Diese Arbeit wurde von der Clinical Proteomics Technologies for Cancer Initiative 5U24CA126477-04 unterstützt.

1) Bereiten Lektin-konjugierten POROS Spalten <ol><li> Setzen Sie auf eine Maske, um gegen das Einatmen von Poros-AL Perlen im Schritt 1.1 schützen - 1,2. Wiegen Sie die gewünschte Menge POROS Perlen (100 mg beads/300 ul Endvolumen) und Transfer in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Wash-Kügelchen mit Zugabe von 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Pellet Beads durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 3 Minuten. Überstand entfernen und wiederholen Sie die Wäsche. </li><li> Wiegen Sie die gewünschte Menge an konjugierten Lektin (1 bis 4 mg / 200 ul Perlen) und in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. Add PBS zu einem 5 - 20 mg / ml Lösung. Reserve von 25 ul dieser Lösung. </li><li> Übertragen Sie die verbleibenden Lektin-Lösung, die POROS Perlen. Add Natriumcyanoborhydrid zu einer Endkonzentration von 50 mM. Das Röhrchen wird auf einer Wippe und reagieren bei Raumtemperatur über Nacht. (Hinweis:. Natriumcyanoborhydrid ist giftig und muss in einem Abzug gehandhabt werden kontaminierte Abfälle müssen entsprechend entsorgt werden.) </li><li> Pellet der POROS Perlen wie in Schritt 1.2. Überstand entfernen und speichern wie die post-Konjugation Lösung. </li><li> Wash Beads mit 1 ml Quenching Buffer (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Pellet Perlen wie in Schritt 1,2 und sicher Überstand verwerfen. </li><li> Blockieren Sie die verbleibenden reaktiven Stellen auf der POROS Beads mit 1 ml Quenching Buffer. Add Natriumcyanoborhydrid zu einer Endkonzentration von 50 mM. Das Röhrchen wird auf einer Wippe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Pellet Perlen wie in Schritt 1,2 und Überstand verwerfen. </li><li> Wash Perlen mit 1 mL 1 M NaCl. Pellet Perlen und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die vier Mal für insgesamt fünf Wäschen. Die Perlen sind nun bereit zu packen. </li><li> Zur Bestimmung der Menge an Protein, konjugiert mit dem POROS Perlen wurde, führen Sie eine Proteinkonzentration Assay auf der Pre-und Post-konjugierten konjugierte Lektin-Lösungen. Der Unterschied in der Konzentration ist die Menge an Protein, konjugiert mit den Perlen wurde. Die Menge an Protein konjugiert pro Perle Volumen entspricht der Konzentration von Lektin auf der Perlenschnur. Ziel Lektin-Konzentrationen liegen zwischen 2 -20 mg / mL. </li></ol> 2) Verpackung das Lektin-konjugierten POROS Perlen in einen PEEK Spalte <ol><li> Montieren Sie die Verpackung (Beschreibung folgt) und unterstützen sie auf einem Metallring stand. Die Verpackung besteht aus, von unten nach oben, Druck Drossel, Endspalte Koppler 1, Fritte, Spalte (2 x 50 mm), Endspalte Koppler 2, Spalte Stecker, Endspalte Koppler 3, Spalte (4,5 x 50 mm), Endspalte Koppler 4 und Endstück. Die obere Spalte dient als Reservoir für das Verpackungsmaterial. </li><li> Resuspendieren POROS Perlen in der gewünschten Volumen von Puffer A (10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid). Wenn Verpackung eine Spalte (~ 200 ul Bettvolumen), in 400 ul Puffer A resuspendiert </li><li> Transfer-konjugierten POROS Perlen in der oberen Spalte (Stausee). Add Buffer A in das