Diese Arbeit wird von der Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, University of British Columbia Centre for Blood Research und der University of Northern BC finanziert.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Reagenzien im gesamten Experiment verwendet werden, sollten vor Beginn der chirurgischen Protokoll vorbereitet werden. Beachten Sie, dass alle Lösungen hergestellt wurden unter Verwendung steriler Technik. </li><li> Physiologische Kochsalzlösung (PSS) ist am besten in zwei Komponenten hergestellt: basische Salz-Lösung und Natriumhydrogencarbonatlösung. Sowohl Lösungen bei 20X Konzentration und lagern bei 4 ° C. Natriumbicarbonat bei 20X ist 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) und basische Salz-Lösung bei 20X Konzentration 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) und 23,4 mm MgSO 4 • 7 H 2 O (246.48g/mol). Die Lösungen sollten in dH 2 O und Chemikalien vorbereitet werden sollte hinzugefügt werden einer nach dem anderen und gerührt, bis die Lösung klar ist vor der Zugabe des nächsten chemische </li><li> Bereiten 2L von PSS durch Verdünnen gleichen Volumina von Natriumbicarbonat und basische Salz-Lösung und Verdünnen auf 1X-Konzentration (für zwei 2L von PSS verdünnen 100mL jedes Natriumbicarbonat und basische Salz-Lösung in dH 2 O </li><li> Legen Sie 2L-Messkolben mit PSS und PSS in 37 ° C Wasserbad. Äquilibrieren Sie die Lösung mit 5% CO 2 / Balance Stickstoffgas für 1 Stunde vor der Operation beginnen. </li><li> Vasoaktive Substanzen (zB Phenylephrin, Acetylcholin, Nitroprussidnatrium) werden am besten bei 1M-Konzentration in dH2O hergestellt und gelagert in 100 &amp;mgr; l Aliquots bei -20 ° C. </li></ol> 2. Tierische Vorbereitung <ol><li> Bestimmen Sie das Gewicht der Maus und zu verwalten, die anfängliche Dosis von Natrium-Pentobarbital bei 90mg/kg durch intraperitoneale Injektion. Während des gesamten Verfahrens mit der Maus wird kontinuierlich für Anästhesie Flugzeug über Zehen klemmen und sorgfältige Prüfung der Atemfrequenz beobachtet. Weitere Injektionen von Natrium-Pentobarbital verabreicht als bei 20mg/kg auf die Anästhesie Flugzeug zu halten benötigt werden. Die chirurgische Ebene der Anästhesie ist in Einklang mit Bundes-und institutionelle Regelungen beibehalten, wie in der Tierpflege Protokoll, das von der Animal Care und Verwenden Committee (ACUC) der University of Northern BC genehmigt skizziert. </li><li> Entfernen Sie die Haare aus dem Bauch und Flanken / Hüftbereich durch Rasierer. Verbleibende lose Haare von Alkoholtupfer und klopfte auf den Bereich mit Klebeband. Dies ist ausreichend, da diese experimentelle Vorgehensweise ist Klemme. </li><li> Legen Sie die Maus auf eine klare OP-board in Rückenlage und legen Sie die Maus auf dem Brett durch Abkleben jeder Pfote an den Vorstand. Die Körpertemperatur ist über einen externen Wärmelampe gewartet und überwacht über Rektalthermometer um sicherzustellen, dass Hypothermie nicht als Folge der Narkose auftreten. </li></ol> 3. Surgical Procedure <ol><li> Während des gesamten chirurgischen Eingriffs zu gewährleisten freiliegende Gewebe immer gehalten superfundiert mit äquilibriert erwärmt PSS-Lösung. Es ist auch wichtig, nie den Kontakt mit den Gefäßen des Interesses mit chirurgischen Instrumenten oder zu verletzen die Gefäße, indem zu viel Kraft auf sie durch Manipulation Fettgewebe und Bindegewebe um sie herum. </li><li> Platzieren Sie die Maus unter dem Binokular. Machen Sie eine Mittellinienschnitt entlang der ventralen Oberfläche der Bauchhöhle und Einfahren der Haut gegenüber der Maus Wirbelsäule. </li><li> Sobald die Haut eingezogen ist, so dass die LN gut sichtbar ist, Pin die Haut auf einem Sockel aus transparentem Sylgard 184. </li><li> Entfernen Sie die dünne Schicht von Bindegewebe Überlagerung der Bereich um die LN </li><li> Deaktivieren Sie das Fettgewebe überlagert und umgeben den Lymphknoten, bis der mikrovaskulären Bett ausgesetzt ist. Die wichtigsten arteriellen Segment legt neben dem LN und wird allgemein durch die venule überlagert. Die gesamte Operation dauert etwa 30 Minuten. </li></ol> 4. Imaging und Gefäßanalyse <ol><li> Sobald das Schiff Segment von Interesse unter der Binokular ausgesetzt ist, sichern Sie die Vorbereitung auf die intravitale