We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. Herstellung der Lösung <ol><li> Bereiten 5 ml &quot;SUV Puffer&quot;, der 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) oder Tris (pH 7,5) und 2 mM Trehalose. Filtern des Puffers mit einer 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter und teilen sich in 1 ml Aliquots, die bei -20 ° C gelagert werden kann. HINWEIS: Weitere Einzelheiten für Reagenzien und Instrumente werden in der Liste Materialien. </li><li> Bereiten Sie 40 ml GUV &quot;Wachstum Buffer &#39;, die die GUV Innenraum während der Film Rehydrierung füllen wird. Für eine &quot;Niedrigsalz&quot; Wachstums kombinieren 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) oder 1 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 400 mM Saccharose. Für eine &quot;physiologische Salzwachstums kombinieren 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) oder 5 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 200 mM Saccharose. </li><li> Vorbereitung 40 ml &quot;Observation Buffer &#39;für die externe Lösung im Versuchsraum durch die Kombination von 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) oder 5 mM TRIS (pH 7,5), und ~ 200 mM Glucose. HINWEIS: Diese Puffer sind nur examples. Siehe die Diskussion um die Puffer für andere Experimente anpassen. </li><li> Messen Sie die Osmolarität der Wachstum und Beobachtung Puffer mit einem Osmometer. Fügen Granulat von Saccharose oder Glucose, um ihnen zu entsprechen weniger als 1%, so dass GUVs nicht aufzulösen oder zusammenbrechen, wenn es von der Wachstumskammer zu der Beobachtungskammer übertragen. HINWEIS: In diesem Konzentrationsbereich, Zugabe von 1 mM an Saccharose (13,7 mg pro 40 ml) oder Glucose (7,2 mg pro 40 ml) erhöht Osmolarität von ~ 1 mOsm. </li><li> Filtern der Wachstum und Beobachtungs Puffer mit einem 0,2 um Filter und im Kühlschrank bei 4 ° C, um das Bakterienwachstum zu hemmen. </li><li> Man löst 50 mg von Beta-Casein in 10 ml 20 mM TRIS (pH 7,5) Puffer, einen notwendig, um die Oberflächen der Versuchskammern zu passivieren, so daß GUVs kleben nicht, die Ausbreitung und Burst 5 mg / ml beta-Casein-Lösung zu bilden. Sobald das beta-Casein vollständig (bei 4 ° C bis zu mehreren Stunden), Filter (0,2 um) darin gelöst in 0,5 ml Aliquote, die schockgefroren und gelagert werden können,bei -20 ° C für eine spätere Verwendung (aufgetauten Aliquots bei 4 ° C gelagert kann typischerweise bis zu einer 1 Woche verwendet werden). </li></ol> 2. SUV Vorbereitung <ol><li> Vorbereiten und einfrieren Aliquots der Proteo-SUVs im Anschluss an die bisher veröffentlichten detaillierten Protokoll 28. Verwenden KvAP fluoreszenz Alexa-488 Maleimid in DPhPC SUVs rekonstituiert (10 mg / ml) zu Lipid-Verhältnis von 1:10 (Masse) beziffert mit einem Protein. HINWEIS: Wildtyp KvAP enthält ein Cystein pro Monomer in der Nähe der intrazellulären C-Terminus (Aminosäure 247) befindet. </li><li> Leuchtstoff, Lipid-only SUVs: HINWEIS: Die beim Umgang Chloroform unter einer Abzugshaube tragen Nitril Handschuhe und Schutzbrille. Vermeiden Sie die Verwendung eines Kunststoff wie Chloroform sie aufzulösen. Chloroform-Lösungen können in Braunglasflaschen mit Teflon-Kappen gespeichert und übertragen mit Glasspritzen werden. Achten Sie darauf, alle Glaswaren mindestens 5 bis 10 mal mit Chloroform vor und nach dem Pipettieren Lipide spülen. <ol><li> Bereiten 100 ul10 mg / ml DPhPC SUVs, die 0,5 Mol-% des roten fluoreszierenden Lipids, Texas Red-DHPE, indem 100 ul DPhPC Lösung (10 mg / ml in Chloroform) mit 8,2 &amp; mgr; l von Texas Red-DHPE Lösung (1 mg / ml in Methanol) in einem 1,5-ml-Braunglasfläschchen. </li><li> Trocknen Sie die Lipide unter einem Stickstoffstrom in einem Chemieabzug während der Drehung der Flasche. Wenn der Film trocken zu sein scheint, legen die Lipide unter einem Vakuum für 3 h, um