Reservoir, bis der Puffer erreicht die Spitze der Säule. Sanft statt der Endarmatur auf den Kopf der Kolonne und versuchten, um Luftblasen in der Säule zu vermeiden. Schließen Sie das Endstück der oberen Spalte, um die HPLC-System. </li><li> Packen Sie die Spalte durch fließende Puffer A durch das System. Beginnen Sie mit einer Flussrate von 0,5 mL / min. Erhöhen Sie die Durchflussmenge von 0,5 ml / min pro Minute, bis entweder 4 mL / min oder der maximale Druck (3000 psi) erreicht ist. Weiter mit der maximal möglichen Durchsatz, bis mindestens 35 ml Puffer A durch die Säule passiert haben. </li><li> Schalten Sie die Pumpen und damit den Druck auf die Spalte auf &lt;20 psi fallen. </li><li> Sanft, zerlegen die Verpackungsanlage, von oben beginnend. Wenn das Ende Spalte Koppler 2 erreicht ist, sorgfältig zu entfernen. Einige verpackt Material sollte von der Spitze der Säule werden Extrudieren. Mit einer Rasierklinge oder ähnlichem scharfe Kante, wischen weg das Extrudieren Perlen, so dass ein Wulst Oberfläche, die sogar mit dem oberen Ende der Säule. Üben Sie keinen Druck auf die Perlen, während dies zu tun. </li><li> Lösen Sie die gepackte Säule aus dem Ring zu stehen. Legen Sie eine neue Fritte in ein neues Ende Koppler und drehen Sie die gepackte Säule über, dies mit der Fritte / Ende Koppler auf dem offenen (ehemals top) Spalte Ende zu verbinden. </li><li> Beschriften Sie die Spalte entsprechend. Es ist jetzt einsatzbereit. Bei Nichtgebrauch kann die Säule in PBS mit 0,02% Natriumazid bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 6 Monaten. </li></ol> 3) Programm der HPLC-Methode <ol><li> Die Details der Programmierung Ihrer HPLC wird nach den Besonderheiten der Software des Herstellers variieren. Wir verwenden eine Michrom Paradigm MG4 HPLC. Auf dieser Maschine werden Methoden gebaut und erreicht unter der Registerkarte &quot;Setup&quot; an der Spitze des Bildschirms. Programmieren Sie die folgende Methode: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Zeit </td><td> Durchfluss (ul / min) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00.00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09.00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09.01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13.50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13.51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19.50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Puffer A: 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid Puffer B: 0,5 M Essigsäure Der UV-Detektor sollte so programmiert, dass bei 280 nm von 0.00 bis 19.50 Uhr gelesen werden. Die y-Achse sollte so eingestellt werden low-Absorption Ebenen, z. B. 0 erkannt werden -. 50 AU. </li><li> Wenn ein Autosampler zur Verfügung steht, Programm die folgenden Zeitplan für Fraktionssammlung. Ansonsten sammelt die Fraktionen von Hand wie bei der Durchführung von Chromatographie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bruchteil </td><td> Verzögerung, die Sammlung aus Probenaufgabe </td><td> Dauer der Erhebung (min) </td></tr><tr><td> Durchfluss- </td><td> 2,8 </td><td> 4,1 </td></tr><tr><td> Gebunden </td><td> 9 </td><td> 2,6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Bereiten Sie Proben für HPLC <ol><li> Vor diesem