Mikroskop. Beachten Sie, dass Tiere auf dem klaren chirurgischen Bord bleibt, während auf der Intravitalmikroskopie Mikroskop während der gesamten Dauer des Experiments. Die Körpertemperatur wird über Wärmelampe gewartet und gemessen über rektale Thermometer während des chirurgischen Abschnitt beschrieben. Die Anästhesie-Ebene ist auch während des ganzen Experiments überwachen, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. </li><li> Richten Sie die Superfusion und Saugleitungen. Superfusion von PSS erfolgt durch Schwerkraft aus einem Reservoir, in den Wassermantel beheizten Behälter (der Wassermantel umgewälzt und durch die zirkulierende Wasserbad erhitzt) wird von 5% CO 2 symmetrische Stickstoff durchströmt, und unten einen Tropf line mit einer Rate von 10 ml / min. Eine Saugleitung sollte verwendet werden, um weiterhin zu ziehen superfundiert PSS weg von der Vorbereitung. Beachten Sie, dass vor dem Experiment die Saugleitungen und Wassermantel gründlich gereinigt und gelagert nach jedem Experiment. Dies gewährleistet die Sterilität vor dem nächsten Versuch. </li><li> Prüfen Sie die Temperatur des superfusing PSS. Stellen Sie die Temperatur deszirkulierenden Wasserbad und / oder die Rate der PSS Superfusion auf eine Temperatur von ~ 37 ° C über die Vorbereitung zu erreichen. </li><li> Lassen Sie die Gefäße mit PSS für mindestens 60 Minuten ausgleichen und Quantifizierung der Gefäßdurchmesser mit der Video-Bremssattel. In der Regel sollte Gefäßdurchmesser an mehreren Punkten bestimmt werden (z. B. bei 40, 50 und 60 Minuten), um sicherzustellen, das Schiff stabilisiert hat. </li><li> Beurteilen Sie die Gesundheit des Schiffes mit einem glatten Muskulatur spezifischen Agonisten (zB Phenylephrin, PE) und einer Endothel spezifischen Agonisten (zB Acetylcholin, ACh). Die Konzentration des Agonisten sollte je nach Agonisten eingestellt werden, sondern auch für PE und Ach das Schiff sollte bei jeder Konzentration von kumulativen Addition (10-5M bis 10-9M), um die Superfusat ausgewertet werden. Jeder Agonist Anwendung sollte durch eine Wäsche-Phase (in der Regel 30 Minuten) mit PSS, bis das Schiff wieder in Ruhe Durchmesser getrennt werden. </li><li> Nach der Auswertung des Schiffes Gesundheit, anschließender vasoaktive Medikamente, Fluoreszenzmarkierung und Zelle Tracing Experimente durchgeführt werden können. </li><li> Nach dem Ende des Experiments wird das Tier eine Überdosis von Natrium-Pentobarbital gegeben. Das Tier wird dann überwacht, um sicherzustellen, dass es keine Antwort auf Zehen klemmen und fehlende Atembewegung oder Herzschlag. Zu diesem Zeitpunkt ist dies durch Genickbruch folgte. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nach der Equilibrierung Zeit der Vorbereitung sollte Ausbeute ein klares Bild, dass für die Identifizierung der beiden Arteriole und venule, dass die Leiste Lymphknoten liefert ermöglicht. Es sollte minimal Fettzellen um die Gefäße für Wände der Arteriolen und Venen, klar für die Video-Messschieber bis überlagert Gefäßdurchmesser berechnen beobachten zu ermöglichen. Die integrale Punkt für eine erfolgreiche Vorbereitung ist der Arteriole hat eine reiche Blutversorgung bewegt durch das Lumen und dass es ein hohes Maß an Gefäßtonus (dh die Arteriole hat die Fähigkeit, vasoconstrict und vasodilate zu Muskel-und Endothelzellen spezifische Agonisten bzw. glatt) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Intravital Mikroskopie Bild inguinal Lymphknoten Feed Arteriole (roter Pfeil) Fütterung der Lymphknoten äquilibriert mit physiologischer Kochsalzlösung und läuft an der Seite der Haupt-venule (grüner Pfeil). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Normale vasoaktiven Reaktion auf superfundiert Phenylephrin (PE) durch kumulative neben physiologischer Kochsalzlösung aus den Konzentrationen 10 -9 M bis 10 -5 M. Die Anwesenheit eines robusten Vasokonstriktion ist suggestive der normalen glatten Muskulatur Funktion in der Arteriole. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Normale vasoaktiven Reaktion auf superfundiert Acetylcholin (ACh) durch kumulative neben physiologischer Kochsalzlösung aus Konzentrationen 10 -9 M bis 10 -5 M. Die Anwesenheit eines robusten Vasodilatation ist suggestive der normalen Endothelfunktion in der Arteriole.

