These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Ethics Statement: De identifizierten menschlichen Gewebe- und Plasmaproben wurden von Hendrick Medical Center unter einem Institutional Review Board erhalten genehmigten Protokoll. 1. Die Zugabe von biotinylierten Antikörpers HINWEIS: Die Überwachung dieser Schritt ist optional. Siehe alternative Protokoll, wenn keine Überwachung. <ol><li> Besorgen Sie handelsübliche Avidin-Derivat beschichteten Platten (siehe Materialien und Geräte Tabelle). </li><li> Dann werden 50 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,2 in die Vertiefungen. HINWEIS: vorinkubieren PBS bei 28 ° C temperaturabhängige Resonanzverschiebungen zu minimieren. </li><li> Öffnen Bioassay-Scanner-Software und folgen Sie den Setup-Assistenten, um das experimentelle Verfahren, die Auswahl von Leer-, Standard- und Proben im Plattenlayout Temperatureinstellung (28 ° C), die Anzahl der Scans pro min umfasst definieren (1), und die Dauer des Experiments ( 150 min, für präparative Schritte unterzubringen). </li&gt; <li> Legen Sie die Testplatte vorbereitet in das Etikett frei Bioassay-Scanner und starten Sie den ersten Scan. Wenn der erste Scan abgeschlossen ist, wählen Sie &quot;Selbst Bezug auf starten&quot;. Die Grundlinie ist die erste Reihe von Abtastungen zu Beginn des Experiments gesammelt. Wenn dies das erste Lese zu diesem speziellen Platte durchgeführt, damit der Scanner ausführen zu temperieren und zu beseitigen Drift der Basislinie. Abbildung 2 zeigt einen Screenshot einer Baseline, gefolgt von Probenzugabe. </li><li> Nachdem die Grundlinie stabilisiert hat oder zumindest 5-Scans, halten Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> Entfernen PBS durch das Einbringen in die Spüle und fügen Sie 50 ul RL21A biotinyliertem Antikörper an [10 ug / ml in PBS pH 7,2], um alle außer Kontrolle Vertiefungen auf der Platte. Dann werden 50 &amp; mgr; l PBS zu den Kontrollvertiefungen. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, bis eine Sättigung erreicht ist, etwa 1,5 Stunden. </li><li> Unterbrechen Sie die Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> Waschen Sie die<html> Platte 3-mal mit 200 ul / Vertiefung phosphatgepufferter Kochsalzlösung + 0,05% Tween 20 (PBST) gewaschen, gefolgt von 3 Spülungen mit 200 ul / Vertiefung PBS, pH 7,2. Wiederholen Sie mit PBS. Tippen Sie überschüssiges PBS von Platte auf Küchenpapier vor dem Umzug mit dem nächsten Schritt. HINWEIS: Dieser Schritt kann auf einem automatischen Plattenwäscher durchgeführt oder waschen Sie die Platte 3-mal mit 200 ul PBST durch das Einbringen von Flüssigkeit in einem Waschbecken und ersetzen PBST mit einer Pipette werden. </li><li> In 50 ul PBS pH-Wert 7,2 an alle aktiven Brunnen. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, um nach dem Waschen Resonanz zu überwachen. </li><li> Stoppen Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. </li></ol> Alternatives Protokoll für Schritt 1: <ol start="13"><li> In 50 ul RL21A biotinyliertem Antikörper an [10 ug / ml PBS] in alle Vertiefungen. </li><li> Inkubiere bei Raumtemperatur für 1,5 h oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> 3-mal waschen Sie die Platte mit 200 ul / von 3 Spülungen mit 200 ul / Vertiefung PBS gut PBST, gefolgt wie in Schritt 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Die Zugabe von Analyt <ol><li> Entfernen Sie die PBS und 50 ul pro Vertiefung geeigneter Assay-Puffer. Für diesen Test wurde kommerziell erhältlichen normalen menschlichen Serum 1:20 verdünnt in PBS. </li><li> Öffnen Bioassay-Scanner-Software und folgen Sie den Setup-Assistenten, um experimentelle Verfahren zu definieren. </li><li> Legen Sie die Platte in den Bioassay-Scanner und beginnen eine Baseline zu lesen. Wenn dies das erste Lese zu diesem speziellen Platte durchgeführt, lassen Sie den Scanner laufen zu temperieren und zu beseitigen Drift der Basislinie. </li><li> Nachdem die Grundlinie stabilisiert hat oder zumindest 5-Scans, halten Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> Entfernen Sie die Testpuffer aus den Vertiefungen. </li><li> Spike Steuerungen mit HLA A * 02: 01 tragendes Monomer relevant (FLSL) oder irrelevante (SLLV, YLEV oder KVL) Peptide bei Konzentrationen von [0,625 bis 10 &amp; mgr; g / ml] in Assay-Puffer. Dann werden 50 ul des Standards in den Kontrollvertiefungen der Platte </li><li> Dann werden 50 ul des Analyten in Testpuffer auf die ProbeVertiefungen der Platte. Für diesen Assay versetzt kommerziell verfügbaren Humanserum verwendet wurde. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, bis eine Sättigung erreicht ist, etwa 30 bis 60 min. </li><li> Unterbrechen Sie die Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> 3-mal waschen Sie die Platte mit 200 ul / von 3 Spülungen mit 200 ul / Vertiefung PBS gut PBST, gefolgt wie in Schritt 1.9. </li><li> In 50 ul Testpuffer auf allen aktiven Brunnen. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, um nach dem Waschen Resonanz zu überwachen. </li><li> Stoppen Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. HINWEIS: Der Assaypuffer konnte PBS, Zellkulturmedium oder Humanserum je nach Ziel des Assays in PBS 1:20 verdünnt werden. </li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Analysieren Sie mit Hilfe der Bioassay-Scanner-Software oder Exportrohdatendateien auf bevorzugte statistische Analyse-Software. Der Bioassay-Scanner-Software generiert automatisch die Bindungskurve, die auf diePlattenlayout im Versuchsaufbau zur Verfügung gestellt. HINWEIS: Falls nicht mit dem Bioassay-Scanner-Software für die Analyse, die Schritte 3,2-3,4. </li><li> Subtrahieren Sie die Grundlinie und Negativkontrolle von jeder weiteren Datenpunkt. </li><li> Berechnen Sie den Mittelwert und Standardabweichung für replizieren Brunnen zu jedem Zeitpunkt. </li><li> Generieren Sie ein Diagramm der Bindungskurve oder wählen Endpunktdaten für Balkendiagramme. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Die Autoren, Debra Wawro Weidanz und Robert Magnusson, jeweils Chief Executive Officer und Chief Technology Officer bei Resonanzsensoren Incorporated, die die Bioassay-Platten-Lesegerät und Testplatten in diesem Artikel verwendet produziert.