Protokoll verwenden, sollte Humanplasma der 14-reiche Proteine ​​mit einem MARS Spalte (; Santa Clara, CA Agilent) aufgebraucht sein werden. Abgereichertes Plasma, Lactoferrin und Hefeinvertase sollte individuell sein trypsinverdauten und entsalzt wie zuvor 1 beschrieben. </li><li> Zur Vorbereitung des Lektin-spezifischen Lactoferrin Standard, führen Chromatographie an 50 ug trypsinverdauten Lactoferrin entweder über die AAL oder die SNA Spalte mit der Methode in Teil 3. Die gebundene Fraktion enthält Lektin-spezifischen Lactoferrin Glykopeptide. Neutralisieren Sie die Proben wie in Teil 4.4 und entsalzen als in Teil 6. Resuspendieren der Probe in 1 ml Puffer A. Die resultierende Probe ist einsatzbereit. </li><li> Drei experimentelle Wiederholungen durchgeführt. Zur Vorbereitung Probe für drei Wiederholungen, addiere 3 pmol trypsinverdauten Invertase und 1 ul Lektin-spezifischen Lactoferrin (entweder AAL-LAK oder SNA-LAC) auf 30 ul MARS-abgereicherten, trypsinverdauten, Plasma-Äquivalente (PE). Ein PE ist als das Volumen der non-processed/intact/original Plasma, aus dem eine bestimmte Menge an verarbeiteten Plasmas (MARS-abgereicherte und Trypsin) abgeleitet wurde, definiert. Add Buffer A auf die Probe auf ein Endvolumen von 330 ul zu erreichen. </li><li> Add Neutralisationspuffer (1 M Tris pH 8,0), um die Probengefäße, dass Eluat sammeln. Die Anzahl und das Volumen der Vials mit denen Sie arbeiten werden, auf die Zwänge der Autosampler ab. Für die Paradigm MG4, sammelt ein Fläschchen der Flow-Through-und zwei sammeln das Eluat. Es erfordert etwa 1,5 mL Tris-Puffer auf 1 ml des Eluats zu neutralisieren. Ziel neutralisiert pH-Wert 7,0-8,0; test test endgültige pH-Wert mit pH-Indikatorpapier. </li></ol> 5) Führen Sie Chromatographie <ol><li> Alle Leerwert und Probe läuft, die folgen wird die Methode in Teil 1 beschrieben. Die Säule und Puffer sind bei Raumtemperatur während der Benutzung. Die Spalten werden bei 4 ° C gelagert, während Puffer bei Raumtemperatur gelagert werden. </li><li> Bringen Sie entweder die AAL oder die SNA Lektinsäule der HPLC-System und führen Sie zwei leere Methoden (Injektion nur Buffer A). Stellen Sie sicher, dass das Lektin Säule an das Lektin-spezifischen Lactoferrin (Teil 2) entspricht. </li><li> Chromatograph den drei Plasma-Proben, Einspritzen einer leeren zwischen den einzelnen injizierten Probe, für insgesamt 7 HPLC-Läufen. Fraktionen aus blank läuft brauchen nicht erhoben. </li></ol> 6) Desalt Fraktionen gesammelt Für jede Fraktion verwenden Sie eine 1 mL Waters Oasis HLB SPE-Kartusche wie folgt: <ol><li> Bringen Sie die Anzahl der benötigten Kassetten Vakuumkammer. </li><li> Wet jede Patrone mit 1 mL 80% ACN in 1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg). </li><li> Äquilibrieren Patronen mit 1,5 ml 0,1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg) </li><li> Laden gesamte Volumen einer Probe auf eine Patrone (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 2 gelesen -. 