restliches Lösungsmittel zu entfernen. </li><li> 100 l SUV Puffer in die Lipide und kräftig vortexen bis kein Lipid bleibt an den Wänden des Röhrchens und die Lösung gleichmäßig milchig. </li><li> Beschallen die Lipid-Lösung für SUVs zu bilden. Stellen Sie die Flasche, bis es der Ultraschall bewirkt, dass die meisten Bewegung und fließen in das Fläschchen, und kümmern uns nicht um die Lösung unnötig erhitzen. Weiter Beschallung, bis die Lösung durchscheinend oder, wenn möglich, transparent (2-5 min zur Spitze Beschallung, ~ 20 Minuten für die Behandlung in einem Ultraschallbad). </li><li> Aliquot SUVs (beispielsweise 10 ul oder 20 ul) und Kühlschrank (-20 ° C) für eine spätere Verwendung. HINWEIS: Lipide, insbesondere ungesättigten Lipiden, kann leicht Zusammenbruch. Shop Lipidlösungen bei 20 ° C (oder 80 ° C) unter Argon und innerhalb von 6 Monaten. Lipidabbauprodukte mit Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden. </li></ol></li></ol> 3. GUV Wachstum von Elektroformation <ol><li> Bereiten Sie die Elektroformation Kammer. <ol><li> Wenn die Kammer nicht gereinigt wurde, entfernen Sie die Fenster, wischen Sie alle Dichtungsmasse und Fett, extrahieren Sie die Kabel, und spülen Sie und reiben Sie die Kammer mit mit Wasser und Ethanol (≥70%) abwechselnd ein Gewebe. </li><li> Reiben Sie die Drähte gut, tauchen die Drähte und Kammer in Aceton und beschallen für 5 min. Wischen Sie alles mit einem Gewebe wieder mit Aceton. Setzen Sie die Kammer in Ethanol und beschallen für 5 min. </li><li> Setzen Sie die Kammer, indem Sie die Kabel durch die Löcher und drehen, und wischen Sie die Kabel, um sicherzustellen, sie ARe sauber. Setzen Sie die Kammer mit destilliertem Wasser, beschallen für 5 min und die Kammer mit einem Strom von Stickstoff oder Luft trocknen. </li></ol></li><li> Vorbereitung 30 ul 3 mg / ml SUV-Suspension in SUV-Puffer. Zur Bildung proteinhaltigen GUVs kombinieren 8 ul Proteopolysaccharide SUVs (DPhPC 10 mg / ml KvAP 1:10), 2 ul von fluoreszierenden SUVs (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) und 20 ul SUV Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für eine abschließende Protein zu Lipid (Masse) Verhältnis von 1: 12,5 und 0,1 Mol-% TexasRed-DHPE. Mischen Sie die Lösung kräftig. <ol><li> Alternativ kann, um das Protokoll mit lipid nur SUVs Praxis einfach kombinieren 10 ul Fluoreszenz SUVs (10 mg / ml DPhPC und 0,5 mol% TexasRed-DHPE) mit 20 ul SUV Puffer. </li></ol></li><li> Zahlen Sie den SUV-Lösung. <ol><li> Verwenden Sie ein 2 ul Pipette oder 5 ul Glasspritze zu klein (&lt;0,2 ul) Tröpfchen der SUV-Lösung auf den Drähten zu hinterlegen. Etwa 1 ul der Lösung benötigt wird, um eine Reihe von Tropfen entlang bilden1 cm Draht. Achten Sie darauf, die Tropfen sind klein genug, und mit Abstand weit genug voneinander entfernt, dass sie sich nicht berühren oder die Sicherung. </li><li> Lassen Sie die abgeschiedenen SUVs trocknen für ca. 30 Minuten im Freien. Wenn alle Tropfen angesiedelt haben, drehen Sie den Draht, so dass die Lipidablagerungen lassen sich leichter mit dem Mikroskop beobachten. HINWEIS: Wenn die SUVs nicht ausreichend trocknen, sie einfach zu waschen können von den Leitungen, wenn die Wachstumspuffer wird zugegeben, während der Trocknung zu viel kann das Protein beschädigen. Da die Luftfeuchtigkeit beeinflußt die Trocknungsgeschwindigkeit, der Trocknungszeit und / oder Luftfeuchte kann für optimale Ergebnisse 30 eingestellt werden. Der Lipidfilm auf den Drähten sollte unter dem Mikroskop sichtbar. </li></ol></li><li> Setzen Sie die Kammer. <ol><li> Verschließen Sie die Kammer unten: mit einer Spritze Vakuumfett auf den Boden der Kammer um die drei Brunnen gelten, und drücken Sie eine 40 mm x 22 mm Deckglas sanft gegen sie den Kammerboden zu versiegeln, so dass es ohne eine Lücke haftet. Dichten Sie die Seiten der Kammer (wo die