Das hier beschriebene Verfahren stellt einen Biomarker Screeningsystem für die Krebsdiagnostik, die schnelle Erkennung von löslichen Peptid / HLA-Komplexe in Patientenserum, Plasma, Urin oder Speichel-Proben in einem Hochdurch ermöglichen würde 96- oder 384-Well-Format. Dieses Testsystem unter Verwendung von T-Zell-Rezeptors nachahmt monoklonalen Antikörper und eine markierungsfreie Detektionssystems schneidet die Analysezeit auf weniger als 1 h im Vergleich zu 3,5 Stunden nach herkömmlichen ELISA. Dieses Hochdurchsatz-Ansatz ermöglicht die schnelle Stratifizierung von Patienten mit klinischen Studien für therapeutische Krebsimpfstoffe oder Biopharmazeutika. Derzeitige Verfahren zum Nachweis dieser Krankheitsziele erforderlich Affinitätsreinigung und HPLC-MS / MS individueller Patientenproben, eine mühsame und zeitraubender Prozess. Obwohl dieses Verfahren zugänglich zu herkömmlichen ELISA-Verfahren, gibt es Bedenken, dass sekundäre Nachweisreagenzien wie die anti-β2-Mikroglobulin-Antikörper konnte die Struktur des naszierenden HL verändernEin Molekül, und die Bindung an die TCRM Begrenzungserkennung. Markierungsfreie Detektion lindert diese Bedenken. Dieses Verfahren könnte für die Verwendung auf anderen markierungsfreie Systeme wie ein Oberflächenplasmonresonanz-System modifiziert werden. Dies wäre jedoch erheblich die höhere Durchsatzkapazitäten im Vergleich zum Bioassay-System in dieser Studie verwendet reduzieren. Dieses Protokoll kann wirksam zum Nachweis von Nicht-HLA-Biomarkern in Patientenserum und Plasma bei Einhaltung einigen kritischen Schritte modifiziert werden. Überwachung der anfänglichen Antikörper-Beschichtungsverfahren ist für die Optimierung der Oberfläche zu empfehlen, da eine &lt;200 pm Verschiebung wird wahrscheinlich bei niedrigen Signal für die nachfolgenden Detektionsschritt führen. Der Studienbeginn und nach dem Waschen liest sind für die Endpunktanalyse als die Fülle von Serumproteinen kann die Bindung von geringer Konzentration Analyt maskieren. Schließlich können Temperaturschwankungen von Proben in Brunnen zu Brunnen Variation führen. Es wird empfohlen, alle Proben vorinkubiert eind das Etikett frei biosassay Einheit Temperaturregler auf 2-3 ° C über der Raumtemperatur eingestellt werden. Gekühlte Proben müssen genügend Zeit, um die Betriebstemperatur zu erreichen gestattet. Zukünftige Modifikationen dieses Protokolls umfassen Multiplexen TCRM auf der Plattenoberfläche. Das Bioassay-System ist derzeit zugänglich Spek von Vertiefungen in einer Dichte von mindestens 8-plex. Durch die Einführung von 4-8 TCRM in jede Vertiefung, pro Testprobenvolumen reduziert werden und ermöglichen die Erfassung von immer komplexer Daten pro Patient. Diese Fähigkeit könnte weiter Patienten informieren im Hinblick auf Therapiemöglichkeiten.

Die Klasse-I-Human-Leukozyten-Antigen (HLA) Proben Peptide von 8-11 Aminosäuren in der Länge von der proteasomalen Abbau des intrazellulären Proteins Repertoires abgeleitet und stellt diese Peptide auf der Oberfläche jeder kernhaltigen Zelle 1,2. Der HLA-Komplex ist &quot;Natur Biomarker&quot;, was den Zustand jeder Zelle (1) zum umlaufenden zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL). Die Anerkennung der Krankheit assoziierten Peptiden ergibt Beseitigung des betreffenden Zelle durch CTL. Daher ist die adaptive Immunantwort sehr wirksam zur Beseitigung von viralen Infektionen und Tumoren. Allerdings übt das Immunsystem Druck, der oft fördert Auswahl auf Viren oder Tumor der Lage Umgehung eine effektive CTL-Antwort. T-Zell-Rezeptor nachahmen (TCRM) monoklonale Antikörper (mAbs), die spezifische Peptid / HLA-A * 02 zu erkennen: 01-Komplexe, wie die von Brustkrebs-assoziierten Proteinen, Makrophagenmigration-Hemmfaktor, abgeleitet (MIF19-27) 3 und NY-ESO-1, 157-165, ermöglichen Detektion und Zerstörung von Brustkrebs-Zellen in Abwesenheit einer wirksamen Antitumor-CTL-Reaktion 4,5. Diese repräsentative Arbeiten an HLA-A * 0201-Molekül, das durch bis zu 30% der Population exprimiert wird, konzentriert. Die Identifizierung von anderen relevanten HLA / Peptid-Komplexe, gefolgt von der Herstellung von TCRM ermöglicht jedoch die Entwicklung gezielter Immuntherapien und Begleiterkrankungen Diagnostik, erweitern den Nutzen dieser Arbeit zu einem viel breiteren Bevölkerung. Ein Teil des Peptid / HLA-Komplexen zur Zelloberfläche gebunden ist, in das Plasma freigesetzt. Aufgrund der hohen Komplexität von Peptid / HLA-Pools, aktuelle Methoden für den Bergbau die immunopeptidome für HLA verbundenen Biomarker sind zeitaufwendig. Dieses Verfahren erfordert die Affinitätsreinigung von löslichem HLA aus Plasma, Abscheidung von HLA assoziierten Peptiden durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie(RP-HPLC) und Peptidsequenzierung durch Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) 6,7. Obwohl dieses Verfahren eine praktikable Option für die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele, es ist ein schwerfälliger Prozess als Begleiter Diagnose-Tool für HLA damit verbundenen Ziele bereits in der therapeutischen Impfstoff oder biopharmazeutische Pipeline 8-10. TCRM gerichtet gegen diese Ziele stellen die Werkzeuge für die schnelle Entwicklung eines diagnostischen Begleit bei Stratifizierung Patienten in relevanten klinischen Studien und bieten fundierte Therapiemöglichkeiten abzielen. In dieser Arbeit wird ein Durchbruch Biomarker-Screening-System für die Krebsdiagnostik vorgestellt, TCRM und eine markierungsfreie Bioassay-System, das den biologischen Wechselwirkungen mit minimalen Verarbeitungsschritte überwacht nutzt. Die markierungsfreie Bioassay-System basiert auf einem Verfahren, das die Geführte-Mode-Resonanz- (GMR-) Effekt, der in der dielektrischen Wellenleitergitter 11-14 auftritt nutzt basiert. Bei Breitbandlicht Kontakte die diffraktiveGitter in der für dieses System erforderlichen Platten werden zwei bestimmte Wellenlängen reflektiert. Die Bindungswechselwirkung zwischen einem immobilisierten Rezeptor und seinem Liganden wird in Echtzeit durch Verfolgung der Resonanzwellenlängenverschiebung mit einem Spektrumanalysator 12 überwacht. Separate Resonanzspitzen auftreten, für einfallendes TE (elektrische Vektor senkrecht zur Einfallsebene) und TM (Magnetvektor normal zur Einfallsebene) Polarisationszustände Bereitstellen mehrerer Datenpunkte, die möglicherweise erhöhen Erfassungsgenauigkeit 11,14. Verwendung des Antikörpers vorsensibilisierten Platten in diesem markierungsfreien Assaysystem, das Assay Laufzeit mit der Datenanalyse ist ungefähr 45 min. Darüber hinaus können mehrere Patientenproben in einem 96- oder 384-Well-Format über eine HPLC-MS / MS-basiertes Format abgefragt werden, ist klar im Vorteil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Nach Angaben der American Cancer Society, werden mehr als 200.000 Frauen mit invasivem Brustkrebs pro Jahr diagnostiziert, und rund 40.000 an der Krankheit sterben. Die menschliche Leukozyten-Antigen (HLA) Klasse-I-Peptide, die von Proben proteasomalen Abbau von Zellproteinen abgeleitet und stellt diese Fragmente auf der Zelloberfläche für die Abfrage durch zirkulierende cytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Erzeugung von T-Zell-Rezeptor-Mimetikum (TCRM) monoklonale Antikörper (mAbs), die Brustkrebs erkennen spezifische Peptid / HLA-A * 02: 01-Komplexe, wie sie aus Makrophagen-Migration-Hemmfaktor (MIF 19-27) und NY-ESO- abgeleiteten 1, 157-165 aktivieren Erkennung und Zerstörung von Brustkrebs-Zellen in Abwesenheit einer wirksamen Antitumor-CTL-Antwort. Intakte Klasse I HLA / Peptid-Komplexe werden von Brustkrebszellen zu vergießen und stellen möglicherweise relevanten Biomarkern. In dieser Arbeit wurde ein Durchbruch Biomarker-Screening-System für die Krebsdiagnostiks Einbeziehung T-Zell-Rezeptor mimic monoklonalen Antikörper in Kombination mit einem neuartigen, markierungsfreie Biosensor Verwendung Geführte-Mode-Resonanz- (GMR-) Sensor-Technologie dargestellt. Der Nachweis von Schuppen MIF / HLA-A * 02: 01-Komplexe in MDA-MB-231 Zellüberstände, Stachelhumanserum und Patientenplasma wird demonstriert. Die Auswirkungen dieser Arbeit konnte personalisierten Medizin durch die Entwicklung von Begleiterkrankungen Diagnose gezielter Immuntherapien zu revolutionieren.

