We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut f&#252;r Molekulare und Zellul&#228;re Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).

HINWEIS: Ist dieses Protokoll zum ersten Mal zu ISCs von FAC Sortierung zu isolieren, sind obligatorisch, um die FACS-Parameter zunächst eingestellt richtig die folgenden Steuerelemente: Dissoziierte Zellen von Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen ohne Sytox. Dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen mit Sytox (siehe Schritt 3.6). Dissoziierten Zellen aus Mitteldärmen des esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox. 1. Herstellung von Lösungen und Geschirr für Gut Dissection <ol><li> Bereiten Sie 4-6 Fläschchen mit je 40 weiblichen Linie vom esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur. </li><li> Von einem 10-fach PBS Stammlösung werden 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O, 175 mM NaCl, pH-Wert auf 7,4). </li><li> Bereiten Sie eine 3,5% Igen Lösung in 1x PBS (3,5 g Elektrophorese Grade Agarose in 100 ml 1x PBS). Bereiten Dissektion Platten durch Eingießen dieser Lösung in Petrischalen (Durchmesser 8,5 cm), um den Boden zu bedecken. Die Agarose-Schicht verhindert eine Beschädigung der Spitzen der Zange während der Präparation Verfahren. Nachdem das Gel erstarrt ist die Dissektion Platten bei 4 ° C lagern. </li><li> Bereiten Sie 300 ml 1x PBS + 1% BSA frischer vor Sezieren und die Flasche auf Eis oder bei 4 ° C. </li><li> Schalten Sie Zentrifuge und lassen Sie ihn abkühlen auf 4 ° C. </li><li> Flamme die Spitzen 2 Glas Pasteurpipetten, um die Kanten zu glätten. </li><li> Sauber zwei Zangenpaaren und eine Rasierklinge mit 70% Ethanol. </li><li> Platzieren Sie vier vor sechs 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zum Sammeln seziert Mitteldärmen auf Eis. </li></ol> 2. Vorbereitung des Magen-Darmtraktes und Dissektion der Dünndarm- <ol><li> Anesthetize Fliegen aus einem Fläschchen (40 Linie) mit CO 2 auf einem Standard-fly-Bett, alle enthauptenfliegt mit einer Rasierklinge und übergeben sie an die Dissektion Gericht. Gießen Sie kaltes 1x PBS / 1% BSA-Lösung in die Dissektion Gericht, um die Agarose-Gel zu bedecken. Die Fliegen schwimmt. </li><li> Besorgen Sie sich die Fliege Bauch mit einer Pinzette, während der Brustkorb mit der anderen Pinzette halten. Trennen Sie den Brustkorb aus dem Bauch. Die gut sichtbar sein und die Vorderdarm / Ernte wird sehr wahrscheinlich noch auf den Thorax verbunden werden. </li><li> Besorgen Sie sich die gut und ziehen Sie sie aus dem Brustkorb. Um den Darm entfalten, greifen die Ernte und ziehen Sie den Bauch ein wenig nach vorne weg von den Unterleib. </li><li> Besorgen Sie sich die hintere Ende des Unterleibs mit einer Pinzette und den Rand der nach vorne offenen Nagelhaut mit der anderen Pinzette. Achten Sie darauf, den vorstehenden Darmgewebe zu zerstören. Ziehen Sie das hintere Ende weg, um die Nagelhaut zu brechen und weiter nach hinten ziehen sehr vorsichtig, bis der gesamte Darm ist aus der Bauchhöhle herausgezogen worden. Die Ernte kann muss vorher entfernt werden, wenn es zu groß, um fit istdurch die Körperhöhle. </li><li> Entfernen Sie die Vorderdarm, Malpighischen, Enddarm und Eierstöcke Verlassen des kahlen Mitteldarm. </li><li> Mit einem Glas Pasteur Pipette die Charge seziert Mitteldärmen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem 1x PBS / 1% BSA-Lösung und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Die Proben müssen innerhalb von 2 Stunden verarbeitet werden. </li><li> Nach der Präparation einer ganzen Charge abgeschlossen ist, spülen Sie die Dissektion Gericht mit doppelt destilliertem Wasser auf über Schmutz abwaschen links. Starten Sie sezieren die nächste Gruppe von Mitteldärmen (wiederholen Sie die Schritte 2,1 bis 2,7). Sezieren soviel Partien wie möglich innerhalb von 2 Stunden, dann fahren Sie mit Schritt 3.1. </li></ol> 3. Die Verdauung der Gut Tissue Harvest Zellen für FAC Sortierung <ol><li> Entfernen Sie die 1x PBS / 1% BSA-Lösung von den Mitteldarm und fügen Sie 500 ul von 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Probe. </li><li> Vortex gut 20 Sekunden und die Proben unter durch sanfte Schaukeln / 25-30 min rotierenden bei 20 UpM bei Raumtemperatur. </li><li> Vortex wieder nach ca. 30 min und lassen Sie das intakte Mitteldarm Gewebe sinken auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen, die in Suspension mit einem geflammten Pasteurpipette aus Glas sind und filtern sie durch eine 35 &amp; mgr; m Nylon Netz in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Dreh die Zellen nach unten bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C. Zu beachten ist, beim Starten des Verdaus, einem Zellpellet kann zunächst nicht sichtbar sein, sondern werden als Gewebe digest schreitet sichtbar. <ol><li> Die Trypsin-Lösung vorsichtig wieder übertragen zu der ursprünglichen Probenröhrchen, das die verbleibenden intakten Mitteldarmgewebe. Vermeiden der Übertragung zu viele Zellen aus dem Pellet. </li><li> Vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 400 ul kaltem 1x PBS / 1% BSA. Halten Sie die Reaktionsgefäße mit den dissoziierten Zellen auf Eis und decken die Rohre mit Aluminiumfolie um die Zellen vor Licht zu schützen. </li><li> Vortex die Trypsin-Lösung, die die verbleibenden intakten Mitteldarm Gewebe wieder und legen Sie die Probenauf die Wippe für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.4.3, bis die gesamte Mitteldarmgewebe wurde verdaut. Kombinieren Sie die dissoziierten Zellen aus allen Reaktionsgefäße in einem Reaktionsgefäß. Dies kann einen Zentrifugationsschritt wie in 3.4, da das Volumen aller Zellsuspensionen dürfen zusammen 1,5 ml überschreiten müssen. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis und die Zellen vor Licht schützen. </li><li> Dreh die dissoziierten Zellen nach unten bei 100 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig soviel Überstand wie möglich, so dass ungefähr 50-100 ul des 1x PBS / 1% BSA-Lösung in Mikrozentrifugen-Röhrchen zu entfernen. Vorsichtig resuspendieren dissoziierten Zellen in 800 ul 1x PBS / 1% BSA enthält Sytox (1: 20.000). </li><li> Übertragen der Zellsuspension in einen 5 ml Rundboden Falcon Röhrchen durch Filtern der Zellen durch ein Zellsieb Schnappkappe (35 um Nylon-Mesh). Halten Zellproben auf Eis und vor Licht geschützt. Die Zellen sind nun bereit,sortiert werden. </li><li> Pipettieren Sie 600 ul von RNAlater Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, in die die Zellen für die anschließende RNA-Isolierung sortiert werden. Für andere Downstream-Anwendungen können die Zellen in einer anderen Lösung gesammelt werden, beispielsweise in sterilem PBS. </li></ol> 4. FAC Sortierung auf die Stammzellen des Darms Isolieren <ol><li> Schalter auf der Durchflusszytometrie Instrument mindestens eine Stunde vor der Sortierung. Stellen Sie sicher, dass das Fluidsystem ist frei von Luftblasen. </li><li> Wählen Sie die 70 um die Düsengröße, um die Zellen in die Hülse Fluidstrom injizieren. </li><li> Stellen Sie die Amplitude der Kernfluidstrom, so daß der Spaltwert entspricht der Referenzwert (6-7, bei der Verwendung der 70 &amp; mgr; m-Düse). Lassen Sie die Kernfluidstrom vor dem Start zu sortieren stabilisieren. </li><li> Folgen Sie dieser Reihenfolge, wenn zunächst die Einstellung der Parameter für die Sortierung: <ol><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen vom Wildtyp Mut erhalten. Zuerst stellen Sie die FSC und SSC Spannungenum die Zellen des Grundstückes in der Mitte der Punktwolke. Zweitens einstellen FITC (GFP) Spannung, so dass alle Zellen unter 10 2 auf der logarithmischen x-Achse aufgetragen. Wird der Parameter FITC setzt die Grenze für Autofluoreszenz. </li><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen von Wildtyp-Mut mit Sytox erhalten wird. Stellen Sie die Pacific Blue Spannungswert und Tor zu identifizieren und zu getrennt lebenden Zellen von toten, Sytox-positiven Zellen in der Pacific Blue vs. FSC-A Streudiagramm. </li><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen aus der esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox erhalten und stellen Sie die FITC Spannung, um sicherzustellen, dass alle GFP-positiven Zellen werden innerhalb der Punktwolke dargestellt. </li></ol></li><li> Laden Sie die dissoziierten Zellen aus der esg -Gal4 erhalten, UAS-GFP Fliegenschnur mit Sytox aufgenommen. Stellen Sie die Pacific Blue Spannungswert und Tor zu identifizieren und zu getrennt lebenden Zellen von toten, Sytox-positiven Zellen (Gate P1). <ol><li> Stellen Sie die SSC-A und FSC-A-Gate, um die GFP zu identifizierenpositiven Zellen (basierend auf dem Histogramm Grundstück) nach Größe und Granularität (Gate P2) bestimmt. </li><li> Stellen Sie den FSC-H und FSC-W Tor zu identifizieren und auszuschließen GFP-positive Zellen Dubletten anhand ihrer Größe (Gate P3). </li><li> Stellen Sie die SSC-H und die SSC-W Tor zu identifizieren und auszuschließen GFP-positive Zellen Dubletten auf der Grundlage ihrer Granularität (Gate P4). </li><li> Verwenden Tor P4, um die GFP-positiven Zellen in einem Histogramm Plot, der die Anzahl der Zellen (count) gegen GFP Intensität zeigt darzustellen. Zwei unterschiedliche Peaks von GFP-positiven Zellen sichtbar. Erstellen Sie ein Tor für jeden Peak (Toren P5 und P6). Gate P5 enthält die Zellpopulation, die ISCs angereichert ist und unabhängig von den anderen Zellen in Gate-P6 sortiert werden. </li><li> Back-Gate in einem Konturdiagramm zu überprüfen, ob die zwei verschiedene GFP-positiven Zellpopulationen enthalten lebende Zellen (vgl Tor P1) und Zellen in der richtigen Größe (vergleichen mit Tor P2). </li></ol></li><li> Die Zellen zu sortieren, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 600 &amp; # enthält181; l RNAlater Lösung. Die Sortierung erfolgt bei niedriger Durchflussrate durchgeführt (max. 2,0, 70 &amp; mgr; m Düse, 1.000 Veranstaltungen / sec, 70 psi) und unter Verwendung einer Zwei-Wege-Reinheit Art. </li><li> Nach Abschluss der Sortierung ist, sofort vortexen die sortierten Zellen kurz und die Reaktionsgefäße auf Eis zu halten, bis mit RNA-Isolierung oder andere nachgelagerte Anwendungen voran. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren zur ISCs von Jung und Alt erwachsenen Drosophila Mitteldärmen, die anschließend für die weitere molekulare Analysen wie Next Generation Sequencing verwendet werden können zu isolieren. FAC Sortierung der GFP-positive Zellpopulation von der esg -Gal4 hat UAS-GFP Fliegenschnur bereits von mehreren Gruppen 21,22 erreicht. Bis heute jedoch die Anwesenheit der zwei unterschiedliche Peaks von GFP-positiven Zellen wurde entweder vergessen oder unterbewertet. Wir zeigen, dass diese Trennung ist nicht nur zwei verschiedene Populationen von Zelltypen (ISCs und EBS), sondern auch, dass die beiden Spitzen der GFP-positiven Zellen bleiben während der Alterung deutlich getrennt. Diese Beobachtung ist äußerst relevant und wertvoll für Forscher Interesse an einem Studium Stamm- oder Vorläuferzellen während der Alterung. Isolierung der ISCs aus alten midguts wurde durch die Tatsache, dass es keinen molekularen Markerkombination auf ISCs in einem gealterten midgut identifizieren behindert. Die einzige Markierung, die unambiguously identifiziert ISCs in einem alten Mitteldarm ist Phospho-histone3 (PH 3), da ISCs sind die einzigen sich teilenden Zellen im Mitteldarm 12,13. Allerdings ist PH3 eine ungeeignete Marker ISCs zu isolieren, da die Anzahl der Teilungs Stammzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu niedrig ist, um einen angemessenen Betrag von ISCs für spätere Analysen zu erhalten. Die Fliegenschnur esg -Gal4, UAS-GFP ist die häufigste Fluglinie von Forschern, die ISC-Funktion, die Wartung und die Differenzierung zu studieren verwendet. Unser aktuelles Wissen über die molekulare Regulation der Homöostase ISCs basiert auf Studien, in denen spezifische Moleküle und Signalwege manipuliert wurden auf der Basis (in 7 überprüft). Daher fehlt uns noch das Wissen über die endogenen molekularen Veränderungen, die während des Alterns auftreten. Das hier beschriebene Verfahren schließt diese Lücke und basiert auf der Tatsache, dass ISCs können basierend auf ihrer Größe, Granularität und GFP-Intensität von erwachsenen midguts zu jedem Zeitpunkt während des Alterns, isoliert werden kann. WährendEtablierung und Optimierung dieser Methode gefunden, die folgenden Schritte entscheidend für eine zuverlässige Ergebnisse zu sein. Rund 200 Mut brauchen, um eine gute Menge von ISCs für FAC Sortierung erhalten seziert werden. Die Geschwindigkeit der Dissektion ist entscheidend und hängt von der individuellen Praxis. Eine ausgebildete Person kann 40 Eingeweide innerhalb von 20-30 min zu sezieren. Da GFP wird auch in den Malpighischen im esg -Gal4 ausgedrückt, UAS-GFP Fliege Linie, ist es wichtig, die Malpighischen vollständig aus dem Mitteldarm. Die seziert Mitteldärmen muss in einer kühlen Umgebung aufbewahrt werden, um den Abbau von Gewebe zu vermeiden und zu reduzieren RNAse-Aktivität im Gewebe. Deshalb müssen die seziert Mitteldärmen vom Sezieren Gericht in Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem 1x PBS / 1% BSA-Lösung nach maximal 20-30 Minuten übertragen werden und auf Eis gehalten. Jedoch sind die seziert midguts sollte nicht auf Eis für mehr als 2 Stunden vor dem Beginn der Gewebe Dissoziation mit Trypsin gelassen werden. Die efficilichen Ansatz ist es, so viele Partien von Fliegen wie möglich innerhalb dieser 2 Stunden zu zerlegen, dann starten Sie das Trypsin zu verdauen für diese Chargen. Wenn mehr midguts benötigt werden, können sie während der Inkubationszeiten des Trypsins Verdau präpariert werden. Obwohl Trypsin ist eine sehr potente Enzym und könnte nachteilige Auswirkungen auf Zellen haben wir noch erhalten genug Lebens, gesunde Zellen für die anschließende Sortierung FAC. Der entscheidende Schritt der Prozedur, die für die Isolierung von intakten Zellen ermöglicht ist, dass die dissoziierten Zellen von der Trypsin-Lösung alle 30 Minuten entfernt. Wenn die seziert Mitteldärmen für 2 ½ Stunden in einer Trypsin-haltigen Lösung bei Raumtemperatur inkubiert, beobachteten wir einen Anstieg von 20-30% in tot, Sytox-positiven Zellen. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß die Trypsinlösung wir enthält EDTA. Die Anwesenheit von EDTA wahrscheinlich erleichtert Gewebszerfall Chelatisierung für die ordnungsgemäße Funktion der extrazellulären Matrixmoleküle benötigt Calcium und Magnesiumionen. </p&gt; Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Art ISCs von Jung und Alt Mut sind die entsprechenden Anfangseinstellungen der FACS und Gating-Parameter mit den beschriebenen Kontrollen und im Anschluss an eine bestimmte Sortierhierarchie. Wir führten die FAC Sortierung auf einer ARIA II Durchflusszytometer (FACSDiva Software). Es ist wichtig, dass das Gerät auf mindestens eine Stunde vor der Sortierung zum Aufwärmen der Laser ausgeschaltet. Zu beachten ist, wenn FAC Sortierung von ISCs wird zum ersten Mal durchgeführt wird, unter Verwendung der oben genannten Kontrollen festgelegt werden die Parameter für das Sortieren und für die Entschädigung müssen: (1) dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen ohne Zusatz von Sytox - die Einstellung dieses Parameters (Schritt 4.4.1) verhindert Sortieren von Zellen auf der Basis ihrer Eigenfluoreszenz; (2) dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen mit Sytox hinzugefügt - die Einstellung dieses Parameters(Schritt 4.4.2) ermöglicht Trennung Toten aus lebenden Zellen (abgestorbene Zellen haben eine hohe Autofluoreszenz und die sortierten GFP-positiven Zellen kontaminiert); (3) dissoziierten Zellen aus Mitteldärmen des esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox - sorgt für die Einstellung dieses Parameters (Schritt 4.4.3), dass alle GFP-positiven Zellen werden innerhalb der Punktwolke dargestellt. Wenn diese Parameter nicht richtig eingestellt ist, wird der sortierten Zellpopulation wahrscheinlich enthalten toten Zellen und Zelltrümmer (5B, C), viele GFP-positiven Zellen wird uns fehlen (5D) und die zwei deutliche Spitzen für GFP-positiven Zellen als im Histogramm Grundstück aus sieht (2E und 3E) werden nicht erkannt. Sobald die FACS und Gating-Parameter eingestellt sind, wird das Gerät kalibriert und bereit, Zellen aus der esg -GAL4, UAS-GFP Fliegenschnur zu sortieren. Da diese Parameter können gespeichert, alle künftigen Sortierung Sitzungen für ISCs und EVG von der esg -GAL4, UAS-GFP Fliegenschnur aus Schritt 4.5 starten. Obwohl die Wahl der &quot;Reinheit&quot; Modus und Durchführen einer Zweiwege-Reinheit Art verringert die Anzahl von Zellen sortiert, ermöglicht es eine höhere Sortier Stringenz (Schritt 4.6 und 4B, C). Zu beachten ist, ist der Vorteil der Verwendung Sytox statt Propidiumiodid, um tote Zellen zu kennzeichnen, dass es nur eine geringe Übergreifen in die FITC (GFP) Kanal, der es einfach, für die Spillover-Ausgleich macht. Unser Verfahren zum Anreichern ISCs und EBs jeweils auf das Sortieren der Zellen gemäß den verschiedenen GFP-Expressionsniveaus basieren. Mag sein, dass während der Alterung der misdifferentiated EVG auch Ausdruck GFP auf einem niedrigeren Niveau und konnte sich irren als ISCs können. Da jedoch die sortierten Zellen in Größe und Granularität unterscheiden sich auch, glauben wir, dass unsere Sortierstrategie ist die am besten geeignete zu diesem Zeitpunkt für ISCs und EBs reichern. Auch ist es bekannt, dass Zellen in einer alternden midgut Halte ISC Identität haben einen kleinen Kern 15. Um mehr Klarheit über die Identität der sortierten Zellen zu erhalten, kann man Zellen aus einem transgenen Fliege Linie, die esg -GAL4 trägt, UAS-GFP und einem Notch-Signal Reporter-Transgen zu sortieren. Seit Notch hat sich gezeigt, nur aktiv in den EVG 12,13 sein, isoliert ISCs von einem jungen Mitteldarm wäre negativ für die Notch-Reporter, während die EVG wäre positiv für den Notch-Reporter. , Während der Alterung Notch-Signalweg wird jedoch aberrante im Mitteldarm Gewebe. Daher muss sie geprüft, ob dieser Versuchsanordnung ist in der Tat mehr als zuverlässig zwischen ISCs und EVG unterscheiden getrennt von einem alten Mitteldarm werden. Wir haben dieses Konzept bereits für vergleichende Transkriptom Analyse der ISCs beschäftigt von jung und alt Mitteldärmen und nennt eine Reihe von Faktoren, die unterschiedlich reguliert werden während des Alterns (uv. Observ.). Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren zur Analyse der Unterschiede in der Genexpression zwischen ISCs und EBs. Eine solche Untersuchungs wird Einblick in die ersten molekularen Veränderungen, wie eine Zelle die Differenzierung tritt auftreten. Auch die Isolierung der EVG bei Alterung und weiteren Analysen Aufschluss über die molekularen Veränderungen der altersbedingte Fehldifferenzierung zu vergießen. Außerdem kann dieses Verfahren mit anderen genetischen Werkzeugen in Drosophila verwendet, um Genfunktion kombiniert werden. Zusammenfassend bietet diese Methode eine unvoreingenommene Herangehensweise an molekularen Merkmalen sowie Änderungen der ISCs und EVG während der Alterung zu untersuchen. Dies ist ein wertvolles Werkzeug, Erforschung von Alterungsmechanismen in adulten Stammzellen und Vorläuferzellen erleichtert.