Drähte Ausgang) mitDichtpaste. Bewerben Vakuumfett auf der Oberseite der Kammer umreißt die drei Brunnen. </li><li> Langsam Wachstums Puffer, bis jeder Vertiefung nach oben befüllt. Vermeiden Sie schnelle Bewegung der Lösung in den Vertiefungen, da dies den Lipidfilm aus den Elektroden zu strippen. </li><li> Die Kammer, indem Sie die obere Abdeckung Schieber vorsichtig auf das Fett, kümmert sich nicht um die untere Deckglas entfernen. Verwenden Sie eine Gewebe irgendwelche Tropfen Puffer an den Rändern der oberen Deckglas entfernen. Hinweis: Dies ist ein guter Zeitpunkt, um die Kammer unter dem Mikroskop untersucht, um zu bestätigen, dass die Lipidfilm wurde auf die Drähte geblieben. </li></ol></li><li> Verbinden Sie den Signalgenerator an die Drähte mit zwei Krokodilklemmen. Stellen Sie die Frequenz (10 Hz / 500 Hz Sinuswelle für hohen / niedrigen Salzpuffer) und mit einem Multimeter messen und die Spannung an den Leitungen von 0,7 / 0,35 V quadratischer Mittelwert (V effektiv) für den hohen / niedrigen Salzpuffer. Decken Sie die Kammer mit einer Aluminiumfolie, um die Fluorophore vor Licht zu schützen. Lassen ter GUVs für 2 bis 3 h bei der niedrigen Salzpuffer und 12 h oder O / N für die Hochsalzpuffer wachsen. </li><li> Trennen Sie die Kammer aus dem Generator und sorgfältig legen Sie sie auf einem inversen Mikroskop GUV Wachstum zu bewerten. Verwenden langsame, stetige Bewegungen oder Flüssigkeitsströmung in den Vertiefungen kann vorzeitig abzulösen GUVs von den Drähten. HINWEIS: GUVs an den Drahtkanten sind in der Regel im Phasenkontrast (40X großen Arbeitsabstand Ziel) sichtbar, während GUVs überall auf der unteren Hälfte der Drähte mit Epifluoreszenz ersichtlich. Wenn keine GUVs sichtbar sind, drehen Sie die Kabel an der oberen Fläche zu suchen. GUVs können bei 4 ° C in einer Wachstumskammer für mehrere Tage gelagert werden. </li></ol> 4. GUV Wachstum durch Gel-unterstützte Schwellung <ol><li> Herstellung von 10 ml einer 1% igen Lösung, die durch Mischen von 100 mg Agarose mit 10 ml reinem Wasser. Erhitzen Sie es, bis es, indem Sie es in der Mikrowelle bei 480 W für ~ 20 Sekunden kocht. Rühren Sie um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig gelöst ist. HINWEIS: Die Lösungkönnen bei 4 ° C gelagert und bei Bedarf wieder aufgeheizt werden. </li><li> Plasma-sauber (Luft-Plasma) eine Abdeckung Rutsche für 1 Minute, so dass das Agarose-Lösung wird gut darauf verteilen. Verwenden Sie die Cover-Folien in den nächsten 15 Minuten, wie die Wirkung der Plasmareinigung nachlässt schnell. </li><li> Anwenden 200 ul warmes Agaroselösung zu jedem 22 x 22 mm 2 Schieber so der Lösung benetzt die gesamte Fläche. Neigen Sie den Schiebe vertikal und berühren Sie die Unterkante auf ein Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und nur eine dünne glatte Schicht aus Agarose auf der Folie. </li><li> Legen Sie die Folie auf einer Heizplatte oder Ofen bei 60 ° C und lassen Sie es für mindestens 30 Minuten trocknen lassen. Die Agarose Films mit dem Auge kaum sichtbar. Nachdem die Objektträger zu kühlen RT, verwenden Sie sie sofort, oder speichern Sie sie für bis zu einer Woche in einem geschlossenen Behälter bei 4 ° C. </li><li> Legen Sie die Agarose-beschichtete Deckglas in einem Standard 3,5 cm Petrischale. </li><li> Bereiten Sie das SUV-Lösung, wie in Abschnitt 3.2 und gelten ~ 15 ul der SUV-Lösung (3 mg / ml Lipid) in~ 30 kleinster Tropfen vorsichtig auf die Agarose-Oberfläche. Achten Sie darauf, die Agarose-Schicht zu stark verzerren. </li><li> Legen Sie die Objektträger unter einem leichten Stickstoffstrom für ca. 10-15 min und folgen Sie dem Verdampfen des Puffers mit dem Auge als die Tröpfchen trocknen. </li><li> Sobald die SUVs getrocknet sind, fügen Wachstum Puffer, um die Gleitfläche zu decken. Für eine kleine 3,5 cm Petrischale Gebrauch ~ 1 ml Puffer. </li><li> Lassen