Name: isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging
Uploaded: 2014-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging at JoVE.com

We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut f&#252;r Molekulare und Zellul&#228;re Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).

HINWEIS: Ist dieses Protokoll zum ersten Mal zu ISCs von FAC Sortierung zu isolieren, sind obligatorisch, um die FACS-Parameter zunächst eingestellt richtig die folgenden Steuerelemente: Dissoziierte Zellen von Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen ohne Sytox. Dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen mit Sytox (siehe Schritt 3.6). Dissoziierten Zellen aus Mitteldärmen des esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox. 1. Herstellung von Lösungen und Geschirr für Gut Dissection <ol><li> Bereiten Sie 4-6 Fläschchen mit je 40 weiblichen Linie vom esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur. </li><li> Von einem 10-fach PBS Stammlösung werden 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O, 175 mM NaCl, pH-Wert auf 7,4). </li><li> Bereiten Sie eine 3,5% Igen Lösung in 1x PBS (3,5 g Elektrophorese Grade Agarose in 100 ml 1x PBS). Bereiten Dissektion Platten durch Eingießen dieser Lösung in Petrischalen (Durchmesser 8,5 cm), um den Boden zu bedecken. Die Agarose-Schicht verhindert eine Beschädigung der Spitzen der Zange während der Präparation Verfahren. Nachdem das Gel erstarrt ist die Dissektion Platten bei 4 ° C lagern. </li><li> Bereiten Sie 300 ml 1x PBS + 1% BSA frischer vor Sezieren und die Flasche auf Eis oder bei 4 ° C. </li><li> Schalten Sie Zentrifuge und lassen Sie ihn abkühlen auf 4 ° C. </li><li> Flamme die Spitzen 2 Glas Pasteurpipetten, um die Kanten zu glätten. </li><li> Sauber zwei Zangenpaaren und eine Rasierklinge mit 70% Ethanol. </li><li> Platzieren Sie vier vor sechs 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zum Sammeln seziert Mitteldärmen auf Eis. </li></ol> 2. Vorbereitung des Magen-Darmtraktes und Dissektion der Dünndarm- <ol><li> Anesthetize Fliegen aus einem Fläschchen (40 Linie) mit CO 2 auf einem Standard-fly-Bett, alle enthauptenfliegt mit einer Rasierklinge und übergeben sie an die Dissektion Gericht. Gießen Sie kaltes 1x PBS / 1% BSA-Lösung in die Dissektion Gericht, um die Agarose-Gel zu bedecken. Die Fliegen schwimmt. </li><li> Besorgen Sie sich die Fliege Bauch mit einer Pinzette, während der Brustkorb mit der anderen Pinzette halten. Trennen Sie den Brustkorb aus dem Bauch. Die gut sichtbar sein und die Vorderdarm / Ernte wird sehr wahrscheinlich noch auf den Thorax verbunden werden. </li><li> Besorgen Sie sich die gut und ziehen Sie sie aus dem Brustkorb. Um den Darm entfalten, greifen die Ernte und ziehen Sie den Bauch ein wenig nach vorne weg von den Unterleib. </li><li> Besorgen Sie sich die hintere Ende des Unterleibs mit einer Pinzette und den Rand der nach vorne offenen Nagelhaut mit der anderen Pinzette. Achten Sie darauf, den vorstehenden Darmgewebe zu zerstören. Ziehen Sie das hintere Ende weg, um die Nagelhaut zu brechen und weiter nach hinten ziehen sehr vorsichtig, bis der gesamte Darm ist aus der Bauchhöhle herausgezogen worden. Die Ernte kann muss vorher entfernt werden, wenn es zu groß, um fit istdurch die Körperhöhle. </li><li> Entfernen Sie die Vorderdarm, Malpighischen, Enddarm und Eierstöcke Verlassen des kahlen Mitteldarm. </li><li> Mit einem Glas Pasteur Pipette die Charge seziert Mitteldärmen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem 1x PBS / 1% BSA-Lösung und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Die Proben müssen innerhalb von 2 Stunden verarbeitet werden. </li><li> Nach der Präparation einer ganzen Charge abgeschlossen ist, spülen Sie die Dissektion Gericht mit doppelt destilliertem Wasser auf über Schmutz abwaschen links. Starten Sie sezieren die nächste Gruppe von Mitteldärmen (wiederholen Sie die Schritte 2,1 bis 2,7). Sezieren soviel Partien wie möglich innerhalb von 2 Stunden, dann fahren Sie mit Schritt 3.1. </li></ol> 3. Die Verdauung der Gut Tissue Harvest Zellen für FAC Sortierung <ol><li> Entfernen Sie die 1x PBS / 1% BSA-Lösung von den Mitteldarm und fügen Sie 500 ul von 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Probe. </li><li> Vortex gut 20 Sekunden und die Proben unter durch sanfte Schaukeln / 25-30 min rotierenden bei 20 UpM bei Raumtemperatur. </li><li> Vortex wieder nach ca. 30 min und lassen Sie das intakte Mitteldarm Gewebe sinken auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen, die in Suspension mit einem geflammten Pasteurpipette aus Glas sind und filtern sie durch eine 35 &amp; mgr; m Nylon Netz in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Dreh die Zellen nach unten bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C. Zu beachten ist, beim Starten des Verdaus, einem Zellpellet