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	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten hier vorgestellten bietet die Möglichkeit, Bild Mikrovaskulatur der Lymphknoten in-vivo. So erlaubt es die Mittel der direkten Echtzeit-Beobachtung. Imaging der LN Mikrovaskulatur ist ein einzigartiger Ort, dass man die Schnittstelle zwischen der Immunantwort und das Gefäßsystem untersucht werden können. Mit dieser Vorbereitung kann konzentrieren sich speziell auf die Immunantwort, Veränderungen in den Blutgefäßen, oder Interaktion zwischen den beiden geleitet werden. Wie bei allen experimentellen Ansätzen, hat Standard Intravitalmikroskopie sowohl Vor-und Nachteile. Standard IVM, wie die Vorbereitung hier beschrieben, kann leicht geändert werden, und wurde bereits von den Autoren gezeigt, dass Epifluoreszenzmikroskopie über die Einführung von fluoreszierenden Tracer Farbstoffe oder etikettiert Zellpopulationen ermöglichen. Obwohl Standard IVM nicht gibt die Möglichkeit der dreidimensionalen Bildgebung und Tracing, wie sie durch Zwei-Photonen-Mikroskopie oder Angiographie gegeben werden, wird die Zelle Tracking noch in zwei Dimensionen erreicht so Zell-Zell-und Zell-zu-Gefäßsystem Interaktion zu sein beobachtet und quantifiziert und in Verbindung mit in-vivo-Applikation und anschließender Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern verwendet, um Daten über Protein / Marker Ausdruck in Echtzeit geben. Bemerkenswert ist, benötigen alternative bildgebende Verfahren einer statischen Umgebung für Bilder; Klemmung der OP-Bereich oder die Zugabe von einem Deckglas auf einem flachen Vorbereitung wird häufig benötigt werden. Dies begrenzt, wenn nicht eliminiert, die Fähigkeit zur aktiven perfuse vaskulären oder anderen Vermittlern über die Vorbereitung auf die vaskuläre Integrität und Physiologie etc. oder die Verwendung anderer Techniken wie durchgeführt Vasodilatation Experimente innerhalb der IVM Vorbereitung zu bewerten. Darüber hinaus hat Standard IVM nicht erforderlich, eine völlig ebene Vorbereitung und wird nicht durch Bewegung, wie sie durch die Atmung des Tieres erzeugt betroffen. Dies ermöglicht es Standard IVM in mehr chirurgischen Bereichen mit höherer Reproduzierbarkeit verwendet werden. Dies wird durch die Leisten-Lymphknoten-Vorbereitung hier beschriebene Beispiel. Angesichts der Größe und Form der Lymphknoten, kann das Präparat nicht flach gemacht werden ohne Verletzung des Gewebes und die Lage des Knotens führt zu erheblichen Bewegung durch tierische Atmung. Solche Fragen schwierig sein würde, durch andere Methoden zu überwinden, sind aber leicht mit der Verwendung der Standard-IVM Vorbereitung beschrieben behandelt. Zusammenfassend kann die Herstellung oben beschrieben mit einer beliebigen Anzahl von kombiniert werden andere biochemische-, Gefäß-und / oder immunologischen Techniken wie dem Transfer von Teilmengen aktiviert oder markierten Zellen, die Induktion von Hypoxie und Überexpression von Erschöpfung der vaskulären Mediatoren. Allerdings sind zusätzliche Anwendungen abhängig von der Gesundheit der anfänglichen Vorbereitung. Daher ist es wichtig, immer testen, die Gesundheit der Gefäße wird abgebildet und ausgewertet. Wichtige Punkte zum Erreichen eines Gesundheits-Vorbereitung sind die Gewährleistung der Vorbereitung ständig mit äquilibriert PSS bei Körpertemperatur perfundiert und Minimierung des Kontakts und Stress auf den OP-Bereich während der Operation gelegt.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Kalziumchlorid Dihydrat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Nitroprussidnatrium </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Phenylephrin </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Acetylcholin </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Magnesium-Chlorid-Heptahydrat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sodium Pentobarbitol </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