2,5 lnHg und Durchfluss sollte nicht mehr als 1 ml / min) </li><li> Wash-Kartuschen mit 3 x 1 mL 0,1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg) </li><li> Eluieren Peptide / Glykopeptide in beschriftete Eppendorf-Röhrchen mit 1 x 1 mL 80% Acetonitril in 0,1% iger Ameisensäure. (Vakuum-Messgerät auf vielfältige lesen sollten 2 bis 2,5 lnHg und Durchfluss sollte nicht mehr als 1 ml / min.) Ein einzelnes Sammelröhrchen für jede Patrone verwendet werden sollte. </li><li> Neutralisieren Eluat durch Zugabe von 60 ul 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat jedem Sammelrohr. Ziel neutr.funktionalisierten pH-Wert ist 7,0-8,0; Test End-pH mit pH-Indikatorpapier. </li><li> Konzentrieren Sie sich eluierten Peptide / Glykopeptide auf ~ 50 ul, indem Sie sie auf einer Vakuum-Zentrifuge (z. B. eine Thermo Savant SpeedVac) für ca. 2 Stunden bei 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-Verdauung <ol><li> Prüfling pH zu gewährleisten ist zwischen 7,0 bis 8,0. Wenn nötig, fügen Sie 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat pH zu erhöhen. Wenn die endgültige Probenvolumen&gt; 100 ul, Speedvac Probe, bis es zwischen 50-100 ul ist. </li><li> Add 0,5 ul (250 U) Glycerin-free PNGase F zu jeder Probe Rohr und bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 8) Zip Tip Proben <ol><li> Beginnend mit PNGase F-verdauten Proben, ZipTip jeweils wie folgt. </li><li> Wet ZipTip mit 10 ul 100% Acetonitril, gefolgt von 10 ul 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure. </li><li> Äquilibrieren ZipTip mit 20 ul 0,1% Ameisensäure. </li><li> Legen Sie die Probe auf die ZipTip durch Pipettieren es rauf und runter durch die ZipTip Matrix 10-mal. </li><li> Waschen Sie die ZipTip durch Pipettieren 10 pl 0,1% Ameisensäure, 5-mal. </li><li> Eluieren der Probe in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen mit 10 ul 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure. </li><li> Wiederholen Sie die Elution und fügen Sie den zweiten 10 ul in das gleiche Rohr. </li><li> Speedvac die Proben auf ein Volumen von &lt;2 pl. </li><li> Resuspendieren Proben in 20 ul 0,1% Ameisensäure. Die Proben sind nun bereit für die Analyse durch LC-MS/MS. </li></ol> 9) repräsentative Ergebnisse: Die POROS Konjugation typischerweise Erträge On-Bead-Lektin-Konzentrationen im Bereich von 2 bis 20 mg / mL. Dies ist optimal für die Affinitätschromatographie. Lektinchromatographie von trypsinverdauten MARS-abgereicherten Humanplasma in der Regel eine Bereicherung Glykopeptide in der gebundenen Fraktion. Wie sind die Glykopeptide PNGase F-behandelten vor LC-MS/MS, werden sie als Peptide mit der N-linked Konsensussequenz identifiziert, NXS / T (X steht für alle Rückstände, aber Prolin), in denen die Asparagin zu umgewandelt wurde einer Asparaginsäure durch die Einwirkung von PNGase F. Peptide mit diesen Eigenschaften werden als deglykosylierter Peptide (oder &quot;deglycopeptides&quot;) werden. Im Durchschnitt der Flow-Through-(FT)-Fraktion aus AAL oder SNA-Chromatographie enthält 2-4% deglycopeptides, während 30-50% der Peptide in der gebundenen Fraktion gewonnen deglycopeptides sind. In der Regel mit einem QStar Elite, wird 1000-1300 Peptide in der FT-Fraktion identifiziert werden, und 200-400 Peptide werden in der gebundenen Fraktion identifiziert werden. Zwei oder mehr verschiedene Invertase deglycopeptides sollte in der FT-Fraktion und zwei oder mehr unterschiedliche Lactoferrin deglycopeptides in der gebundenen Fraktion (Tabelle 1) eingehalten werden. <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1.