kann zunächst nicht sichtbar sein, sondern werden als Gewebe digest schreitet sichtbar. <ol><li> Die Trypsin-Lösung vorsichtig wieder übertragen zu der ursprünglichen Probenröhrchen, das die verbleibenden intakten Mitteldarmgewebe. Vermeiden der Übertragung zu viele Zellen aus dem Pellet. </li><li> Vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 400 ul kaltem 1x PBS / 1% BSA. Halten Sie die Reaktionsgefäße mit den dissoziierten Zellen auf Eis und decken die Rohre mit Aluminiumfolie um die Zellen vor Licht zu schützen. </li><li> Vortex die Trypsin-Lösung, die die verbleibenden intakten Mitteldarm Gewebe wieder und legen Sie die Probenauf die Wippe für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.4.3, bis die gesamte Mitteldarmgewebe wurde verdaut. Kombinieren Sie die dissoziierten Zellen aus allen Reaktionsgefäße in einem Reaktionsgefäß. Dies kann einen Zentrifugationsschritt wie in 3.4, da das Volumen aller Zellsuspensionen dürfen zusammen 1,5 ml überschreiten müssen. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis und die Zellen vor Licht schützen. </li><li> Dreh die dissoziierten Zellen nach unten bei 100 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig soviel Überstand wie möglich, so dass ungefähr 50-100 ul des 1x PBS / 1% BSA-Lösung in Mikrozentrifugen-Röhrchen zu entfernen. Vorsichtig resuspendieren dissoziierten Zellen in 800 ul 1x PBS / 1% BSA enthält Sytox (1: 20.000). </li><li> Übertragen der Zellsuspension in einen 5 ml Rundboden Falcon Röhrchen durch Filtern der Zellen durch ein Zellsieb Schnappkappe (35 um Nylon-Mesh). Halten Zellproben auf Eis und vor Licht geschützt. Die Zellen sind nun bereit,sortiert werden. </li><li> Pipettieren Sie 600 ul von RNAlater Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, in die die Zellen für die anschließende RNA-Isolierung sortiert werden. Für andere Downstream-Anwendungen können die Zellen in einer anderen Lösung gesammelt werden, beispielsweise in sterilem PBS. </li></ol> 4. FAC Sortierung auf die Stammzellen des Darms Isolieren <ol><li> Schalter auf der Durchflusszytometrie Instrument mindestens eine Stunde vor der Sortierung. Stellen Sie sicher, dass das Fluidsystem ist frei von Luftblasen. </li><li> Wählen Sie die 70 um die Düsengröße, um die Zellen in die Hülse Fluidstrom injizieren. </li><li> Stellen Sie die Amplitude der Kernfluidstrom, so daß der Spaltwert entspricht der Referenzwert (6-7, bei der Verwendung der 70 &amp; mgr; m-Düse). Lassen Sie die Kernfluidstrom vor dem Start zu sortieren stabilisieren. </li><li> Folgen Sie dieser Reihenfolge, wenn zunächst die Einstellung der Parameter für die Sortierung: <ol><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen vom Wildtyp Mut erhalten. Zuerst stellen Sie die FSC und SSC Spannungenum die Zellen des Grundstückes in der Mitte der Punktwolke. Zweitens einstellen FITC (GFP) Spannung, so dass alle Zellen unter 10 2 auf der logarithmischen x-Achse aufgetragen. Wird der Parameter FITC setzt die Grenze für Autofluoreszenz. </li><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen von Wildtyp-Mut mit Sytox erhalten wird. Stellen Sie die Pacific Blue Spannungswert und Tor zu identifizieren und zu getrennt lebenden Zellen von toten, Sytox-positiven Zellen in der Pacific Blue vs. FSC-A Streudiagramm. </li><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen aus der esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox erhalten und stellen Sie die FITC Spannung, um sicherzustellen, dass alle GFP-positiven Zellen werden innerhalb der Punktwolke dargestellt. </li></ol></li><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen aus der esg -Gal4 erhalten, UAS-GFP Fliegenschnur mit Sytox aufgenommen. Stellen Sie die Pacific Blue Spannungswert und Tor zu identifizieren und zu getrennt lebenden Zellen von toten, Sytox-positiven Zellen (Gate P1). <ol><li> Stellen Sie die SSC-A und FSC-A-Gate, um die GFP zu identifizierenpositiven Zellen (basierend auf dem Histogramm Grundstück) nach Größe und Granularität (Gate P2) bestimmt. </li><li> Stellen Sie den FSC-H und FSC-W Tor zu identifizieren und auszuschließen GFP-positive Zellen Dubletten anhand ihrer Größe (Gate P3). </li><li> Stellen Sie die SSC-H und die SSC-W Tor zu identifizieren und auszuschließen GFP-positive Zellen Dubletten auf der Grundlage ihrer Granularität (Gate P4). </li><li> Verwenden Tor P4, um die GFP-positiven Zellen in einem Histogramm Plot, der die Anzahl der Zellen (count) gegen GFP Intensität zeigt darzustellen. Zwei unterschiedliche Peaks von GFP-positiven Zellen sichtbar. Erstellen Sie ein Tor für jeden Peak (Toren P5 und P6). Gate P5 enthält die Zellpopulation, die ISCs angereichert ist und unabhängig von den anderen Zellen in Gate-P6 sortiert werden. </li><li> Back-Gate in einem Konturdiagramm zu überprüfen, ob die zwei verschiedene GFP-positiven Zellpopulationen enthalten lebende Zellen (vgl Tor P1) und Zellen in der richtigen Größe (vergleichen mit Tor P2). </li></ol></li><li> Die Zellen zu sortieren, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 600 &amp; # enthält181; l RNAlater Lösung. Die Sortierung erfolgt bei niedriger Durchflussrate durchgeführt (max. 2,0, 70 &amp; mgr; m Düse, 1.000 Veranstaltungen / sec, 70 psi) und unter Verwendung einer Zwei-Wege-Reinheit Art. </li><li> Nach Abschluss der Sortierung ist, sofort vortexen die sortierten Zellen kurz und die Reaktionsgefäße auf Eis zu halten, bis mit RNA-Isolierung oder andere nachgelagerte Anwendungen voran. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren zur ISCs von Jung und Alt erwachsenen Drosophila Mitteldärmen, die anschließend für die weitere molekulare Analysen wie Next Generation Sequencing verwendet werden können zu isolieren. FAC Sortierung der GFP-positive Zellpopulation von der esg -Gal4 hat UAS-GFP Fliegenschnur bereits von mehreren Gruppen 21,22 erreicht. Bis heute jedoch die Anwesenheit der zwei unterschiedliche Peaks von GFP-positiven Zellen wurde entweder vergessen oder unterbewertet. Wir zeigen, dass diese Trennung ist nicht nur zwei verschiedene Populationen von Zelltypen (ISCs und EBS), sondern auch, dass die beiden Spitzen der GFP-positiven Zellen bleiben während der Alterung deutlich getrennt. Diese Beobachtung ist äußerst relevant und wertvoll für Forscher Interesse an einem Studium Stamm- oder Vorläuferzellen während der Alterung. Isolierung der ISCs aus alten midguts wurde durch die Tatsache, dass es keinen molekularen Markerkombination auf ISCs in einem gealterten midgut identifizieren behindert. Die einzige Markierung, die unambiguously identifiziert ISCs in einem alten Mitteldarm ist Phospho-histone3 (PH 3), da ISCs sind die einzigen sich teilenden Zellen im Mitteldarm 12,13. Allerdings ist PH3 eine ungeeignete Marker ISCs zu isolieren, da die Anzahl der Teilungs Stammzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu niedrig ist, um einen angemessenen Betrag von ISCs für spätere Analysen zu erhalten. Die Fliegenschnur esg -Gal4, UAS-GFP ist die häufigste Fluglinie von Forschern, die ISC-Funktion, die Wartung und die Differenzierung zu studieren verwendet. Unser aktuelles Wissen über die molekulare Regulation der Homöostase ISCs basiert auf Studien, in denen spezifische Moleküle und Signalwege manipuliert wurden auf der Basis (in 7 überprüft). Daher fehlt uns noch das Wissen über die endogenen molekularen Veränderungen, die während des Alterns auftreten. Das hier beschriebene Verfahren schließt diese Lücke und basiert auf der Tatsache, dass ISCs können basierend auf ihrer Größe, Granularität und GFP-Intensität von erwachsenen midguts zu jedem Zeitpunkt während des Alterns, isoliert werden kann. WährendEtablierung und Optimierung dieser Methode gefunden, die folgenden Schritte entscheidend für eine zuverlässige Ergebnisse zu sein. Rund 200 Mut brauchen, um eine gute Menge von ISCs für FAC Sortierung erhalten seziert werden. Die Geschwindigkeit der Dissektion ist entscheidend und hängt von der individuellen Praxis. Eine ausgebildete Person kann 40 Eingeweide innerhalb von 20-30 min zu sezieren. Da GFP wird auch in den Malpighischen im esg -Gal4 ausgedrückt, UAS-GFP Fliege Linie, ist es wichtig, die Malpighischen vollständig aus dem Mitteldarm. Die seziert Mitteldärmen muss in einer kühlen Umgebung aufbewahrt werden, um den Abbau von Gewebe zu vermeiden und zu reduzieren RNAse-Aktivität im Gewebe. Deshalb müssen die seziert Mitteldärmen vom Sezieren Gericht in Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem 1x PBS / 1% BSA-Lösung nach maximal 20-30 Minuten übertragen werden und auf Eis gehalten. Jedoch sind die seziert midguts sollte nicht auf Eis für mehr als 2 Stunden vor dem Beginn der Gewebe Dissoziation mit Trypsin gelassen werden. Die efficilichen Ansatz ist es, so viele Partien von Fliegen wie möglich innerhalb dieser 2 Stunden zu zerlegen, dann starten Sie das Trypsin zu verdauen für diese Chargen. Wenn mehr midguts benötigt werden, können sie während der Inkubationszeiten des Trypsins Verdau präpariert werden. Obwohl Trypsin ist eine sehr potente Enzym und könnte nachteilige Auswirkungen auf Zellen haben wir noch erhalten genug Lebens, gesunde Zellen für die anschließende Sortierung FAC. Der entscheidende Schritt der Prozedur, die für die Isolierung von intakten Zellen ermöglicht ist, dass die dissoziierten Zellen von der Trypsin-Lösung alle 30 Minuten entfernt. Wenn die seziert Mitteldärmen für 2 ½ Stunden in einer Trypsin-haltigen Lösung bei Raumtemperatur inkubiert, beobachteten wir einen Anstieg von 20-30% in tot, Sytox-positiven Zellen. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß die Trypsinlösung wir enthält EDTA. Die Anwesenheit von EDTA wahrscheinlich erleichtert Gewebszerfall Chelatisierung für die ordnungsgemäße Funktion der extrazellulären Matrixmoleküle benötigt Calcium und Magnesiumionen. </p&gt; Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Art ISCs von Jung und Alt Mut sind die entsprechenden Anfangseinstellungen der FACS und Gating-Parameter mit den beschriebenen Kontrollen und im Anschluss an eine bestimmte Sortierhierarchie. Wir führten die FAC Sortierung auf einer ARIA II Durchflusszytometer (FACSDiva Software). Es ist wichtig, dass das Gerät auf mindestens eine Stunde vor der Sortierung zum Aufwärmen der Laser ausgeschaltet. Zu beachten ist, wenn FAC Sortierung von ISCs wird zum ersten Mal durchgeführt wird, unter Verwendung der oben genannten Kontrollen festgelegt werden die Parameter für das Sortieren und für die Entschädigung müssen: (1) dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen ohne Zusatz von Sytox - die Einstellung dieses Parameters (Schritt 4.4.1) verhindert Sortieren von Zellen auf der Basis ihrer Eigenfluoreszenz; (2) dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen mit Sytox hinzugefügt - die Einstellung dieses Parameters(Schritt 4.4.2) ermöglicht Trennung Toten aus lebenden Zellen (abgestorbene Zellen haben eine hohe Autofluoreszenz und die sortierten GFP-positiven Zellen kontaminiert); (3) dissoziierten Zellen aus Mitteldärmen des esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox - sorgt für die Einstellung dieses Parameters (Schritt 4.4.3), dass alle GFP-positiven Zellen werden innerhalb der Punktwolke dargestellt. Wenn diese Parameter nicht richtig eingestellt ist, wird der sortierten Zellpopulation wahrscheinlich enthalten toten Zellen und Zelltrümmer (5B, C), viele GFP-positiven Zellen wird uns fehlen (5D) und die zwei deutliche Spitzen für GFP-positiven Zellen als im Histogramm Grundstück aus sieht (2E und 3E) werden nicht erkannt. Sobald die FACS und Gating-Parameter eingestellt sind, wird das Gerät kalibriert und bereit, Zellen aus der esg -GAL4, UAS-GFP Fliegenschnur zu sortieren. Da diese Parameter können gespeichert, alle künftigen Sortierung Sitzungen für ISCs und EVG von der esg -GAL4, UAS-GFP Fliegenschnur aus Schritt 4.5 starten. Obwohl die Wahl der &quot;Reinheit&quot; Modus und Durchführen einer Zweiwege-Reinheit Art verringert die Anzahl von Zellen sortiert, ermöglicht es eine höhere Sortier Stringenz (Schritt 4.6 und 4B, C). Zu beachten ist, ist der Vorteil der Verwendung Sytox statt Propidiumiodid, um tote Zellen zu kennzeichnen, dass es nur eine geringe Übergreifen in die FITC (GFP) Kanal, der es einfach, für die Spillover-Ausgleich macht. Unser Verfahren zum Anreichern ISCs und EBs jeweils auf das Sortieren der Zellen gemäß den verschiedenen GFP-Expressionsniveaus basieren. Mag sein, dass während der Alterung der misdifferentiated EVG auch Ausdruck GFP auf einem niedrigeren Niveau und konnte sich irren als ISCs können. Da jedoch die sortierten Zellen in Größe und Granularität unterscheiden sich auch, glauben wir, dass unsere Sortierstrategie ist die am besten geeignete zu diesem Zeitpunkt für ISCs und EBs reichern. Auch ist es bekannt, dass Zellen in einer alternden midgut Halte ISC Identität haben einen kleinen Kern 15. Um mehr Klarheit über die Identität der sortierten Zellen zu erhalten, kann man Zellen aus einem transgenen Fliege Linie, die esg -GAL4 trägt, UAS-GFP und einem Notch-Signal Reporter-Transgen zu sortieren. Seit Notch hat sich gezeigt, nur aktiv in den EVG 12,13 sein, isoliert ISCs von einem jungen Mitteldarm wäre negativ für die Notch-Reporter, während die EVG wäre positiv für den Notch-Reporter. , Während der Alterung Notch-Signalweg wird jedoch aberrante im Mitteldarm Gewebe. Daher muss sie geprüft, ob dieser Versuchsanordnung ist in der Tat mehr als zuverlässig zwischen ISCs und EVG unterscheiden getrennt von einem alten Mitteldarm werden. Wir haben dieses Konzept bereits für vergleichende Transkriptom Analyse der ISCs beschäftigt von jung und alt Mitteldärmen und nennt eine Reihe von Faktoren, die unterschiedlich reguliert werden während des Alterns (uv. Observ.). Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren zur Analyse der Unterschiede in der Genexpression zwischen ISCs und EBs. Eine solche Untersuchungs wird Einblick in die ersten molekularen Veränderungen, wie eine Zelle die Differenzierung tritt auftreten. Auch die Isolierung der EVG bei Alterung und weiteren Analysen Aufschluss über die molekularen Veränderungen der altersbedingte Fehldifferenzierung zu vergießen. Außerdem kann dieses Verfahren mit anderen genetischen Werkzeugen in Drosophila verwendet, um Genfunktion kombiniert werden. Zusammenfassend bietet diese Methode eine unvoreingenommene Herangehensweise an molekularen Merkmalen sowie Änderungen der ISCs und EVG während der Alterung zu untersuchen. Dies ist ein wertvolles Werkzeug, Erforschung von Alterungsmechanismen in adulten Stammzellen und Vorläuferzellen erleichtert.