Lymphknoten (LN ist), im ganzen Körper befinden, sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems. Sie dienen als Ort für die Induktion der adaptiven Immunantwort und damit die Entwicklung von Effektorzellen. Als solche sind LNs Schlüssel zur Bekämpfung von eindringenden Krankheitserregern und Erhaltung der Gesundheit. Die Wahl des LN zur Studie wird von Zugänglichkeit und das gewünschte Modell diktiert, die inguinalen Lymphknoten ist gut gelegen und leicht unterstützt Studien von biologisch relevanten Modelle von Haut-und Schleimhaut-genitale Infektion. Die inguinalen LN, wie alle LNS, verfügt über ein umfangreiches Netzwerk mikrovaskuläre Versorgung mit Blut. In der Regel enthält diese mikrovaskulären Netzwerk der wichtigsten Futtermittel Arteriole der LN, die später Zweige und hohe Venolen (HEV) speist. HEVs sind zur Erleichterung des Handels von Immunzellen in der LN während der beiden Homöostase und Infektionen spezialisiert. Wie HEVs regulieren Menschenhandel in die LN im Rahmen dieser beiden Umstände ist ein Gebiet intensiver Forschung. Die LN-Feeds Arteriole, hat einen direkten Einfluss auf die vorgelagerten HEVs und ist der wichtigste Nährstoff-und Zell-reiches Blut in den LN. Darüber hinaus werden Änderungen im Futter Arteriole bei der Erleichterung Induktion der adaptiven Immunantwort beteiligt. Die LN Mikrovaskulatur hat offensichtliche Bedeutung in der Aufrechterhaltung einer optimalen Durchblutung der LN und Regulierung von Immunzellen Einstrom in die LN, die entscheidenden Elemente in der richtigen Funktion LN und anschließend Immunantwort sind. Die Fähigkeit, die LN Mikrovaskulatur in-vivo-Studie ist der Schlüssel zur Aufklärung, wie das Immunsystem und die Mikrovaskulatur und interagieren beeinflussen sich gegenseitig innerhalb der LN. Hier präsentieren wir eine Methode zur in-vivo-Bildgebung des inguinal Lymphknoten. Wir konzentrieren uns auf die Abbildung der Mikrovaskulatur der LN, wobei besonderes Augenmerk auf Methoden, die die Studie mit gesunden Gefäßen, die Fähigkeit zur Bildgebung von lebensfähigen Schiffe über mehrere Stunden halten und die Quantifizierung des Schiffes Größenordnung zu gewährleisten. Methoden für die Durchblutung der Mikrovaskulatur mit vasoaktiven Medikamenten sowie das Potenzial, zu verfolgen und zu quantifizieren zelluläre Verkehr werden ebenfalls vorgestellt. Intravitalmikroskopie der Leistengegend LN erlaubt die direkte Auswertung der mikrovaskulären Funktion und Echtzeit-Schnittstelle der direkte Schnittstelle zwischen Immunzellen, die LN und die Mikrozirkulation. Diese Technik Potenzial, mit vielen immunologischen Techniken und fluoreszierende Markierung von Zellen als auch manipuliert werden, um Gefäßsystem anderer LNs Studie kombiniert werden.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Eine Technik für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten (LN) wird skizziert. Solche Technik ermöglicht in Echtzeit,<em&gt; In vivo</em&gt; Studium der Lymphknoten Mikrovaskulatur und Struktur sowohl während der Homöostase und Infektionen. Diese Technik kann die Zelle des Menschenhandels Studien und andere Lymphknotenstationen angepasst werden.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K Aufrufe.  University of Northern British Columbia. Eine Technik für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten (LN) wird skizziert. Solche Technik ermöglicht in Echtzeit, In vivo Studium der Lymphknoten Mikrovaskulatur und Struktur sowohl während der Homöostase und Infektionen. Diese Technik kann die Zelle des Menschenhandels Studien und andere Lymphknotenstationen angepasst werden.

Serie: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...