Sie die Schwellung für ~ 30 min gehen, und überprüfen Sie das Wachstum von GUVs in der Kammer mit einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC). HINWEIS: Epifluoreszenz Beobachtung ist schwierig aufgrund der starken Hintergrund der Fluorophore in dem Gel und der Autofluoreszenz der Agarose. </li></ol> 5. Ernte und Observing GUVs <ol><li> Passivieren des Beobachtungskammer (zB kleine Petrischale oder Deckglas), so dass GUVs kleben nicht, zu verbreiten und brach auf dem Kammerboden. Decken Sie die Chamber Boden mit Beta-Casein-Lösung, Inkubation für 5 min, spülen Sie den Casein-Lösung mit reinem Wasser, trocken mit einem Strom von Luft oder Stickstoff, und schließlich fügen Beobachtung Puffer (zB ~ 5 mm Tiefe für eine kleine Petrischale). </li><li> Ernten Sie die GUVs. Schneiden Sie das Ende eines 100 ul Pipettenspitzen, so dass die Öffnung größer (~ 2 mm Durchmesser) und streben langsamer als die Schubspannung von Pipettieren kann leicht zerstört GUVs. <ol><li> Für elektro gebildet GUVs, öffnen Sie die Wachstumskammer durch leichtes Entfernen der oberen Deckglas. Legen Sie die Pipettenspitze direkt über jeden Draht und saugen ~ 50 &amp; mgr; l, während Sie die Pipettenspitze entlang des Drahtes, um die GUVs lösen. HINWEIS: Es kann helfen, um den Draht zu GUVs auf der &quot;anderen Seite&quot; des Drahtes sammeln drehen. </li><li> Für &quot;Gel-unterstützte Schwellung&quot; GUVs, tippen Sie auf die erste Seite der Petrischale ein paar Mal zu helfen, die GUVs lösen sich von der Deckfläche. Positionieren Sie die Pipettenspitze knapp über dem Deckglas und saugen, während 50 &amp; mgr; pulling die Spitze über die Oberfläche zurück. Direkt an eine Beobachtungskammer, oder speichern zu übertragen geerntet GUVs in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 ° C für bis zu 1 Woche. </li></ol></li><li> Legen Sie die Beobachtungskammer auf einem inversen Mikroskop, fügen Sie die GUVs zu der Beobachtungskammer, und ein paar Minuten warten, bis die GUVs am Kammerboden absetzen. </li><li> Umfrage der Kammer mit Phasenkontrast oder DIC, um schnell glatt, kugelförmig (&quot;fehlerfrei&quot;) &quot;GUV-Kandidaten&quot;. Untersuchen Sie jeden &quot;GUV Kandidat&quot; in Epifluoreszenz, alle, die kleiner Liposomen innerhalb verschachtelt auszuschließen. Schließlich prüfen, ob die Lipidfluoreszenzintensität ist einheitlich und kompatibel mit einer einzigen Membran (dh unilamellaren). HINWEIS: In einigen bilamellare (oder multilamellare) Vesikel sind die Membranen zu dicht beieinander, um gelöst werden, so dass sie in unilamellare Phasenkontrast oder DIC Bilder werden angezeigt. Jedoch können diese Gegenstände aus tatsächlichen unilame unterscheidenllar GUVs durch ihre Lipid Fluoreszenz, die zwei Mal (oder mehr) heller ist. </li></ol> 6. Patch-Klemm GUVs <ol><li> Stellen Sie Patch-Pipetten mit einer 1-2 um Spitzendurchmesser von Standard-Borosilikat-Glas-Kapillare mit Hilfe des Programms für die Pipette Abzieher empfohlen. HINWEIS: Nur spezielle Behandlungen wie Feuerpolitur sind nicht erforderlich, und Pipetten können für mehrere Tage, nachdem sie zuvor gezogen, wenn sie in einer geschlossenen Box aufbewahrt werden. </li><li> Passivieren der Kammer durch Inkubation mit einem Beta-Casein-Lösung (5 mg / ml), um sicherzustellen, dass GUVs nicht anhaften, die Ausbreitung und Bruch an Kammeroberflächen. Spülen Sie das Kasein nach 5 min. </li><li> Legen Sie die Masseelektrode, füllen Sie die Kammer mit Beobachtung Puffer übertragen 10 ul der GUV-Suspension, wie in Schritt 5.2 und 5.3 beschrieben, und ein paar Minuten warten, bis die GUVs am Boden absetzen. </li><li> Füllen Sie einen frischen Patch-Pipette mit Lösung (Beobachtung Puffer oder anderen isoosmotisch Lösung) undbringen Sie es am Patch-Clamp-Verstärker heads. </li><li> Suche durch die Kammer, um einen &quot;fehlerfreie&quot; GUV