Eine unvermeidliche Folge des Älterwerdens ist die abnehmende Fähigkeit der Gewebe und Organe funktionsfähig bleibt. Adulte Stammzellen sind für die Aufrechterhaltung Gewebshomöostase und Organfunktionen, aber wie Organismen Alter, die Stammzellen als auch einen Rückgang der biologischen Verhalten. Dies ist besonders schädlich für Gewebe, die eine hohe Umsatzrate aufweisen, wie das Darmepithel. Kennzeichen der im Alter von Stammzellen gehören genomische Beschädigung, verminderte Reparaturmechanismen, gestörte Regulation des Zellzyklus und fehlregulierte Signalwege, die alle auf den normalen Stammzellen Verhalten (in 1-3 überprüft). Durch die Manipulation spezifische Signalwege oder umzuwerfen bestimmter Gene haben wir Einblick in ihre Rollen bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der normalen Stammzellverhalten gewonnen. Da die meisten dieser Experimente sind Kandidatenmolekül Ansätze, wir haben sehr wenig Wissen über die körpereigenen molekularen Veränderungen, die während der in Stammzellen auftretenAltern. Ein Weg, um diese Frage zu nähern, ist es, das Transkriptom von jungen Vergleichen gegenüber alten Stammzellen Moleküle, deren Expressionsprofil ändert sich deutlich während der Alterung zu identifizieren. Leider haben die biologischen und technischen Herausforderungen unserer Fortschritte bei diesem Ansatz bisher behindert. Drosophila melanogaster ist ein gut geeigneter Modellorganismus, um Alterung zu untersuchen, da sie eine kurze Lebensdauer (ca. 60-70 Tage) und Exponate Alterungs Phänotypen (in 4 überprüft). Darüber hinaus kann der Alterungsprozess in Drosophila durch Temperatur beschleunigt werden. Bei der Haltung die Fliegen bei 29 ° C kann ein Alter von Phänotyp im Darmgewebe bereits nach 15 Tagen 5 beachten. Weiterhin ist Drosophila zugänglich für eine Vielzahl von genetischen Manipulationen. Insbesondere hat die Drosophila midgut als ausgezeichnetes Modellsystem entstanden, um den Einfluss der verschiedenen Signalwege und Umweltprobleme zu studierendie Biologie der Darmstammzellen (ISCs) während des Alterns (in 6-10 prüft). Die Drosophila Darmepithel eine hohe Fluktuationsrate und wird alle zwei Wochen bei Frauen im Monat bei Männern 11 erneuert und etwa einmal. ISCs mit Wohnsitz in der Drosophila Mitteldarm haben die Fähigkeit sich zu teilen und produzieren eine Selbst erneuert ISC und eine post-mitotischen Vorläuferzellen genannt enteroblast (EB) 12,13. Die EB unterscheidet entweder in einem saugfähigen Enterozyten oder einen sekretorischen enteroendokrinen Zelle. Zu diesem Zeitpunkt ist die einzige Markerkombination, die eindeutig markiert einen ISC ist die Expression des Transkriptionsfaktors escargot (ESG) und der Notch-Liganden Delta (DL) 14. Dies ist jedoch nur gilt für einen jungen und gesunden Darm. Während der Alterung wird der Mitteldarm-Epithel durch eine Erhöhung der Proliferations ISC 15-17 gekennzeichnet. Zusätzlich stört aberrante Notch-Signal das Schicksal Entscheidung des ISC Tochterzellenund induziert Fehldifferenzierung des EVG 15. Dies führt zu einer Ansammlung von Zellen, die für Notch-Signalweg und Co-express esg und DI aktiv sind, so DI Ausdruck nicht aus, um bona fide Stammzellen zu identifizieren in einer alten Mitteldarm-Rendering. Die Schwierigkeit bei der Identifizierung von echten ISCs hat die Fähigkeit, die endogene Veränderungen Alterungs ISCs bisher untersuchen behindert. Wir haben dieses Problem durch die Nutzung des esg -Gal4, UAS-GFP transgenen Fliege Linie, in der die Höhe der GFP-Expression in ISCs und EVG ist von Natur aus anders und bleibt während Alterung verschiedenen gangen. Ein ähnlicher Ansatz wurde für die Isolierung von Larvenneuroblasten und Neuronen 18,19 beschrieben. Mitteldärmen von Jung und Alt esg -Gal4, UAS-GFP Fliegen wurden seziert und in Einzelzellen dissoziiert. Die Zellen wurden dann für GFP-positiven Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert. Interessanterweise ist die sortierten GFP-positive cEllen in zwei deutliche Spitzen basierend auf GFP-Fluoreszenzintensität verteilt (GFP hohen und niedrigen GFP). Außerdem ist die Verteilung der GFP-positiven Zellen in den beiden Peaks auch bei Zellgröße korreliert: Die Zellen, die niedrige GFP Intensität zeigten waren klein und weniger körnig während Zellen mit hoher GFP Intensität waren größer und granular. Diese Beobachtung legte nahe, dass die kleineren ISCs konnte von den größeren EVG mittels FACS auf Basis von GFP-Intensität und die Auswahl geeigneter Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC) Einstellungen unterscheiden. Interessanterweise blieben die beiden Peaks deutlich beim Altern getrennt. Außerdem ist das Verhältnis der zwei Peaks verändert in einer Weise, die die oben genannten Merkmale der Alterung midguts reflektiert, nämlich daß die Anzahl von großen, misdifferentiated EBs Zeit zunimmt. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass durch die Sortierung für GFP-positiven Zellen unter Verwendung der geeigneten FACS Parametereinstellungen, die wir für ISCs und EBs zu jedem Zeitpunkt d bereichernährend Alterung. Zusammenfassend stellen wir eine FACS-Strategie, die Forschern die für zwei unterschiedliche Zellpopulationen, ISCs und EVG zu bereichern, von Drosophila Mitteldärmen jeden Alters und, diese Zellen für die weitere Analyse, wie Next Generation Sequencing. Diese leistungsstarke Methode ermöglicht die Untersuchung der endogenen molekularen Mechanismen, die untrennbar mit Alterung in einer angereicherten Population von Stamm- oder Vorläuferzellen sind. Die aus diesen Untersuchungen erhaltenen Daten werden zweifellos erleichtern die Identifizierung der konservierten Moleküle, die in alternden allen Spezies signifikant sind.