Eine unvermeidliche Folge des Älterwerdens ist die abnehmende Fähigkeit der Gewebe und Organe funktionsfähig bleibt. Adulte Stammzellen sind für die Aufrechterhaltung Gewebshomöostase und Organfunktionen, aber wie Organismen Alter, die Stammzellen als auch einen Rückgang der biologischen Verhalten. Dies ist besonders schädlich für Gewebe, die eine hohe Umsatzrate aufweisen, wie das Darmepithel. Kennzeichen der im Alter von Stammzellen gehören genomische Beschädigung, verminderte Reparaturmechanismen, gestörte Regulation des Zellzyklus und fehlregulierte Signalwege, die alle auf den normalen Stammzellen Verhalten (in 1-3 überprüft). Durch die Manipulation spezifische Signalwege oder umzuwerfen bestimmter Gene haben wir Einblick in ihre Rollen bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der normalen Stammzellverhalten gewonnen. Da die meisten dieser Experimente sind Kandidatenmolekül Ansätze, wir haben sehr wenig Wissen über die körpereigenen molekularen Veränderungen, die während der in Stammzellen auftretenAltern. Ein Weg, um diese Frage zu nähern, ist es, das Transkriptom von jungen Vergleichen gegenüber alten Stammzellen Moleküle, deren Expressionsprofil ändert sich deutlich während der Alterung zu identifizieren. Leider haben die biologischen und technischen Herausforderungen unserer Fortschritte bei diesem Ansatz bisher behindert. Drosophila melanogaster ist ein gut geeigneter Modellorganismus, um Alterung zu untersuchen, da sie eine kurze Lebensdauer (ca. 60-70 Tage) und Exponate Alterungs Phänotypen (in 4 überprüft). Darüber hinaus kann der Alterungsprozess in Drosophila durch Temperatur beschleunigt werden. Bei der Haltung die Fliegen bei 29 ° C kann ein Alter von Phänotyp im Darmgewebe bereits nach 15 Tagen 5 beachten. Weiterhin ist Drosophila zugänglich für eine Vielzahl von genetischen Manipulationen. Insbesondere hat die Drosophila midgut als ausgezeichnetes Modellsystem entstanden, um den Einfluss der verschiedenen Signalwege und Umweltprobleme zu studierendie Biologie der Darmstammzellen (ISCs) während des Alterns (in 6-10 prüft). Die Drosophila Darmepithel eine hohe Fluktuationsrate und wird alle zwei Wochen bei Frauen im Monat bei Männern 11 erneuert und etwa einmal. ISCs mit Wohnsitz in der Drosophila Mitteldarm haben die Fähigkeit sich zu teilen und produzieren eine Selbst erneuert ISC und eine post-mitotischen Vorläuferzellen genannt enteroblast (EB) 12,13. Die EB unterscheidet entweder in einem saugfähigen Enterozyten oder einen sekretorischen enteroendokrinen Zelle. Zu diesem Zeitpunkt ist die einzige Markerkombination, die eindeutig markiert einen ISC ist die Expression des Transkriptionsfaktors escargot (ESG) und der Notch-Liganden Delta (DL) 14. Dies ist jedoch nur gilt für einen jungen und gesunden Darm. Während der Alterung wird der Mitteldarm-Epithel durch eine Erhöhung der Proliferations ISC 15-17 gekennzeichnet. Zusätzlich stört aberrante Notch-Signal das Schicksal Entscheidung des ISC Tochterzellenund induziert Fehldifferenzierung des EVG 15. Dies führt zu einer Ansammlung von Zellen, die für Notch-Signalweg und Co-express esg und DI aktiv sind, so DI Ausdruck nicht aus, um bona fide Stammzellen zu identifizieren in einer alten Mitteldarm-Rendering. Die Schwierigkeit bei der Identifizierung von echten ISCs hat die Fähigkeit, die endogene Veränderungen Alterungs ISCs bisher untersuchen behindert. Wir haben dieses Problem durch die Nutzung des esg -Gal4, UAS-GFP transgenen Fliege Linie, in der die Höhe der GFP-Expression in ISCs und EVG ist von Natur aus anders und bleibt während Alterung verschiedenen gangen. Ein ähnlicher Ansatz wurde für die Isolierung von Larvenneuroblasten und Neuronen 18,19 beschrieben. Mitteldärmen von Jung und Alt esg -Gal4, UAS-GFP Fliegen wurden seziert und in Einzelzellen dissoziiert. Die Zellen wurden dann für GFP-positiven Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert. Interessanterweise ist die sortierten GFP-positive cEllen in zwei deutliche Spitzen basierend auf GFP-Fluoreszenzintensität verteilt (GFP hohen und niedrigen GFP). Außerdem ist die Verteilung der GFP-positiven Zellen in den beiden Peaks auch bei Zellgröße korreliert: Die Zellen, die niedrige GFP Intensität zeigten waren klein und weniger körnig während Zellen mit hoher GFP Intensität waren größer und granular. Diese Beobachtung legte nahe, dass die kleineren ISCs konnte von den größeren EVG mittels FACS auf Basis von GFP-Intensität und die Auswahl geeigneter Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC) Einstellungen unterscheiden. Interessanterweise blieben die beiden Peaks deutlich beim Altern getrennt. Außerdem ist das Verhältnis der zwei Peaks verändert in einer Weise, die die oben genannten Merkmale der Alterung midguts reflektiert, nämlich daß die Anzahl von großen, misdifferentiated EBs Zeit zunimmt. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass durch die Sortierung für GFP-positiven Zellen unter Verwendung der geeigneten FACS Parametereinstellungen, die wir für ISCs und EBs zu jedem Zeitpunkt d bereichernährend Alterung. Zusammenfassend stellen wir eine FACS-Strategie, die Forschern die für zwei unterschiedliche Zellpopulationen, ISCs und EVG zu bereichern, von Drosophila Mitteldärmen jeden Alters und, diese Zellen für die weitere Analyse, wie Next Generation Sequencing. Diese leistungsstarke Methode ermöglicht die Untersuchung der endogenen molekularen Mechanismen, die untrennbar mit Alterung in einer angereicherten Population von Stamm- oder Vorläuferzellen sind. Die aus diesen Untersuchungen erhaltenen Daten werden zweifellos erleichtern die Identifizierung der konservierten Moleküle, die in alternden allen Spezies signifikant sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:105px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:197px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Forceps: Dumont, Inox Biologie #5</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:104px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">SefarNitex 03-150um/38 (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td style="width:105px;">Sefar</td>
			<td style="width:104px;">3A03-0150-102-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:105px;">Heidolph</td>
			<td style="width:104px;">543-42210-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:105px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">15400-054</td>
			<td>Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S34857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">AM7023</td>
			<td>&#160;other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">FACSAria II cell sorter</td>
			<td style="width:105px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Turn on one hour prior to sorting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Um zwischen 50.000-100.000 Zellen von FAC Sortierung, zwischen 160 und 200 midguts erhalten müssen seziert. Offensichtlich ist dies der zeitaufwendige Schritt des gesamten Verfahrens. Die in 1A gezeigten Cartoon zeigt die wichtigsten Schritte des Darms Präparation, die im Detail in den hier zur Verfügung gestellten Protokoll beschrieben sind. Dieses Verfahren kann individuell angepasst werden. A seziert gesamte Gastrointestinaltrakt ist in 1B gezeigt. Wenn alle der Mitteldarm Gewebe verdaut, sofort mit FAC Sortierung fortsetzen. Nach dem in dem Protokoll beschriebene Gating Strategie ermöglicht die erfolgreiche Identifizierung und Sortierung von einer Zellpopulation für ISCs und EBs angereichert aus jungen (Abbildung 2) und aus alten midguts (Abbildung 3). Die P1-Gate einstellen, dass nur gesunde lebende Zellen und Tor aus toten Zellen umfassen. Zellen, die über 10 3 auf der logarithmischen y-ax plottenwird bei der Verwendung des Pacific Blue Kanal als tote Zellen definiert. Die Punkte, die Handlung unter 40 auf der x-Achse (FSC-A) meist Schmutz und daher sind ebenfalls ausgeschlossen (Abbildung 2A). Im Streudiagramm der SSC-A gegen FSC-A werden die Zellen auf der Grundlage ihrer Größe und Granularität verteilt. Für eine optimale Auflösung, werden die Zellen in dem Streudiagramm angeordnet, wie in Figur 2B durch Einstellung der Photovervielfacherröhre (PMT) Spannung gezeigt. In den Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W Einzelzellen von Zuschlagstoffen und Dubletten, basierend auf Größe (2C) an Granularität (2D) getrennt und auf der Basis. Bei der Darstellung der im Tor P4 enthalten in einem Histogramm Plot, die klare Trennung von GFP-negative, GFP niedrig (Tor P5) und GFP Hoch (Tor P6) Zellen Zellen sichtbar ist (Abbildung 2E). Cells unteren GFP Intensität zeigen, sind klein und weniger körnig und stellen ISCs. Zellen, die höhere GFP intichte sind größer und körnige und stellen EVG. Reverse Transkriptase (RT) -PCR für Dl auf cDNA aus RNA synthetisiert von Zellen jedes GFP-positive Population (Gatter P5, P6) ergab, dass die DL-Signal auf den kleineren, GFP niedrigen Zellen tatsächlich stärker als in den größeren, GFP hohen Zellen (Figur 2H). Die Zellen wurden dann backgated und Konturdiagrammen dargestellt, um zu bestätigen, dass die GFP-niedrig (Gatters P5) und GFP hoch (Gatters P6) Zellen unterscheiden sich in der Größe und Granularität (2F) und sind noch am Leben (Figur 2G). Zu beachten ist, können die beiden Spitzen der GFP-positiven Zellen (GFP niedrigen und hohen GFP) nur gut unterschieden werden, wenn die FITC (GFP) Kanal kalibriert wurde ordnungsgemäß mit den im