare DNA-Stücke dar, die jeweils die einzelnen gRNA N20-Sequenzen an ihren Enden enthalten. Das Plasmid-Backbone wird mit den Targeting-Sequenzen von gRNA1 und gRNA6 erweitert und verfügt daher über die erforderlichen Überlappungen zu zwei anderen PCRs für Gibson Assembly.
Nach der Reinigung kann eine DNA-Ausbeute von mindestens einem Mikrogramm für Vektoren und Inserts erreicht werden. Nach der Gibson Assembly führt die bakterielle Transformation zu 100 bis 700 Bakterienkolonien. Repräsentative Analysen von 22 Bakterienkolonien über Kolonie PCR nach einem STAgR-Protokoll mit sechs gRNA-Kassetten zeigen, dass sieben Klone die erwartete Amplikongröße für die Vollmontage aufweisen.
Die anderen Klone erhielten wahrscheinlich STAgR-Vektoren, die ein bis fünf gRNA-Kassetten enthielten, während ein Klon vollständig leer ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden. Richtig durchgeführt, ermöglicht es die Erzeugung einer Vielzahl von Multiplex-gRNA-Expressionsvektoren in weniger als einer Arbeitswoche.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, auf die richtige Zuweisung und Kombination von N20-Überhanggrundierungen zu achten. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre eigenen Multiplex-Führungs-RNA-Expressionsvektoren erstellen können.