<table><tbody><tr><td>Forceps: Dumont, Inox Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>SefarNitex 03-150um/38 (35 &amp;micro;m nylon mesh)</td><td>Sefar</td><td>3A03-0150-102-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td>543-42210-00</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.</td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM7023</td><td>Other solutions, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Trizol can be used for subsequent RNA isolation</td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Turn on one hour prior to sorting</td></tr></tbody></table>

isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Um zwischen 50.000-100.000 Zellen von FAC Sortierung, zwischen 160 und 200 midguts erhalten müssen seziert. Offensichtlich ist dies der zeitaufwendige Schritt des gesamten Verfahrens. Die in 1A gezeigten Cartoon zeigt die wichtigsten Schritte des Darms Präparation, die im Detail in den hier zur Verfügung gestellten Protokoll beschrieben sind. Dieses Verfahren kann individuell angepasst werden. A seziert gesamte Gastrointestinaltrakt ist in 1B gezeigt. Wenn alle der Mitteldarm Gewebe verdaut, sofort mit FAC Sortierung fortsetzen. Nach dem in dem Protokoll beschriebene Gating Strategie ermöglicht die erfolgreiche Identifizierung und Sortierung von einer Zellpopulation für ISCs und EBs angereichert aus jungen (Abbildung 2) und aus alten midguts (Abbildung 3). Die P1-Gate einstellen, dass nur gesunde lebende Zellen und Tor aus toten Zellen umfassen. Zellen, die über 10 3 auf der logarithmischen y-ax plottenwird bei der Verwendung des Pacific Blue Kanal als tote Zellen definiert. Die Punkte, die Handlung unter 40 auf der x-Achse (FSC-A) meist Schmutz und daher sind ebenfalls ausgeschlossen (Abbildung 2A). Im Streudiagramm der SSC-A gegen FSC-A werden die Zellen auf der Grundlage ihrer Größe und Granularität verteilt. Für eine optimale Auflösung, werden die Zellen in dem Streudiagramm angeordnet, wie in Figur 2B durch Einstellung der Photovervielfacherröhre (PMT) Spannung gezeigt. In den Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W Einzelzellen von Zuschlagstoffen und Dubletten, basierend auf Größe (2C) an Granularität (2D) getrennt und auf der Basis. Bei der Darstellung der im Tor P4 enthalten in einem Histogramm Plot, die klare Trennung von GFP-negative, GFP niedrig (Tor P5) und GFP Hoch (Tor P6) Zellen Zellen sichtbar ist (Abbildung 2E). Cells unteren GFP Intensität zeigen, sind klein und weniger körnig und stellen ISCs. Zellen, die höhere GFP intichte sind größer und körnige und stellen EVG. Reverse Transkriptase (RT) -PCR für Dl auf cDNA aus RNA synthetisiert von Zellen jedes GFP-positive Population (Gatter P5, P6) ergab, dass die DL-Signal auf den kleineren, GFP niedrigen Zellen tatsächlich stärker als in den größeren, GFP hohen Zellen (Figur 2H). Die Zellen wurden dann backgated und Konturdiagrammen dargestellt, um zu bestätigen, dass die GFP-niedrig (Gatters P5) und GFP hoch (Gatters P6) Zellen unterscheiden sich in der Größe und Granularität (2F) und sind noch am Leben (Figur 2G). Zu beachten ist, können die beiden Spitzen der GFP-positiven Zellen (GFP niedrigen und hohen GFP) nur gut unterschieden werden, wenn die FITC (GFP) Kanal kalibriert wurde ordnungsgemäß mit den im Protokoll beschriebenen Kontrollen. Die gleiche Strategie wurde Gating beim Sortieren ISCs aus alten Eingeweide (3) abgeleitet ist. Die Streudiagramme (Figure 3A-D) das Histogramm (3E) und die Kontur-Plots (3F, G) sind analog zu den in 2 gezeigten Wieder. Wie oben erwähnt, gibt es keine bona fide Marker ISCs in alten midguts und damit zu identifizieren kein RT-PCR-Daten werden hier vorgestellt. Allerdings ist der interessante Beobachtung, dass hier die beiden Peaks enthält GFP niedrig (Gate P5) oder GFP hoch (Gate P6) Zellen bleiben deutlich während der Alterung abgetrennt. Ferner kann die Anzahl von Zellen in der GFP hoch (Gate P6) Peak signifikant während des Alterns, was eindeutig emuliert den bekannten Akkumulation misdifferentiated EBs mit dem Alter zunimmt. Die