Dank gebührt Genia Brodsky für Bild-Grafikprozessor; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, und Leonid Roitman für technische Beratung und Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Uncaging; Maayan Tahor und Suliman Elsadin für technische Hilfe, Uwe Strähle für die freundliche Bereitstellung der neurogenin1 Reporter Linie und Amos Gutnick für Kommentare zu diesem Manuskript. Israel Science Foundation (Grant-Nummer 928/08) und die Harriet &amp; Marcel Dekker Foundation; Die Forschung in der Levkowitz Labor wird durch die Deutsch-Israelische Stiftung (Förderkennzeichen 183/2007) unterstützt. GL ist ein Inhaber des Tauro Career Development Lehrstuhls für Biomedizinische Forschung.

Wir beschreiben ein Protokoll der Markierung von Zellen mit Käfig Fluorescein, können jedoch auch andere photoaktivierbare Farbstoffe und Proteine ​​in ähnlicher Weise verwendet werden. 1. Die Injektion von Caged Fluorescein <ol><li> Bereiten Sie 5% Stammlösung (5mg Käfig-Fluorescein / 100 ul 0,2 M KCl) von Dextran-konjugierten 4,5-Dimethoxy-2-Nitrobenzyl (DMNB) caged Fluorescein (10.000 MW Dextran, anionische, Invitrogen, molekulare Sonden, Carlsbad, CA , cat. Nr. D-3310). Aliquotieren und lagern in -20 ° C. Beachten Sie, dass DMNB-Käfig Fluorescein lichtempfindlich und sollte im Dunkeln gehalten werden. </li><li> Bereiten Sie eine Injektion Trog 1% Agarose (Sigma, St. Louis, MO, cat. Nr. A9539), wie in &quot;Der Zebrafisch Buch&quot; 1 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie 2 Liter E3 Medium durch Verdünnen einer 100 x E3 Stammlösung. </li><li> Am Abend vor der Injektion, bereiten Paarung Käfigen Trennung der männlichen (n) aus der weiblichen (n) des gewünschten transgenen Linie Ausdruck einer sichtbaren fluoreszierenden Wahrzeichen (GFP, RFP etc.) zur Lokalisierung der Zielzellen für Photoaktivierung. </li><li> Bereiten Kapillare Injektionsnadeln (Thin Wall Glaskapillaren mit Filament, World Precision Instruments, Sarasota, FL, cat. Nr. TW100F-6) mit einer Mikropipette Puller (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97). </li><li> Tauwetter ein Aliquot von 5% im Käfig Fluorescein auf Eis. </li><li> Verdünnen Sie die 5% Käfig Fluorescein Stammlösung in 0,2 M KCl bis zu einer Endkonzentration von 1%, und halten Sie auf dem Eis. Vermeiden Sie Belichtung. </li><li> Setup-Paarung Kreuze vorbereitet in Schritt 4. </li><li> Sammeln Sie die befruchteten Eier, sobald sie festgelegt sind. Orient one-Zell-Stadium Embryos in die Agarose Spritzgießwerkzeug mit E3 1 überlagert. </li><li> Mit einem Microloader Spitze (Eppendorf, Hamburg, Deutschland, Katze. Nr. 5242 956,003) Verfüllung einer Injektionsnadel mit ~ 1 ul 1% Käfig Fluorescein-Lösung. </li><li> Ort geladen Nadel in einem Mikromanipulator an einem gasbetriebenen Mikroinjektor (pneumatisch picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820). </li><li> Passen Sie das Injektionsvolumen zu 2-3NL und spritzen den Käfig-Fluorescein direkt in das Zellplasma. Anschließend muss ein Minimum von 50 Embryonen pro Versuch. </li><li> Inkubieren Embryonen im Dunkeln bei 28,5 ° C in E3, um die gewünschte Entwicklungsstadium. Wenn Embryonen älter als 24 Stunden nach der Befruchtung untersucht werden, fügen Sie 0,1% Phenylthioharnstoff (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Nr. 22290-9), um Pigmentflecken zu hemmen. </li></ol> 2. Embryo Montage <ol><li> Bereiten Sie frische E2-Lösung (siehe Lösungen Teil; kann bei 4 ° C für eine Woche gelagert werden). </li><li> Coat 60 mm Petrischalen mit einer dünnen Schicht von 1% Agarose in E2 Medium gelöst. </li><li> Bereiten Sie 2% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt (Ultra Pure LMP Agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, Kat. Nr. 16520100..) Für die Einbettung: Man löst die Agarose in sterilem doppelt destilliertem Wasser durch Mikrowellenheizung zum Kochen bringen. Halten Sie den Schlauch der Kappe öffnen während der Erwärmung. Aliquot 1 mL in Mikrozentrifugenröhrchen und halten in einem Heizblock bei 72 ° C. </li><li> Entfernen Sie das Chorion der Embryonen durch leichtes Ziehen des Chorion auseinander mit scharfen Pinzette (Nr. 5). Keep Embryonen in E2-Lösung auf einem Agar-beschichtete Schale (siehe Schritt 2). Dechorionated Embryonen sollten mit dem Feuer-poliertem Glas Pasteurpipette behandelt werden, da sie auf Polypropylen Pipette kann bleiben. Vermeiden Sie es, die dechorionized Embryo in die Luft als diese Embryonen durch die Flüssigkeit Oberflächenspannung beschädigt werden könnte. </li><li> Sammeln Sie die ausgewählten Embryo in einem kleinen Volumen E2 mit einem Feuer-poliertem Glas Pasteurpipette und Ort der Embryo auf 60 mm Petrischale. Montieren Sie einen Tropfen (~ 150 mL) von 2% Agarose (Schritt 3) neben dem Embryo. Schnell mischen die zwei Tropfen zu einem homogenen letzten ~ 1% igen Mischung zu erhalten und mit einem Binokular Orientierung der Embryo mit seiner dorsalen Seite nach dem Objektiv. </li><li> Warten Sie, bis die Agarose erstarrt ist, und fügen E2 medium bis die eingebettete Embryo in Flüssigkeit eingetaucht ist. Es wird bevorzugt auf einen einzigen Embryo pro Schale erhalten, wie es aus der Agarose nach der Photoaktivierung freigesetzt werden. </li></ol> 3. Photoaktivierung <ol><li> Wir verwenden ein Zeiss LSM 510 META NLO Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Breitband-abstimmbaren (700-1020nm) Mai Tai-HP-Femtosekunden-Laser aus SpectraPhysics ausgestattet. </li><li> Setzen Sie den montierten Embryo auf einem Teller Halter unter dem Mikroskop. Die fluoreszierenden Meilenstein in der Embryo wird visualisiert 40x/0.8W Achroplan Wasser getaucht Ziel. Für die folgenden Schritte, die wir verwenden nicht-descanned Detektor (NDD) mit Bandpassfilter (BP) von 500-550nm. </li><li> Als Voraussetzung für die Photoaktivierung Prozess erhalten räumliche fluoreszierenden Informationen der Region von Interesse durch den Erwerb von Bildserien aus den ventral nach dorsal Teil des detektierten Fluoreszenzsignal mit Zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge von 860nm (für GFP-Detektion). Zu diesem Zweck kann eine ausreichende Auflösung unter Verwendung einer Spannweite von 6μm zwischen den einzelnen erworbenen Brennebene werden. </li><li> Wählen Sie das Zielz-Ebene für die Photoaktivierung und bringen diese Region in den Fokus. Je nach Zweck des Experiments kann die Region von Interesse entweder innerhalb oder außerhalb der GFP sichtbares Wahrzeichen werden. Nehmen Sie ein einzelnes Bild in diesem z-Ebene. Speichern Sie das Bild und halten Sie sie öffnen sich in einem separaten Fenster. </li><li> Stellen Sie die Zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge 720 nm und wenn der Laser in modengekoppelten öffnen Sie das &#39;Edit bleach &quot;-Menü ist. Definieren Sie die Region of Interest (ROI) für die Photoaktivierung nach dem Bild bei 860nm (Schritt 4) mit dem &quot;Define Region&quot;-Menü. Es ist entscheidend, um den ROI auf das Bild nach der Verschiebung der Wellenlänge des Lasers bis 720 nm, wie diese Aktion ändert die x-, y-Positionen der beobachteten Feld auszuwählen. </li><li> Passen Sie die folgenden Parameter für Photoaktivierung in der &#39;Edit bleach &quot;-Menü (siehe Schritt 9): a) relativ Laserleistung; b) Anzahl der Iterationen; c) Scan-Geschwindigkeit. </li><li> Drücken Sie &#39;Bleach&#39; in der &#39;Edit Bleiche &quot;Fenster und bis der Laser aufhört zu warten. </li><li> Wechseln Sie wieder zu 860nm, erwerben eine einzige Ebene Bild, um die Intensität des resultierenden photoaktivierte Material und eine zweite Reihe von Bildaufnahme, die Z-span (Dicke) der aktivierten Domain bewerten zu bewerten. </li><li> Betrachten Sie die folgenden Parameter für Photoaktivierung: <ol class="lalpha"><li> Man sollte empirisch ermitteln die optimalen Bedingungen für die Photoaktivierung durch Variation zwei Parameter: Laser-Intensität und Dauer der Photoaktivierung. Die relative Laserleistung kann durch den akusto-optischen Modulator (AOM) Übertragung gesteuert werden. Die Dauer der Photoaktivierung ist eine Funktion der Anzahl der Iterationen und Scan-Geschwindigkeit. </li><li> Bestimmen Sie den linearen Bereich der Fluoreszenz-Intensität, um die Sättigung des uncaged Fluoreszenz zu vermeiden. </li><li> Es gibt eine lineare Korrelation zwischen den erhaltenen Fluoreszenz-Intensität des uncaged Moleküle und die z-Achse Spannweite der photoaktivierte Klon 2. </li></ol></li></ol> 4. Nachweis der Uncaged Fluorescein <ol><li> Nach Photoaktivierung, heben die Embryonen im Dunkeln bei 28,5 ° C in E2-Medium mit 0,1% PTU, um das Aussehen der Pigmentierung der Haut zu verhindern. </li><li> Bei der gewünschten Entwicklungsstadium, entfernen Sie den Embryo aus der Agarose unter einem Binokular. Mit einem spitzen Skalpell, ein &quot;V&quot;-förmigen Einschnitt in die Agarose in der Nähe des Embryo, so dass die &quot;V&quot; ist auf den Embryo Kopf zeigt. Legen Sie eine geschlossene Pinzette an der Spitze des &quot;V&quot; in der Nähe des Kopfes des Embryos und vorsichtig öffnen Sie die Zange Trennung der Agarose entlang der Länge des Embryos und die Freigabe der Embryo in das Medium. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen mit einem feuerpolierte Pasteurpipette und fix mit Paraformaldehyd (PFA, 4% in 1 x PBS, pH 7,2) entweder für 3 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Fixierlösung und spülen Sie 2-3 mal in PBST für mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wash Embryonen mit 100% Methanol für 10 min, füllen mit frischem Methanol und Inkubieren bei -20 ° C für mindestens 2 Stunden. </li><li> Rehydrieren Embryonen durch aufeinanderfolgende Inkubationen (5 min jeweils) in einer Reihe von verdünntem Methanol in PBSTr: 80%, 60%, 40% und 20%. Wash 2 x 10 Minuten in PBSTr. </li><li> Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 500 ul der Blocking-Lösung. </li><li> Fügen Sie ein Anti-Fluorescein-alkalische Phosphatase (AP) Fab-Fragmente (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nr. 11426338910), verdünnt 1:500 in Blocking-Lösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C (statt Mikrozentrifugenröhrchen auf ihren Seiten) . </li><li> Wash 5 x 15 Minuten in PBST. </li><li> Wash für 5 Minuten in 0,2 M NaCl in TNT. </li><li> Wash für 5 Minuten in 0,4 M NaCl in TNT. </li><li> Lösungen 3 x 5 Minuten in frisch zubereiteten Prestain Lösung. </li><li> Lösen Sie eine Fast Red Tablette (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nr. 11496549001) in 2 mL Prestain Lösung. Es wird empfohlen, die Lösung mit Whatman Nr. 2 Papier zu un-gelösten Teilchen weglassen Filter. Alternativ-Spin-Down-Lösung und die klare Flüssigkeit. </li><li> Add 500 mL Fast Red-Lösung in jedes Röhrchen im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren und überwachen Farbentwicklung, bis das gewünschte Signal-Hintergrund-Verhältnis erreicht ist (20 Minuten bis zu mehreren Stunden). Wenn Hintergrund entwickelt, bis 4 Transfer ° C. Nach einer Stunde Inkubation mit einem neuen Fast Red-Färbelösung wieder aufzufüllen. </li><li> Stoppen Sie die Farbreaktion mit 3 x 5 Minuten Waschen in PBST. </li><li> Fix für 20 Minuten in 4% PFA bei Raumtemperatur. </li><li> Wash 2 x 5 Minuten in PBST. </li><li> Klare Embryonen durch eine Reihe von 25%, 50% und 75% Glycerin in PBS bis Embryonen werden am Ende des Rohres nieder. Embryonen