Protokoll beschriebenen Kontrollen. Die gleiche Strategie wurde Gating beim Sortieren ISCs aus alten Eingeweide (3) abgeleitet ist. Die Streudiagramme (Figure 3A-D) das Histogramm (3E) und die Kontur-Plots (3F, G) sind analog zu den in 2 gezeigten Wieder. Wie oben erwähnt, gibt es keine bona fide Marker ISCs in alten midguts und damit zu identifizieren kein RT-PCR-Daten werden hier vorgestellt. Allerdings ist der interessante Beobachtung, dass hier die beiden Peaks enthält GFP niedrig (Gate P5) oder GFP hoch (Gate P6) Zellen bleiben deutlich während der Alterung abgetrennt. Ferner kann die Anzahl von Zellen in der GFP hoch (Gate P6) Peak signifikant während des Alterns, was eindeutig emuliert den bekannten Akkumulation misdifferentiated EBs mit dem Alter zunimmt. Die Veränderung des Verhältnisses der beiden Zellpopulationen können auch in den Streudiagrammen ersichtlich ist (vergleiche 3A-D mit 2A-D) und in den Konturdarstellungen (vergleiche Figur 3F, G mit 2F, G). Aus diesen Befunden schließen wir, dass durch die Sortierung für GFP-positiven Zellen mittels FACS wir für ISCs und EVG in jung und alt Mitteldärmen bereichern können. Um die Reinheit des isolierten ISCs und EVG zu validieren, wurde ein Postsortieranalyse (Abbildung 4) durchgeführt. Die Histogramm Plot des post sortiert ISCs und EVG (4B, C) ​​zeigen Reinheiten zwischen 95% und 98%. Wenn die Hierarchie der Einstellung der FACS-Parameter, wie oben beschrieben wird strikt eingehalten, können die zwei verschiedenen Zellpopulationen (GFP niedrig, klein und GFP hoch, größer) bereits in einem Streudiagramm GFP vs. FSC-A (5A) zu unterscheiden. Diese beiden Zellpopulationen nicht unterschieden werden können, wenn diese Hierarchie berücksichtigt (5B-D). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig1highres.jpg" /> Figur 1: (A) Eine schematische Darstellung der wesentlichen Schritte Disse&#39;schenfesselndes die Fliege Darm. Zuerst wird der Kopf entfernt (Entfernen der Flügel ist optional), gefolgt von einer Trennung des Thorax und Abdomen, um den Darm freizulegen. Der Darm wird anschließend aus dem Körperhohlraum in den folgenden Schritten befreit. Die schwarzen Pfeile zeigen das Fortschreiten der Dissektion, während die dunkelrote Pfeile bezeichnen die Zugrichtung. Die roten Linien im letzten Bild zeigen die vorderen und hinteren Grenzen der Mitteldarm. (B) Ein Lichtmikroskopische Aufnahme der erwachsenen Fliege Darm. Die wichtigsten Regionen und anatomische Merkmale sind beschriftet. Rote Linien kennzeichnen die Grenzen des Mitteldarms. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig2highres.jpg" /> Abb. 2: FAC Sortierstrategie zu identifizieren und zu isolieren ISCs und EVG von jungen (7 Tage) Mitteldärmen Zur besseren Veranschaulichung Zellen, die ISCs sind rot markiert und die Zellen, die EVG werden hervorgehobenin blau in der Streudiagramme (AD) und in der Kontur-Plots (F, G). (A) Die P1 Tor wird sich tot, Sytox-positiven Zellen über 10 3, aufgetragen auf der logarithmischen Y-Achse aus. Die Schwelle des FSC-A wird auf 40 gesetzt, um auch tote Zellen und Trümmer aus. (B) Die Zellen wurden für FSC-A und SSC-A gated an Zellen nach Größe und Granularität (Gate P2) zu wählen. Das Histogramm Plot (E) wurde parallel verwendet, um die GFP-positiven Zellen in der FSC-A vs. SSC-A Streudiagramm (B) zu identifizieren. (C, D) Die Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W dienen, Aggregate und Dubletten entfernen, und wählen Sie für Singuletts (Gate P3 in C und Gate P4 in D). (E) Das Histogramm Plot zeigt die Anzahl der Zellen und ihrer GFP Intensität. Zwei Peaks, GFP niedrig (Gate P5) und GFP hoch (Gate P6) unterschieden. (F, G) Die Zellen wurden in einer Konturdarstellung Back-Gate, um sicherzustellen, dass die zwei verschiedenen GFP-positive Zelle populat werdenIonen sind in der richtigen Größe (F) auf und enthalten lebende Zellen (G). (H) Reverse Transkriptase (RT) -PCR für Dl auf cDNA aus RNA, die aus den im ersten Peak (Gate P5) enthaltenen Zellen isoliert, synthetisiert und in der zweiter Peak (Gate P6) sind. Mehr Dl Ausdruck könnte in Tor P5 vs. Tor P6 vorhandenen Zellen erkannt werden. Tubulin diente als Ladekontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: FAC Sortierstrategie zu identifizieren und zu isolieren, ISCs und EBs aus den alten (60 Tage) Mitteldärmen Zur besseren Veranschaulichung Zellen, die ISCs sind rot markiert und die Zellen, die EVG sind blau in den Streudiagrammen (AD) markiert und in der. Konturdiagramme (F, G). (A) Die P1-Gatter so eingestellt ist, tot, Sytox-positiven Zellen über 10 3, aufgetragen auf der logarithmischen y-Achse aus. Die Schwelle des FSC-A wird auf 40 gesetzt, um auch tote Zellen und Trümmer aus. Zu beachten ist, ist