finden wie in Kapitel 5.4 beschrieben, und prüfen Sie ihn fluoreszierendes Protein enthält. </li><li> Tragen Sie einen konstanten Überdruck (&gt; 100 Pa oder ungefähr 1 cm H 2 O in einem Manometer), um die Patch-Pipette Innenraum sauber zu halten, und legen Sie die Patch-Pipette in die Kammer. Bringen Sie die Patch-Pipette in das Sichtfeld, gelten Testimpulse zur Messung / Kompensation der Pipette Spannungsoffset und Widerstand, und untersuchen Sie die Pipette unter Fluoreszenzbeleuchtung, um zu bestätigen, dass die Spitze sauber ist. </li><li> Bringen Sie die Patch-Pipette auf die GUV und, falls erforderlich, den Überdruck gleichzeitig zu reduzieren, so das Ausströmen aus der Patch-Pipette macht nicht den GUV &quot;Durchgehen&quot;. Wenn der Patch-Pipette in der Nähe des GUV gelten einen Unterdruck (bis zu 5 cm H 2 O), um das GUV gegen die Patch-Pipette zu ziehen. Überwachen Sie den Widerstand als &quot;; Zunge &quot;der GUV-Membran in die Patch-Pipette und die Gigaseal Formen. </li><li> Wenn ein Gigaseal nicht gebildet hat, ziehen Sie den Patch-Pipette aus der Kammer und wieder mit Schritt 6.4. Wenn der Membranfleck bildeten eine undurchlässige, aber der GUV bleibt an der Pipette befestigt, herausschneiden den Patch, indem Sie von der GUV, platzt die GUV gegen den Kammerboden oder kurz Bewegen der Pipette aus der Lösung aus. </li><li> Wenn der inside-out Membranfleck aus der GUV herausgeschnitten worden und die Gigaseal stabil ist, schalten Sie die Testimpulse und eine Spannung Protokoll wie die in Abbildung 13 dargestellt. HINWEIS: Abbildung 13 folgt dem Standard elektroKonvention für eine Inside-Out-Patches, in der Strom in den Patch-Elektrode fließt, ist &quot;positiv&quot; und V = V-Bad - V Pipette. Halten Sie den Patch auf einem negativen Potential (zB V = -100 mV) für ~ 30 sec Stellen KvAP im Ruhezustand, während Schritte (100 ms bis 5 s) zu positiveren Potentialen (zB kann V = 100 mV), dann fahren sie in die Durchführung (dh offen) aktiv Staaten. </li><li> Nach Messungen an einer Membran-Patch fertig sind, brechen Sie den Patch mit zap oder Druckimpuls und prüfen, ob der Spannungsoffset des Patch-Elektrode nicht getrieben. Entfernen Sie die Patch-Pipette aus der Kammer, und kehren Sie zu Schritt 6.4. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles.">Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li><li>Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+or+Active+Fluctuations+in+Membranes+Containing+Proteins.">Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins.</a> Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).</li><li>Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Lipids+in+VDAC+Oligomerization.">The Role of Lipids in VDAC Oligomerization.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+voltage-dependent+K++channel.">X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reconstitution+of+a+Voltage-Gated+Potassium+Channel+in+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles.</a> PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. 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S., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+trehalose+special+for+preserving+dry+biomaterials.">Is trehalose special for preserving dry biomaterials.</a> Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biomimetische Modellsysteme sind ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Eigenschaften und Wechselwirkungen von Proteinen und Membranen. Im Vergleich zu anderen wiederhergestellten Systeme wie BLMs oder unterstützte Lipidmembranen, GUV-basierte Systeme weisen mehrere Möglichkeiten, wie zB erhebliche Kontrolle über die Zusammensetzung der Membran, Spannung und Geometrie, sowie als wahrhaft ölfrei. Einbeziehung Transmembranproteine, wie KvAP in GUVs Jedoch erfordert erhebliche Anpassungen herkömmlicher Proto...