Ein repräsentativer Satz von Experimenten wurde unter Verwendung des gut charakterisierten TCRM, RL21A, ein murines IgG2a monoklonaler Antikörper, der spezifisch für ein Peptid (MIF 19-27 oder FLSL) im Rahmen des HLA-A * 02: 01 Molekül 3. Die verwandten Peptid / HLA-Monomer sowie irrelevanten HLA-Monomer 15 wurde verwendet, um das beschriebene Verfahren zu demonstrieren. 3 zeigt den Assay-Format. RL21A ist spezifisch für die FLSL / HLA-Monomer mit geringer Kreuzreaktivität mit anderen Peptid / HLA-Komplexe 3. Diese Besonderheit wird mit der markierungsfreien Bioassay-System (Abbildung 4) rekapituliert. Die Empfindlichkeit des Etiketts frei Bioassay-System für diesen Versuch ist in niedrigen nanomolaren Bereich durch Titration des RL21A Antikörper immobilisiert auf FLSL / HLA-Monomer (Abbildung 5) bestimmt. Obwohl das Hintergrundsignal wesentlich im Serum erhöht, specific Detektion FLSL / HLA-Monomer in Stachelhumanserum ist in Figur 6 erreicht und ein Konzentrationsgradient ist leicht erkennbar in diesen Proben. Schließlich Stände aus der MDA-MB-231-Zelllinie, die zuvor gezeigt, dass die FLSL / HLA-A * 02 zu präsentieren: 01 Molekül, werden gezeigt, um lösliche FLSL Monomer enthalten mit diesem Etiketten kostenlose Testplattform (Bild 7). Anschließende Zugabe FLSL / HLA-Monomer erhöht das Signal auf RL21A (Abbildung 7). Aufgrund der Empfindlichkeit des Systems, ebenso gut Variation einschließlich negativer Resonanzverschiebungen können als Ergebnis von Temperaturschwankungen auftreten können, wie ersichtlich als Funktion der Standardabweichungen in den 4 und 5. Diese Variationen können dramatisch durch Vorinkubation von allen Proben und dem Bioassay-Plattenleser bei einer Temperatur etwas höher als Raumtemperatur (dh 28 ° C) reduziert werden. In 8 kurz, 96-Wanne Polystyrol-Platten wurden beschichtet mit [10 ug / ml] RL21A für 2 h bei Raumtemperatur mit PBST gewaschen, mit 0,5% fettarme Milch, mit PBST gewaschen, blockiert, und während 2 Stunden bei Raumtemperatur mit seriellen Verdünnungen inkubiert FLSL HLA-Monomer in normalem Humanserum, 1:10 verdünnt in PBS, eine Standardkurve zu erzeugen oder Patientenplasma verdünnt 1:10 in PBS. Die Platte wurde mit PBST gewaschen, inkubiert 1 h bei Raumtemperatur mit Kaninchen-Anti-Human-β2 Mikroglobulin [1: 5000], um intakte HLA detektieren und in PBST gewaschen. Die Platten wurden dann für 30 min mit Ziege-Anti-Kaninchen IgG [1: 10.000] inkubiert und mit PBST gewaschen. Kolorimetrische Nachweis wurde unter Verwendung von ABTS (2,2&#39;-Azinobis [3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure] -diammonium Salz) Substrat mit einer 15 min Inkubationszeit und bei 405 nm auf einem Mikroplattenlesegerät beobachtet. FLSL / HLA wurde in drei Patientenproben nachgewiesen. In 8B wurde Patientenplasma RL.064 1:20 in PBS verdünnt und fügened zu der Platte und auf der markierungsfreien Detektor für 60 min überwacht. Spezifischer Nachweis von FLSL / HLA-Komplex in Patientenserum wurde durchgeführt. Student t-Test