Veränderung des Verhältnisses der beiden Zellpopulationen können auch in den Streudiagrammen ersichtlich ist (vergleiche 3A-D mit 2A-D) und in den Konturdarstellungen (vergleiche Figur 3F, G mit 2F, G). Aus diesen Befunden schließen wir, dass durch die Sortierung für GFP-positiven Zellen mittels FACS wir für ISCs und EVG in jung und alt Mitteldärmen bereichern können. Um die Reinheit des isolierten ISCs und EVG zu validieren, wurde ein Postsortieranalyse (Abbildung 4) durchgeführt. Die Histogramm Plot des post sortiert ISCs und EVG (4B, C) ​​zeigen Reinheiten zwischen 95% und 98%. Wenn die Hierarchie der Einstellung der FACS-Parameter, wie oben beschrieben wird strikt eingehalten, können die zwei verschiedenen Zellpopulationen (GFP niedrig, klein und GFP hoch, größer) bereits in einem Streudiagramm GFP vs. FSC-A (5A) zu unterscheiden. Diese beiden Zellpopulationen nicht unterschieden werden können, wenn diese Hierarchie berücksichtigt (5B-D). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig1highres.jpg" /> Figur 1: (A) Eine schematische Darstellung der wesentlichen Schritte Disse&#39;schenfesselndes die Fliege Darm. Zuerst wird der Kopf entfernt (Entfernen der Flügel ist optional), gefolgt von einer Trennung des Thorax und Abdomen, um den Darm freizulegen. Der Darm wird anschließend aus dem Körperhohlraum in den folgenden Schritten befreit. Die schwarzen Pfeile zeigen das Fortschreiten der Dissektion, während die dunkelrote Pfeile bezeichnen die Zugrichtung. Die roten Linien im letzten Bild zeigen die vorderen und hinteren Grenzen der Mitteldarm. (B) Ein Lichtmikroskopische Aufnahme der erwachsenen Fliege Darm. Die wichtigsten Regionen und anatomische Merkmale sind beschriftet. Rote Linien kennzeichnen die Grenzen des Mitteldarms. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig2highres.jpg" /> Abb. 2: FAC Sortierstrategie zu identifizieren und zu isolieren ISCs und EVG von jungen (7 Tage) Mitteldärmen Zur besseren Veranschaulichung Zellen, die ISCs sind rot markiert und die Zellen, die EVG werden hervorgehobenin blau in der Streudiagramme (AD) und in der Kontur-Plots (F, G). (A) Die P1 Tor wird sich tot, Sytox-positiven Zellen über 10 3, aufgetragen auf der logarithmischen Y-Achse aus. Die Schwelle des FSC-A wird auf 40 gesetzt, um auch tote Zellen und Trümmer aus. (B) Die Zellen wurden für FSC-A und SSC-A gated an Zellen nach Größe und Granularität (Gate P2) zu wählen. Das Histogramm Plot (E) wurde parallel verwendet, um die GFP-positiven Zellen in der FSC-A vs. SSC-A Streudiagramm (B) zu identifizieren. (C, D) Die Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W dienen, Aggregate und Dubletten entfernen, und wählen Sie für Singuletts (Gate P3 in C und Gate P4 in D). (E) Das Histogramm Plot zeigt die Anzahl der Zellen und ihrer GFP Intensität. Zwei Peaks, GFP niedrig (Gate P5) und GFP hoch (Gate P6) unterschieden. (F, G) Die Zellen wurden in einer Konturdarstellung Back-Gate, um sicherzustellen, dass die zwei verschiedenen GFP-positive Zelle populat werdenIonen sind in der richtigen Größe (F) auf und enthalten lebende Zellen (G). (H) Reverse Transkriptase (RT) -PCR für Dl auf cDNA aus RNA, die aus den im ersten Peak (Gate P5) enthaltenen Zellen isoliert, synthetisiert und in der zweiter Peak (Gate P6) sind. Mehr Dl Ausdruck könnte in Tor P5 vs. Tor P6 vorhandenen Zellen erkannt werden. Tubulin diente als Ladekontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: FAC Sortierstrategie zu identifizieren und zu isolieren, ISCs und EBs aus den alten (60 Tage) Mitteldärmen Zur besseren Veranschaulichung Zellen, die ISCs sind rot markiert und die Zellen, die EVG sind blau in den Streudiagrammen (AD) markiert und in der. Konturdiagramme (F, G). (A) Die P1-Gatter so eingestellt ist, tot, Sytox-positiven Zellen über 10 3, aufgetragen auf der logarithmischen y-Achse aus. Die Schwelle des FSC-A wird auf 40 gesetzt, um auch tote Zellen und Trümmer aus. Zu beachten ist, ist die altersabhängige Zunahme in größeren GFP-positiven Zellen bereits in diesem Diagramm auf der Hand. (B) Die