Bei der Untersuchung der physikalischen Prinzipien, die lebende Systeme regeln, Bottom-up-Ansätze ermöglichen ein Experimentator die Systemzusammensetzung und andere Parameter, die nicht leicht in der zellbasierten Systemen 1 manipuliert werden, zu steuern. Für membranbasierte Prozesse, Giant unilamellare Vesikel (GUVs, Durchmesser ~ 1-100 um) haben sich als sehr nützlich biomimetischen Systems 2 sein - 10 - 7, wie sie für die Mikroskopie Studien und Mikromanipulation 8 geeignet sind. Zwar gibt es viele verschiedene Protokolle zur GUVs produzieren, die meisten fallen in zwei Kategorien - Emulsion nähert 11,12 und Techniken, die auf eine rückfettenden Lipidfilm 13-16. In Emulsion basierenden Verfahren werden die inneren und äußeren Blättchen der GUV Membranen nacheinander von Lipid-Monoschichten auf Wasser / Öl-Grenzflächen zusammengefügt. Diese Vorgehensweise eignet sich zur Verkapselung lösliche Proteine ​​mitin den GUVs und zur Bildung GUVs mit asymmetrischer Broschüre Lipidzusammensetzung. Allerdings kann GUVs von Emulsionen gebildet Spuren des Lösungsmittels, die der Membran mechanische Eigenschaften 17 ändern zu behalten, und der Ansatz ist nicht besonders gut geeignet, um Transmembranprotein Rekonstitution. Film Rehydratisierung Verfahren beruhen auf der Tatsache, daß die Trocknung (Entwässerung) verursacht viele Lipidgemische einen multilamellare Membranstapel zu bilden. Wenn dieser Stapel wird dann in Kontakt mit einem wässrigen Puffer platziert werden Membranen in dem Stapel auseinander als Lösungsmittel fließt zwischen ihnen und an der Oberfläche des Stapels bewegen können einzelne Membranen lösen zu GUVs 13,18 (und einen regelrechten Zoo bilden anderen lipidischen Objekte). Auch für eine optimale Puffer und Lipidzusammensetzungen, hat diese klassische &quot;spontane Schwellung&quot; Verfahren jedoch eine relativ geringe Ausbeute an fehlerfreie GUVs. Eine weit verbreitete Methode, um die Ausbeute an fehlerfreie GUVs steigern ist &quot;Elektroformation221 ;, in dem ein Wechselstrom (AC) -Feld wird während der Film Rehydratisierung aufgebracht. Während der Mechanismus bleibt kaum verstanden &quot;, Elektroformation&quot; kann spektakuläre GUV Ausbeuten (&gt; 90% unter günstigen Bedingungen) für niedrige Salzkonzentration Puffer (&lt;5 mm) 14,19, und kann sogar in physiologischen Puffern zu arbeiten (~ 100 mM) mit eine höhere Frequenz (500 Hz gegenüber 10 Hz) Wechselstromfeld und Platinelektroden 15. Ein alternativer Ansatz, um die Ausbeute an fehlerfreien GUVs BOOST &quot;Gel-unterstützte Schwellung&quot;, in dem die Lipidlösung wird auf ein polymeres Gel Substrat anstelle des passiven abgeschieden (zB Glas, PTFE) Substrate in der klassischen &quot;spontane Quellung verwendete &quot;. Wenn die resultierende Lipid / Gelfilm rehydriert kann GUVs schnell bilden auch für physiologische Puffer 16,20. Alle diese Methoden können lipid nur GUVs die benutzt werden können, um Membran-assoziierten Phänomene wie die Studie zu produzierenInteraktion zwischen löslichen Proteinen und Membranen. Um jedoch ein Transmembranprotein in GUVs einzubauen, sind wesentliche Änderungen erforderlich, um sicherzustellen, dass das Protein bleibt in einem Funktionszustand in der gesamten Aufbereitungsvorgang. Während Lösungen von Lipiden in organischen Lösungsmitteln (beispielsweise Chloroform, Cyclohexan) sind ideal für die Herstellung von Lipidfilmen, sind Transmembranproteine ​​in der Regel nur dann stabil, wenn die hydrophobe Transmembrandomäne in einer Lipiddoppelschicht eingebettet ist, oder durch ein Detergens Mizelle umgeben ( beispielsweise bei der Proteinreinigung). Somit ist das Ausgangsmaterial für eine Rekonstitution typischerweise nativen Membranen, gereinigtes Protein in einer Reinigungslösung oder kleinen unilamellaren