wurde unter Verwendung von Grafiken und Statistik-Software (p &lt;0,05). In 8C Gewebeschnitte wurden mit 1 &amp; mgr; g / ml mit Maus anti-HLA-A2 (BB7.2) als eine positive Kontrolle, RL21A, IgG2b und IgG2a bzw. als Negativkontrolle angefärbt. Die Färbung wurde mit einem Anti-Maus-Nachweis-Kit, DAB (Diaminobenzidin) und Hämatoxylin QS für die Kernfärbung, wie vom Hersteller gerichtet erkannt. Die Färbung von Tumorgewebe durch RL21A bestätigt Präsentation FLSL / HLA-Komplexen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Tumor-Antigen-Präsentation durch die Klasse-I-Human-Leukozyten-Antigen-Krebs Transformation ist ein intrazelluläres Störung. HLA Probe intracellular Proteine ​​und zeigen krebsbedingte Veränderungen an der Zelloberfläche. CTL und TCRM können Krebszellen durch HLA-Peptid-Komplexe unterscheidbar diesen Zellen zu erkennen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Abb. 2: Screenshot der Datenerfassung im Biotest-Scanner-Software Beispiel für die Datenerfassung, die die anfänglichen Basis-Scan durch RL21A Antikörper zusätzlich zu einer Platte mit 10 ug / ml FLSL / HLA-Komplex beschichtet gefolgt. Antikörperkonzentrationen sind wie angegeben. Jede Zeile steht für eine Einzelperson gut über die Zeit verfolgt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Abb. 3: Assay-Format Illustration von Antikörpern auf dem Beugungsgitter Oberfläche der Testplatte Erfassung rel immobilisierteinschlägigen Peptid / HLA-Komplexe in Lösung. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Spezifität der RL21A für FLSL / HLA-Komplex Demonstration der Spezifität der biotinyliert RL21A TCRM für seine relevanten (FLSL) HLA-Monomer verglichen mit irrelevanten HLA-Monomer (YLEV, SLLV und KVL).. Biotinylierte RL21A TCRM [10 ug / ml] auf der Avidin beschichtete Assayplattenoberfläche immobilisiert und der Nachweis wurde durchgeführt unter Verwendung von unmarkierten relevant oder irrelevant HLA Monomer [10 &amp; mgr; g / ml] in PBS. RL21A war spezifisch für FLSL / HLA-Komplex. Zwei-Wege-ANOVA wurde mit Grafik und Statistik-Software (p &lt;0,001). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Abb. 5: Die Bindung Empfindlichkeit RL21A zu seinem verwandten Peptid / HLA-Komplex Illustration der Detektiveam Limit und verbindliche Empfindlichkeit RL21A auf die FLSL / HLA-Komplex. Biotinylierte HLA Monomer FLSL [10 ug / ml] wurde auf der Testplatte Oberfläche immobilisiert und unmarkierte RL21A wurde der Platte in seriellen Verdünnungen in PBS wie angegeben zugegeben. Erkennung für dieses System war in niedrigen nanomolaren Bereich. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Abbildung 6: Nachweis von HLA-Komplexe in Spitz Human Serum Nachweis der Nachweis von HLA im Humanserum.. Biotinylierte RL21A TCRM [10 ug / ml] auf der Avidin beschichtete Assayplattenoberfläche immobilisiert. Gepoolten normalen Humanserum relevant (FLSL) oder irrelevante (SLLV) HLA-Monomer versetzt wurde 1:20 mit PBS verdünnt und dann zu der Platte und auf der markierungsfreien Detektor für 60 min überwacht. Spezifischer Nachweis von FLSL / HLA-Komplex in Humanserum wurde durchgeführt. In der Regel hoch ist Hintergrundsignal (irrelevant SLLV Monomer)er für verdünnten Serumproben im Vergleich zu reinig Analyten in PBS (siehe Abbildung 4). Zwei-Wege-ANOVA wurde mit Grafik und Statistik-Software (p &lt;0,0001). <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Abb. 7: Lösliche HLA-Komplexe wurden in Brustkrebs-Zellkulturüberständen nachgewiesen Die Fähigkeit, HLA in Brustkrebs-Zellüberständen erkennen demonstriert. Biotinylierte RL21A TCRM, RL9A TCRM (Negativkontrolle) und eine Isotypenkontrolle wurden auf der Testplatte Oberfläche immobilisiert. Spiked [5 &amp; mgr; g / ml] und unspiked MDA-231-Zellkulturüberstände wurden zugegeben, und die Bindung wurde für 60 min auf der markierungsfreien Detektor überwacht. FLSL und SLLV HLA-Monomer aufgestockte Proben repräsentieren positive Kontrollen für RL9A und RL21A verbindlich. Einweg-ANOVA wurde mit Grafik und Statistik-Software (p &lt;0,0001). Fig. 8: Spezifische Detektion FLSL / HLA-Komplexe in den Proben (A) Eine traditionelle Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) wurde verwendet, um FLSL / HLA-Komplexe spezifisch in Patientenplasma zu detektieren. (B) Biotinylierte RL21A TCRM oder IgG2a [10 ug / ml] auf der Avidin Assay-Platte immobilisiert. (C) Brusttumorgewebe von Patienten RL.064 war voller Flecken, wie oben beschrieben 3 bis Tumordarstellung des FLSL / HLA-Komplexe zu überprüfen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Intakte Klasse I HLA / Peptid-Komplexe werden von Krebszellen zu vergießen, was einem Potential von Bedeutung sind Krebs-Biomarker. Verwendung markierungsfreie Sensorik und T-Zell-Rezeptor imitiert monoklonalen Antikörpern, Nachweis von Schuppen MIF / HLA-A * 02: 01-Komplexe in MDA-MB-231 Zellüberstände, Stachelhumanserum und Patientenplasma wird gezeigt, so dass die Entwicklung von ein neuer Krebsdiagnoseplattform.

Der Nachweis von Human-Leukozyten-Antigen Biomarkern bei Brustkrebs Verwendung Markierungsfreie Biosensorik

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Aufrufe.  Texas Tech University Health Sciences Center.  Intakte Klasse I HLA / Peptid-Komplexe werden von Krebszellen zu vergießen, was einem Potential von Bedeutung sind Krebs-Biomarker. Verwendung markierungsfreie Sensorik und T-Zell-Rezeptor imitiert monoklonalen Antikörpern, Nachweis von Schuppen MIF / HLA-A * 02: 01-Komplexe in MDA-MB-231 Zellüberstände, Stachelhumanserum und Patientenplasma wird gezeigt, so dass die Entwicklung von ein neuer Krebsdiagnoseplattform. 

Serie: Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Gromer Nachweis von Biomarkern mithilfe einer molekularen Prägung basierte kapazitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

Markierungsfreie Neutrophilenzahl Anreicherung von Patienten abgeleitet Airway-Sekretion mit Closed-Loop Inertial Mikrofluidik

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...