Zellen wurden für FSC-A und SSC-A gated an Zellen nach Größe und Granularität (Gate P2) zu wählen. Das Histogramm Plot (E) wurde parallel verwendet, um die GFP-positiven Zellen in der FSC-A vs. SSC-A Streudiagramm (B) zu identifizieren. (C, D) Die Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W dienen, Aggregate und Dubletten entfernen, und wählen Sie für Singuletts (Gate P3 in C und Gate P4 in D). (E) Das Histogramm Plot zeigt die Anzahl der Zellen und ihrer GFP Intensität. Zwei Peaks, GFP niedrig (Gate P5) und GFP hoch (Gate P6) unterschieden werden können. Zu beachten ist, hat sich die Zellpopulation GFP Hoch mit größeren Zellen i erhöhtn Anzahl während des Alterns. (F, G) Die Zellen wurden in einem Konturdiagramm Back-Gate, um zu überprüfen, dass die zwei verschiedenen GFP-positiven Zellpopulationen sind in der richtigen Größe (F) und enthält lebende Zellen (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um sehen eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig4highres.jpg" /> Abb. 4: Ein Postsortieranalyse wurde von den jungen (7 Tage) und alte geführt, um die Reinheit des isolierten ISCs und EVG zu ermitteln (A) GFP-positiven Zellen (60 Tage) Mitteldärmen waren FAC sortiert und in der Histogramm Plot zeigen ihre Verteilung in zwei Peaks basierend auf GFP Intensität. (B) Die Postsortieranalyse zeigt die Reinheit der isolierten ISCs von jung und alt Mitteldärmen, die&gt; 97% ist. (C) Das Postsortieranalyse von sortierten EBs von jung und alt Mitteldärmen zeigt eine Reinheit von&gt; 95%. Die leichte Verunreinigungen können aus Fluoreszenzlöschung oder mechanisch beschädigt GFP-exprimierenden Zellen durch wieder Sortieren der Zellen verursacht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: Beispiele für Streudiagramme, die suboptimal FACS-Daten, was gesehen wird, wenn die FACS-Parameter nicht richtig gesetzt zeigen (A) Repräsentative FACS Profile aller Zellen, wenn die FACS-Parameter richtig eingestellt wurden, basierend auf den im Protokoll beschriebenen Kontrollen.. Die Zellpopulation, die ISCs ist rot eingekreist und die Zellpopulation, die EVG ist blau eingekreist. Die grün eingekreist Zellen sind tote Zellen, die eine stärkere Eigenfluoreszenz im Vergleich zu habenlebende Zellen, die unter 10 3 auf der logarithmischen y-Achse aufgetragen werden. (B) Das Streudiagramm zeigt ein typisches Ergebnis erhalten, wenn die FACS Instrument nicht kalibriert. Keine GFP-positiven Zellen nachgewiesen werden. (C) Wenn der FSC nicht richtig eingestellt ist, werden die verschiedenen GFP-positiven Zellpopulationen nicht erkannt. (D) Wenn der FITC (GFP) Kanal nicht richtig eingestellt ist, die Mehrheit der GFP- positiven Zellen, die sortiert werden sollen, nicht in der Punktwolke, sondern am oberen Rand des Grundstücks aufgetragen. Auch in der hier gezeigten Handlung, die Grenze für Autofluoreszenz wurde nicht eingestellt, daher Zellen, das Grundstück über 10 2 auf der logarithmischen Y-Achse sind eigentlich autofluoreszierenden und könnte fälschlicherweise als GFP-positiven Zellen sein.

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Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

Isolieren von Stammzellen des Darms von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Mitteldärmen durch FACS, um Stammzellverhalten Studie während des Alterns

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

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Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

20.1K Aufrufe.  Universität Ulm. Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging. 

Serie: Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Genetik

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Entwicklungsbiologie

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Biologie

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

Stimulation und Analyse der adulten Neurogenese im zentralen Gehirn von Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Isolieren von Stammzellen des Darms von Adult

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