proteinhaltigen Vesikel (Proteo SUVs) und / oder multilamellare Vesikel (MLVs Proteopolysaccharide) durch Entfernung des Detergens in das gebildete Gegenwart von Lipiden. Die meisten Methoden, diese Membranproteine ​​in GUVs integrieren sich in drei Kategorien. Direkter Insertion: Transmembranprotein in Waschmittel suspendiert ist mit vorgeformten, lipid nur mild solubilisiertem GUVs vermischt und das Waschmittel dann mit Bio-Beads 21 entfernt. Obwohl vom Konzept her einfach, erfordert dieses Verfahren eine genaue Steuerung der Waschmittelkonzentration, da ein zu hoher Waschmittelkonzentration die GUVs während eine zu geringe Konzentration kann bewirken, dass das Protein zu entfalten oder Aggregat aufzulösen. GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein in Proteo-SUVs mit vorgeformten, lipid nur GUVs Kombination und Verschmelzung wird mit speziellen fusogenen Peptide 22 oder Reinigungsmittel 21 erleichtert. Typischerweise ist das Ausmaß der Fusion ist begrenzt, was zu GUVs mit niedrigen Proteindichte. Dehydratisierung / Rehydratisierung: Ein Protein enthaltenden Lipidfilm wird durch partielle Dehydratisierung einer Proteopolysaccharide SUV (oder Proteo MLV) -Lösung und GUVs gebildet werden dann wie bei einem reinen Lipid-Film aufgewachsen. Die offensichtliche Herausforderung besteht darin, das Protein während der partiellen dehydrati schützenam Schritt 23, aber das Verfahren wurde erfolgreich verwendet, um Transmembranproteine ​​wie Bakteriorhodopsin, Calcium-ATPase, Integrin und VDAC in GUVs 7,23 rekonstituieren - 25. Dieser Artikel beschreibt die Dehydratisierung / Rehydratisierung Protokolle GUVs welche die spannungsabhängigen Kaliumkanals, KvAP aus der hyperthermophilen Archaea, Aeropyrum pernix machen. KvAP hat einen hohen Grad an Homologie zu eukaryotischen spannungsabhängige Kaliumkanäle 26 und eine bekannte Kristallstruktur 27 , so dass es ein gutes Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Spannung Gating. Die Produktion der Proteo-SUV wurde im Detail beschrieben worden und ist nicht Teil dieses Tutorials 26,28,29. Wichtig ist, dass KvAP Proteopolysaccharide SUVs nicht für jeden GUV Zubereitung hergestellt werden, wie sie in kleinen (beispielsweise 10 ul) Aliquots bei -80 ° C für längere Zeit (&gt; 1 Jahr) gelagert werden. Elektroformationoder Gel-unterstützte Schwellung kann dann verwendet werden, um aus den GUVs KvAP Proteopolysaccharide SUVs wachsen (oder Proteo MLVs). Die Schlüsselschritte für die Elektroformation Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Tröpfchen einer Lösung von SUVs, die das Protein enthalten, werden auf Platindrähten (in 2 gezeigt) abgeschieden. Partielle Dehydratisierung der SUV-Suspension zur Bildung eines Lipidproteinfilm durch Fusion des SUVs. Während der Rehydratisierung wird ein Wechselstromfeld an die Elektroden, um die Lipidschichten unterstützen delaminieren und bilden GUVs aufgebracht. Ein Feld 10 Hz funktioniert gut bei der Verwendung von &quot;salzarme&quot; (&lt;5 mM) Rehydrationspuffer 28 und GUVs mehrere Stunden dauern, um zu wachsen. Im Gegensatz dazu physiologische Puffer (mit ~ 100 mM Salz) arbeiten gut mit einer niedrigeren Spannung, 500 Hz Wechselfeld, sondern erfordern einen längeren (~ 12 h) Schwellungen Zeitraum 15. Dieses Verfahren basiert auf einem früheren Protokoll mit ITO-Folien 24 basiert, aber einen benutzerdefinierten Kammer Fortsetzungaining zwei Platindrähte wie in Abbildung 2 dargestellt (siehe die Diskussion für Design-Details und Anregungen für einfachere, improvisierte Kammern). Abbildung 3 zeigt die Gel-unterstützte Schwellung Methode. Das Protokoll funktioniert gut mit Puffern mit physiologischer Kochsalzkonzentrationen, ist schnell, und produziert GUVs mit homogener Proteinverteilung. Die Ausbeute an isoliertem