können bei 4 ° C für ein paar Tage gelagert werden. </li></ol> 5. Fluorescent Visualisierung der Uncaged Bereich <ol><li> Bereiten Sie einen Objektträger für die Montage: mit einer 1 ml Spritze gelten vier Punkten klarer Silikonfett auf der Folie, in einem Abstand von ~ 15mm voneinander entfernt. Montieren Sie den Embryo in der center in ~ 200 ul von 75% Glycerin und setzen Sie ein Deckglas (Nr. 0; 18x18mm) auf der Oberseite und schieben Sie es gegen das Silikon, bis die Glycerin-Lösung nimmt eine Fläche zwischen den Folien. </li><li> Setzen Sie den montierten Embryo auf die Bühne und bringen sie in den Fokus mit einem 40x-Objektiv. Erwerben eines konfokalen Z-Serie von Bildern mit 488nm und 543nm Argon HeNe-Laser als Anregungsquelle. </li><li> Die z-Achse Spannweite der photoactivatated Domain kann unter Verwendung 3D-Rekonstruktion der uncaged Embryo mit Hilfe eines Bildanalyse-Software. </li></ol> 6. Lösungen <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mm NaCl, 21mm KCl, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Sterilisieren durch Filtration und lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0,3 M NaCl, 10 mM KCl, 20 mM CaCl 2 * 2HOH, 20 mM MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 * 2HOH, Filtrat und speichern in Raumtemperatur </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> Verdünnen Sie 20 x E2 in doppelt destilliertem Wasser und frisch zubereitete hinzufügen NaHCO 3 (bis zu einer Endkonzentration von 0,7 mm), Penicillin und Streptomycin (verdünnte Stift Strep-Lösung auf eine Endkonzentration von 1 x die 100U von Penicillin und Streptomycin 100mg pro ml (Invitrogen enthält , Carlsbad, CA, cat. Nr. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0,1% Tween-20 in PBS </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> 0,3% Triton in PBS </td></tr><tr><td> Blocking-Lösung </td><td> 10% BSA, 0,3% Triton, 1% DMSO in PBS </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100 mM Tris-HCl pH-7.5, 150 mM NaCl, 0,5% Tween-20 in doppelt destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> Prestain Lösung </td><td> 100 mM Tris-HCl pH-8.2, 0,4 M NaCl, 0,1% Tween-20 in doppelt destilliertem Wasser </td></tr></tbody></table> 7. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für die Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie an Agenten in einem lebenden Zebrafisch-Embryos photoaktivieren vorgestellt. Mit einem ähnlichen Ansatz, den wir bisher verfolgt die Linie der photoaktivierte gekennzeichnet neuronalen Vorläuferzellen im Zebrafisch Gehirn 2,3. Abbildung 1 zeigt Photoaktivierung von einem umzäunten Fluorescein-konjugierten Markierungsfarbstoff in vorderen Neuralplatte der Zebrafisch-Embryonen Tragen einer neurog1:: GFP-Reporter-Transgen, das als Live-intrinsische Wahrzeichen diente. Die Embryonen wurden mit Käfig Fluorescein auf der einen Zell-Stadium injiziert und eingebettet in Agarose bei Knospe. Bei 3 bis 5-Somiten-Stadium die räumlichen Koordinaten wurden in den neurog1 gemessen:: gfp transgenen Embryos in die Region of Interest (ROI) für Uncaging (Abbildung 1A, A &#39;) zu bestimmen. Wir uncaged die Fluorescein Linie Tracer in einer bestimmten Domäne der Neuralplatte (Abb. 1B, B &#39;). Anschließend wurde das Schicksal dieser gegebenen gekennzeichnet neuralen Vorläuferzellen Subdomain bei prim5 (24 Stunden nach der Befruchtung) Stufe durch Immunfärbung der uncaged Fluorescein (Abbildung 1C, C &#39;) bestimmt. Das Ausmaß der Zwei-Photonen-Laser-Uncaging, dh die Intensität des uncaged Fluoreszenz und die Dicke der photoaktivierte Domain (z-span), kann durch Verstellen zwei Parameter gesteuert werden: Laser-Intensität und Dauer. Letzteres kann durch Anpassung der Iteration Nummer und Scan-Geschwindigkeit gesteuert werden (siehe Teil 