Dieses Protokoll eignet sich für die Untersuchung der Virulenz von Leishmania, da es eine systemische Sicht des Wirbeltiers hosten der Hautinfektion bietet. Der Hauptvorteil der Annahme dieses Protokolls ist, dass es Forschern ermöglicht, die Entzündungsreaktion des Wirts und die Parasitenreplikation gleichzeitig zu bewerten. Diese Methode kann verwendet werden, um mehrere Ziele und Behandlungen im Zusammenhang mit Virulenz zu charakterisieren, die neue Erkenntnisse in der hautbedingten Leishmaniose-Kontrolle bringen könnten.
Es kann auch auf andere MäuseStämme und Leishmanien-Arten angewendet werden, die kutane Leishmaniose verursachen. Dieser Test hat einige kritische Schritte, wie z. B. die Anforderung von geschultem Personal, das sich mit Mäusen vertraut und Erfahrung in der Durchführung von Subplantar-Injektionen hat, um eine versehentliche Exposition gegenüber infektiösem Material zu vermeiden. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Ricardo Zampieri, einem Techniker aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit dem Anbau von L.amazonensis promastigotes in einem 25 Zentimeter quadratischen Zellkulturkolben, der 10 Milliliter Pro-Medium enthält, für drei Tage bei 25 Grad Celsius. Nach der Inkubation, Pipette fünf Milliliter logarithmische Wachstumsphase Promastigot Kultur in einen neuen Kolben. Fügen Sie fünf Milliliter Ama-Medium in den Kolben, und inkubieren Sie es bei 34 Grad Celsius für drei bis vier Tage.
Teilen Sie die Kultur, indem Sie sie im Verhältnis eins zu drei mit frischem Ama-Medium in einem neuen Kolben verdünnen. Dann inkubieren Sie es für weitere drei bis fünf Tage. Übertragen Sie ein Aliquot der in PBS verdünnten axtischen Amastigoten suspension in eine Neubauer-Kammer und zählen Sie die nicht flagellated Parasiten.
Verdünnen Sie dann die Suspension in PBS entsprechend der gewünschten Inokulumdosis und der Anzahl der vorgesehenen Inokulume. Laden Sie eine Tuberkulinspritze mit einer 27-Spur-Nadel mit der vorbereiteten Parasitensuspension. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig mit einer Zehenprise beästheisiert ist und impfen Sie 50 Mikroliter der Suspension in das Subplantargewebe auf dem linken Hinterfußpad.
Zeichnen Sie das Fortschreiten der Läsion einmal pro Woche auf, indem Sie die Dicke der infizierten und nicht infizierten Fußpolster mit einem Bremssattel messen, und berechnen Sie den Dickenunterschied zwischen den beiden Fußpads, um die Läsionsprogression zu bewerten. Fügen Sie einen Milliliter Pro-Medium in ein Glasgewebe-Schleifrohr pro Läsion und wiegen Sie das Rohr. Sprühen Sie 70% Ethanol auf das Fußpad zur Desinfektion und verbrauchen Sie den Fuß des Tieres an seiner Ferse, um das infizierte Fußpolster zu extrahieren.
Stellen Sie sicher, dass Schere und Zange sterilisiert werden, indem Sie sie in 70% Ethanol getränkt halten. Legen Sie das Fußpolster in eine sterile Petrischale und sezieren Sie es mit den Zangen und Skalpell. Sammeln Sie alle Weichgewebe und entsorgen Sie die Knochen.
Übertragen Sie das gesammelte Gewebe auf das Glasgewebeschleifrohr und wiegen Sie das Rohr erneut, um das Läsionsgewicht zu bestimmen. Homogenisieren Sie das Gewebe 10 Mal mit dem Schleifer für vollständige Gewebestörung, und lassen Sie die Mischung zu begleichen. Sammeln Sie 20 Mikroliter des Überstandes und laden Sie ihn in die erste Kolonne und die erste Spur der 96-Wellplatte, die nach den Manuskriptanweisungen vorbereitet ist.
Wiederholen Sie diesen Schritt, damit die nächsten drei Bahnen für jedes Tier Quadruplicate-Ergebnisse haben. Homogenisieren Sie jeden Brunnen 10 Mal mit einer Mehrkanalpipette und übertragen Sie 20 Mikroliter der verdünnten Probe von der ersten in die zweite Spalte. Fahren Sie mit der seriellen Verdünnung fort, bis die letzte Spalte erreicht ist, und entsorgen Sie die letzten 20 Mikroliter der verdünnten Probe.
Versiegeln Sie die Platte mit Folie, und bebrüten Sie sie bei 25 Grad Celsius für sieben Tage in einer feuchten Kammer. Analysieren Sie nach der Inkubation die Platte unter einem invertierten Mikroskop, um den letzten parasitenhaltigen Brunnen für jede Spur zu bestimmen. Leishmania protozoan Parasiten existieren in zwei Entwicklungsformen während ihres Lebenszyklus in wirbellosen und Wirbeltieren Wirte: Promastigoten und Amastigoten.
Axenische Bedingungen können verschiedene Wirtsumgebungen in vitro simulieren und die Parasitenmorphologie und Lebensfähigkeit erhalten. Axenische Bedingungen für Amastigoten imitieren die saure Umgebung und die erhöhte Temperatur der Wirbeltierwirte. Promastigotes werden unter diesen Bedingungen in Amastigoten differenzieren.
Bei einer Übertragung auf neutralen pH-Wert und bei 25 Grad Celsius transformiert, verwandeln sich axtische Amastigoten wieder in Promastigoten. Der Virulenzunterschied des wilden Typs und Leishmania Iron Regulator 1 Knockout-Stämme wurde auf infizierten Maus-Fußpads beobachtet. LIR1 reguliert den intrazellulären Eisengehalt in Leishmanien, vermittelt den Eisenexport und verhindert seine intrazelluläre Akkumulation auf toxische Werte.
Der Infektionstest, der den Unterschied in Schwellung und Läsionsprogression beinhaltet, zeigte, dass LIR1 für L.amazonensis in vivo Virulenz unerlässlich ist. Die Parasitenbelastung wurde durch die Durchführung eines begrenzenden Verdünnungstestes aus den infizierten Läsionen bestimmt. Die Läsionen der LIR1-Knockout-infizierten Mäuse enthalten 10 bis sechs mal weniger Parasiten als die der wildartigen Leishmania-infizierten Mäuse, was zeigt, dass das Fehlen von LIR1 die intrazelluläre Replikation der Amastigoten verhindert.
Eines der wichtigsten Dinge, die Sie sich merken sollten, wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist die Verwendung von Leishmanienkulturen, die weniger als zehnmal in vitro durchdrungen wurden, um den Verlust der Parasitenvirulenz zu vermeiden. Zusätzlich zu diesem Verfahren können Sie In-vitro-Infektionstests verwenden. Dies ist jedoch eine begrenzte Methode, da sie keinen systemischen physiologischen Überblick über die Wirts-Parasiten-Interaktion bietet.
Diese In-vivo-Methode ist der beste Ansatz zur Bewertung systemischer Reaktionen auf kutane Leishmaniose, wie die Quantifizierung von Serumbiomarkern in wiedergewonnenen Wirtgeweben für weitere immunologische Studien.