die altersabhängige Zunahme in größeren GFP-positiven Zellen bereits in diesem Diagramm auf der Hand. (B) Die Zellen wurden für FSC-A und SSC-A gated an Zellen nach Größe und Granularität (Gate P2) zu wählen. Das Histogramm Plot (E) wurde parallel verwendet, um die GFP-positiven Zellen in der FSC-A vs. SSC-A Streudiagramm (B) zu identifizieren. (C, D) Die Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W dienen, Aggregate und Dubletten entfernen, und wählen Sie für Singuletts (Gate P3 in C und Gate P4 in D). (E) Das Histogramm Plot zeigt die Anzahl der Zellen und ihrer GFP Intensität. Zwei Peaks, GFP niedrig (Gate P5) und GFP hoch (Gate P6) unterschieden werden können. Zu beachten ist, hat sich die Zellpopulation GFP Hoch mit größeren Zellen i erhöhtn Anzahl während des Alterns. (F, G) Die Zellen wurden in einem Konturdiagramm Back-Gate, um zu überprüfen, dass die zwei verschiedenen GFP-positiven Zellpopulationen sind in der richtigen Größe (F) und enthält lebende Zellen (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um sehen eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig4highres.jpg" /> Abb. 4: Ein Postsortieranalyse wurde von den jungen (7 Tage) und alte geführt, um die Reinheit des isolierten ISCs und EVG zu ermitteln (A) GFP-positiven Zellen (60 Tage) Mitteldärmen waren FAC sortiert und in der Histogramm Plot zeigen ihre Verteilung in zwei Peaks basierend auf GFP Intensität. (B) Die Postsortieranalyse zeigt die Reinheit der isolierten ISCs von jung und alt Mitteldärmen, die&gt; 97% ist. (C) Das Postsortieranalyse von sortierten EBs von jung und alt Mitteldärmen zeigt eine Reinheit von&gt; 95%. Die leichte Verunreinigungen können aus Fluoreszenzlöschung oder mechanisch beschädigt GFP-exprimierenden Zellen durch wieder Sortieren der Zellen verursacht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: Beispiele für Streudiagramme, die suboptimal FACS-Daten, was gesehen wird, wenn die FACS-Parameter nicht richtig gesetzt zeigen (A) Repräsentative FACS Profile aller Zellen, wenn die FACS-Parameter richtig eingestellt wurden, basierend auf den im Protokoll beschriebenen Kontrollen.. Die Zellpopulation, die ISCs ist rot eingekreist und die Zellpopulation, die EVG ist blau eingekreist. Die grün eingekreist Zellen sind tote Zellen, die eine stärkere Eigenfluoreszenz im Vergleich zu habenlebende Zellen, die unter 10 3 auf der logarithmischen y-Achse aufgetragen werden. (B) Das Streudiagramm zeigt ein typisches Ergebnis erhalten, wenn die FACS Instrument nicht kalibriert. Keine GFP-positiven Zellen nachgewiesen werden. (C) Wenn der FSC nicht richtig eingestellt ist, werden die verschiedenen GFP-positiven Zellpopulationen nicht erkannt. (D) Wenn der FITC (GFP) Kanal nicht richtig eingestellt ist, die Mehrheit der GFP- positiven Zellen, die sortiert werden sollen, nicht in der Punktwolke, sondern am oberen Rand des Grundstücks aufgetragen. Auch in der hier gezeigten Handlung, die Grenze für Autofluoreszenz wurde nicht eingestellt, daher Zellen, das Grundstück über 10 2 auf der logarithmischen Y-Achse sind eigentlich autofluoreszierenden und könnte fälschlicherweise als GFP-positiven Zellen sein.

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Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

Isolieren von Stammzellen des Darms von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Mitteldärmen durch FACS, um Stammzellverhalten Studie während des Alterns

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

19.9K Aufrufe.  Universität Ulm. Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging. 

Serie: Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of excitement for treating injured and diseased tissues due to their impressive capabilities to undergo multi-lineage cell differentiation and their self-renewal ability. Most importantly, these qualities have made them advantageous for use in autologous cell transplantation therapies. The current protocol will introduce the readers to the modified preplate technique where soft tissues of the musculoskeletal system, e.g. tendon and muscle, are 1st enzymatically dissociated and then placed in collagen coated flasks with medium. The supernatant, which is composed of medium and the remaining floating cells, is serially transferred daily to new flasks. The stem cells are the slowest to adhere to the flasks which is usually takes 5-7 days (serial transfers or preplates) . By using this technique, adult stem cells present in these tissues can be easily harvested through fairly non-invasive procedures.

Isolating adult stem cells from musculoskeletal soft tissues based on the cell's adherence speed to flask.

Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...