3, Schritt 9; Russek-Blum, 2009). In dem Beispiel in Abbildung 1 dargestellt, haben wir relativ Laserleistung von 12% AOM Transmission, 20 Iterationen und Scan-Geschwindigkeit von 25,6 us / Pixel. Mit diesen Einstellungen haben wir beschriftet einen ROI mit 9-10 Zellen und einer photoaktivierte z-Spannweite von 30 um (~ 1-2 Zellreihen). <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein repräsentatives Ergebnis der Photoaktivierung von caged Fluorescein in Live Zebrafischembryo mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Schematische Darstellung (AC) und repräsentative Bilder (A&#39;-C &#39;) der Photoaktivierung Prozess. Live-Zebrafischembryo (A, A &#39;), die GFP unter der Kontrolle von Neurogenin-1-Promotor (neurog1:: gfp), die mit Käfig Fluorescein Markierungsfarbstoff an der 1-Zell-Stadium injiziert wurde. Bei der 3-5 - Somiten-Stadium wurde ein diskreter Bereich des Vorderhirns Primordium (Zwischenhirn) photoaktivierte und die uncaged Fluorescein Markierungsfarbstoff nachgewiesen werden (B, B &#39;) werden. Im Anschluss an die Photoaktivierung Verfahren wurde der Embryo bei 28,5 ° C inkubiert und Gehirnzellen mit dem uncaged Fluorescein durch anti-Fluorescein Immunfärbung wurden 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf; C, C &#39;) zurückgeführt. Dien, Diencephalon;. Tel, Telencephalon..

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+(Brachydanio+rerio.">The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio.</a> , (1995).</li><li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon.">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li><li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning.">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li><li>Kozlowski, D. 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Foto-aktivierbaren Verbindungen sind Moleküle, deren Funktion es ist maskiert, bis sie mit einer bestimmten Wellenlänge (in der Regel UV), induzieren eine photochemische Reaktion, dass die Moleküle umgewandelt in eine biologisch oder chemisch aktiven Zustand sind beleuchtet. Diese Sonden liefern eine sehr mächtige Werkzeuge in der zellbiologischen Forschung, da die Aktivierung genau gesteuert werden zeitlich und räumlich durch die Begrenzung ihrer Belichtung. Der wesentliche Vorteil der...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

Photoaktivierung von Zielverbindungen in einem lebenden Organismus hat ein wertvoller Ansatz erwiesen, um verschiedene biologische Prozesse wie der embryonalen Entwicklung, zelluläre Signalwege und Erwachsenen Physiologie zu untersuchen. In dieser Hinsicht ermöglicht die Verwendung von Multi-Photonen-Mikroskopie quantitative Photoaktivierung von einem bestimmten Licht reagieren Agenten in tiefe Gewebe auf einer einzigen Zelle Auflösung. Als Zebrafischembryonen optisch transparent sind, kann ihre Entwicklung in vivo beobachtet werden. Diese Eigenschaften machen den Zebrafisch einen perfekten Modell-Organismus für die Steuerung der Aktivität einer Vielzahl von chemischen Stoffen und Proteine, die durch konzentriertes Licht. Hier beschreiben wir den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Aktivierung von chemisch Käfig Fluorescein, was wiederum ermöglicht es uns, Zell-Schicksal in lebenden Zebrafisch-Embryonen folgen zu induzieren. Wir verwenden Embryonen Ausdruck einer Live-genetische Wahrzeichen (GFP) zu lokalisieren und zielgenauer alle Zellen von Interesse. Dieses Verfahren kann in ähnlicher Weise für präzise Licht induzierte Aktivierung von Proteinen, Hormonen, kleinen Molekülen und anderen Käfig-Verbindungen verwendet werden.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science. Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Serie: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...