offenbar mangelfreien GUVs (dh der GUV Membran Uniform bei optischen Längenskalen und keine Objekte umschließen) jedoch geringer ist, auch wenn es eine ausreichende Anzahl für Patch-Clamp-und Mikromanipulationsexperimente . Diese Methode wurde auf einem Protokoll mit Agarose-Gel, um lipid nur GUVs 16 zu produzieren und weniger spezialisierte Ausrüstung als die Elektroformation Methode. Die Charakterisierung GUVs Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, sowie Verfahren unter Verwendung eines Standard-Patch-Clamp-Set-up, ummessen KvAP Aktivität in &quot;inside-out&quot; herausgeschnitten Membranflecken. Wachsende proteinhaltigen GUVs kann schwieriger als lipid nur GUVs sein. Insbesondere kann die endgültige GUV Ausbeute empfindlich von genau, wie der SUV-Lösung aufgebracht und entwässert, um den Membranstapel bilden, hängen. Für jemanden ohne Vorkenntnisse mit GUVs, kann es hilfreich sein, zuerst wachsen lipid nur GUVs nach einem herkömmlichen Protokoll 15,16 in dem der Membranfilm wird durch Abscheiden von Lipiden aus einem organischen Lösungsmittel gebildet werden. Sobald der herkömmlichen Protokoll gut funktioniert, kann SUV Abscheidung und teilweise Wasser entzogen dann mit lipid nur Geländewagen, die auch bei der Einstellung des Protokolls für eine neue Lipidzusammensetzung sind sehr hilfreich, gemeistert werden. Wenn GUVs wachsen zuverlässig von lipid nur Geländewagen, dann ist es nur ein kleiner Schritt, um proteinhaltige GUVs von Proteo-SUV zu produzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

Riesigen unilamellaren Vesikeln (GUV) stellen eine populäre biomimetischen System für die Untersuchung Membran verbundenen Phänomenen. Jedoch allgemein verwendeten Protokolle zu wachsen GUVs muß, um GUVs funktionelle Transmembranproteine, die Form modifiziert werden. Dieser Artikel beschreibt zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden - Elektroformation und Gel-unterstützte Schwellung - zu GUVs mit dem spannungsabhängigen Kaliumkanal, KvAP zu bilden. Bei beiden Verfahren ist eine Lösung von Protein enthaltenden kleinen unilamellaren Vesikeln partiell dehydratisiert, um einen Stapel von Membranen, die man dann in ein Rehydrationspuffer quellen zu bilden. Für die Elektroformation Verfahren wird der Film auf Platinelektroden abgeschieden, so dass eine AC-Feld bei der Folien Rehydratisierung angewendet werden. Im Gegensatz dazu verwendet das Gel gestützten Quellverfahren ein Agarosegel Substrat Film Rehydratisierung verbessern. Beide Methoden können GUVs in niedrigen (zB 5 mM) und physiologischen (zB 100 mM) Salzkonzentrationen zu produzieren. Die resultierenden GUVs über Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert, und die Funktion des rekonstituierten Kanäle gemessen mit der Inside-Out-Patch-Clamp-Konfiguration. Während Schwellung in der Gegenwart eines elektrischen Wechselfeldes (Elektroformation) ergibt eine hohe Ausbeute an fehlerfreien GUVs das Gel gestützten Quellverfahren erzeugt eine homogene Proteinverteilung und erfordert keine spezielle Ausrüstung.

Das Wachstum GUVs schnell durch Untersuchen der Wachstumskammer unter dem Mikroskop ausgewertet werden. Für Elektroformation neigen die GUVs in Bündeln längs der Platindrähte wachsen, wie in Figur 4 gezeigt ist. Während Gel gestützten Schwellung, erscheinen GUVs als sphärische Strukturen, die schnell wachsen und miteinander verschmelzen (Abbildung 5). Mangelfreien GUVs leichter identifiziert und nach der Übertragung auf eine Beobachtungskammer ausgew...

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Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K Aufrufe.  Université Pierre et Marie Curie.  Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden. 

Serie: Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...