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li></ol>

Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode zur Isolierung und Identifizierung von Glycopeptiden in ein Glykan-spezifische Art und Weise. Als Glykosylierung variiert weitgehend innerhalb eines Organismus, insbesondere bei der Entwicklung und Pathogenese, kann diese Technik anzuwenden, um eine Vielzahl von Fragen zu beantworten. Insbesondere sind wir mit der Methode zur selektiven Anreicherung Glykopeptide, die mit Krebs-assoziierte Epitope wurden als erster Schritt in Richtung Entdeckung neuer Biomarker geändert.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aleuria aurantia lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sambucus nigra agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

Glykane sind eine wichtige Klasse von post-translationale Modifikationen. In der Regel auf sezerniert und extrazelluläre Moleküle gefunden, Signal Glykanstrukturen den internen Status der Zelle. Glykane auf Tumorzellen neigen dazu, reichlich Sialinsäure und Fucose-Einheiten haben. Wir schlagen vor, dass diese Krebs-assoziierte glycan Varianten für Biomarker-Entwicklung bei der Diagnose einer Erkrankung im Frühstadium sollen ausgeschöpft werden. Dementsprechend haben wir ein Massenspektrometrie-basierter Workflow, der Chromatographie an Affinitätsmatrizes von Lektinen, Proteine, die spezifisch Glykanstrukturen binden gebildet beinhaltet. Die Lektine Sambucus nigra (SNA) und Aleuria aurantia (AAL), die Sialinsäure und Fucose binden, wurden jeweils kovalent an POROS Perlen (Applied Biosystems) gekoppelt und verpackt in PEEK Säulen für Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC). Kurz gesagt, wurde Plasma von den vierzehn am häufigsten vorkommenden Proteine ​​mit Hilfe eines Multiple-Affinität-Entfernungs-System (; Agilent MARS-14) erschöpft. Abgereichertes Plasma wurde Trypsin-verdaut und in Flow-Through-und gebundenen Fraktionen von SNA oder AAL HPLC. Die Fraktionen wurden mit PNGaseF behandelt werden, um N-Glycane zu entfernen, und mit Hilfe der LC-MS/MS auf einem QStar Elite. Die Daten wurden mittels Mascot-Software. Das experimentelle Design inklusive positiven Kontrollen fucosylierte und sialylierte humanes Lactoferrin Glykopeptide-und Negativ-Kontrollen-high Mannose Glycopeptide aus Saccharomyces cerevisiae-, die verwendet wurden, um die Spezifität der Lectin erfassen zu überwachen. Key Features dieser Workflow sind die Reproduzierbarkeit von HPLC-Format, die positive Identifikation der erfassten und PNGaseF behandelten Glykopeptide aus ihren deamidierten Asn-Xxx-Ser/Thr Motive und Qualitätsbewertung mit Glykoprotein-Normen abgeleitet. Protokoll-Optimierung ebenfalls enthalten, um die geeignete Verhältnis von Ausgangsmaterial zur Spalte Kapazität, Ermittlung der effizienten Erfassung und Elutionspuffer, und die Überwachung der PNGaseF-Behandlung in voller Deglykosylierung zu gewährleisten. Zukünftige Richtungen gehören die Verwendung dieser Workflow-Massenspektrometrie-basierte Entdeckung Experimente an Plasma von Patientinnen mit Brustkrebs und Kontrollpersonen durchgeführt.

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A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Lectin-konjugierten POROS Perlen wurden für die HPLC eingesetzt. Glycopeptid-Normen diente als positive und negative Kontrollen. MARS-14 aufgebraucht wurde trypsinverdauten Humanplasma chromatographiert und Flow-Through-(FT) und gebundenen Fraktionen für ESI-LC-MS/MS Analysen gesammelt. Glykopeptide wurden in der gebundenen Fraktion angereichert, um FT verglichen.

A Lectin HPLC-Methode zur selektiven glykosylierte Peptide aus komplexen biologischen Proben Enrich

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Aufrufe.  University of California, San Francisco - UCSF. Lectin-konjugierten POROS Perlen wurden für die HPLC eingesetzt. Glycopeptid-Normen diente als positive und negative Kontrollen. MARS-14 aufgebraucht wurde trypsinverdauten Humanplasma chromatographiert und Flow-Through-(FT) und gebundenen Fraktionen für ESI-LC-MS/MS Analysen gesammelt. Glykopeptide wurden in der gebundenen Fraktion angereichert, um FT verglichen.

Serie: A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Forschung

Biologie

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects on bone repair in a unicortical defect model. Treatment of mesenchymal cells produced an increase in alkaline phosphatase activity, showed nodule formation by the cells, and increased the expression of genes for runx2, osterix, bone sialoprotein, and osteocalcin. A collagen sponge soaked with peptide promoted repair of bone defects, whereas the control was less effective. The results from this study demonstrated that mesenchymal cells treated with peptide in vitro differentiate towards osteogenesis, and, that peptides delivered in vivo using a collagen sponge promote the repair of unicortical defects.

A phage display library was used to identify peptide sequences that target bone. The objective was to investigate the effect of these peptides on mesenchymal cell differentiation and to determine their effect on bone regeneration.

Peptide aus Phage Display Bibliothek Genexpression modulieren in mesenchymalen Zellen und potenzieren Osteogenesis in unikortikale Knochendefekten

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Entfernen von exogenen Materialien aus dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne der Antike biologische Gemeinschaften beherbergte Innen zur Untersuchung

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente