Wir möchten Dr. David Olivieri für die kritische Durchsicht des Manuskripts, Dr. Nuno Moreno danken für die logistische Hilfe für unsere Tier-Halter und Heizkissen und Dr. Vijay K. Kuchroo für die Sachspende von Foxp3-KI gfp / GFP bauen Mäusen. Diese Arbeit wird durch &quot;Fundação para Ciência e Tecnologia&quot; (FCT, Portugal), Grant # PTDC/EBB-BIO/115514/2009 unterstützt.

1. Tierische Vorbereitung Wichtige Hinweise: BM Zellsuspensionen und Thymus-Transplantationen wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die BM-Suspensionen wurden in die Hauben unserer Zellkultur Zimmer vorbereitet, während die Thymus-Transplantation in den Operationssaal in unserer Tier-Einrichtung befindet, durchgeführt wurde. Um zu halten und Gewährleistung dieser aseptischen Bedingungen, durften wir nicht zu unserem Video in diesen Orten aufzunehmen. Allerdings wurden alle chirurgischen Materialien autoklaviert und der chirurgischen Bank war zuvor mit Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) und 70% Ethanol gereinigt. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) und sie wurden im Einvernehmen mit der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Richtlinien. Die Zulassung ID-Nummer ist AO10/2010. Alle Bild-Experimente wurden Klemme Verfahren und die Tiere wurden unmittelbar nach dem Ende des Bildes eingeschläfertErwerb. Die detaillierte Vorgehensweise ist wie folgt: <ol><li> Bestrahlen (mit einem γ-Strahler) 8 Wochen alte Nacktmäuse mit 900 rad auf die endogenen hämatopoetischen Vorläufer innerhalb des Knochens Zucchini (BM) zu zerstören. Nach der Bestrahlung Rückkehr der Tiere in ihre Käfige, bis Sie den Spender BM-Zellen für die intravenöse Injektion und weitere BM Rekonstitution vorzubereiten. Das BM übertragen wurde 1 h nach der Bestrahlung durchgeführt. </li><li> Trennen Sie die BM Spendertiere. Schienbeine und Oberschenkel der Hinterbeine von einem Tier sind in der Regel genug zu rekonstruieren bis zu 3 Empfänger Tiere. Nach Euthanasie mit CO 2, entfernen Sie den hinteren Gliedmaßen und entfernen Sie dann die Haut und Muskeln von den Knochen. </li><li> Cut am geschlossenen Ende eines jeden Knochen und spülen Sie es mit PBS (oder RPMI) oder quetschen sie alle in einem Mörser mit einem Stößel, mit 2 ml PBS (oder RPMI), um den BM zu entfernen. </li><li> Stören des BM-Struktur in ein Single-Cell-Suspension durch Wiederholungen der kräftige Aspiration using einer P1000 Pipette. Alternativ können Sie auch den BM während einer 21G Kanüle mehrmals. Zentrifuge (400g, 5 min, RT), resuspendieren Zellen in PBS und intravenös in Ihre nude-bestrahlten Empfänger. In unseren Experimenten verwendeten wir BM von Foxp3-KI gfp / GFP-Mäuse, wo alle regulatorischen T-Zellen (Tregs) GFP 1 Schnellzugwagen wird. </li><li> Die Akzeptanz des Spenders BM tritt in den ersten Tagen nach der Übertragung, da Nicht-BM-rekonstituierte Tiere nicht überleben können mehr als 14 Tage. Allerdings sollte man für 4 bis 6 Wochen warten, um in vollem Umfang der Einziehung aller BM Fächer zu ermöglichen. Bactrim (Roche) wurde auf dem Wasser (2 mg / ml) während der ersten Woche nach der Bestrahlung hinzugefügt, um das Risiko von bakteriellen Infektionen zu verringern. </li><li> Embryonale Thymus-Transplantation wurde bereits 2 beschrieben. Kurz gesagt, beginnen Brutpaare isogenen Mäusen und prüfen zum Einstecken (Nachweis des Koitus) jeden Tag. Separate gesteckt Weibchen und CO 2-euthanize sie am Tag 15 der pregnancy (Beobachtung der Stecker ist Tag 1 der Schwangerschaft). Entfernen Sie die Embryonen und die Thymusdrüse. Legen Sie die embryonale Thymus in kaltem PBS bis zum Transfer. </li><li> Zur Durchführung des Thymus Transplantation betäuben BM-Empfänger Nude Mäuse mit Ketamin (120 ug / g Maus Gewicht) / Xylazin (16 pg / g Maus Gewicht) und bewahren Sie sie auf einem Heizkissen bei 37 ° C, bis sie sich bewusstlos. </li><li> Chirurgisch Setzen der Niere zur Transplantation des Thymus durchzuführen. Zuerst reiben Sie die Haut mit ChloraPrep (CareFusion Inc.) und 70% Ethanol. Dann eine 1 cm auf der Haut des Rückens-lateral Körperteil des Tieres, 2 mm unterhalb des letzten Brust-Rippe geschnitten. </li><li> Cut der Bauchhöhle und ziehen Sie die Niere von diesem Hohlraum. Machen Sie einen kleinen oberflächlichen Schnitt in der Nierenkapsel mit einem Skalpell. Mit einer Pinzette mit einer sehr dünnen Spitze einen Beutel unter die Nierenkapsel des Empfängers Maus und bis zu 4 Thymus Lappen in diese Tasche. </li><li> Legen Sie die Niere b<html> ack an seinen Platz, Naht der Bauchhöhle mit einem oder zwei Stiche, und schließen Sie die Haut von Mäusen mit der gleichen Naht-Methode. Alternativ können Nähte erfolgt über chirurgische Kleber werden. </li><li> Inject analgetische (Butorphanol bei 5 mg / kg) subkutan direkt nach Beendigung der Operation zu Tier Schmerzen zu vermeiden und halten die Tiere in einem Heizkissen, bis sie aus der Narkose zu erholen beginnen. Mäuse sind individuell für die ersten 3 Tage nach der Transplantation zu Käfig Kumpels aus dem Entfernen der Fäden zu verhindern Käfig. Entfernen Stiche nach 1 Woche. </li><li> Nacktmäusen keine T-Zellen. Daher können Sie die Thymusdrüse Transplantat Akzeptanz durch die Überwachung der Anteil der CD4 + oder CD8 + T-Zellen im Blut zu bewerten. Einmal pro Woche, 2 Wochen nach Thymus-Transplantation, bluten die Tiere und Flecken des Blutes mit anti-CD4 und anti-CD8 monoklonalen Antikörpern (MAbs). Wenn die CD4: CD8-Verhältnis von etwa 2:1 ist, ist die transplantierten Thymus voll funktionsfähig (Abbildung 1). </li></ol>&quot;&gt; 2. Intravital Bildaufnahme Bereiten Sie alle Materialien, die Sie im Voraus müssen und legte sie beiseite wird. <ol><li> Anesthetize Tiere mit Ketamin / Xylazin (gleiche Dosen in Punkt 1.5 beschrieben) und platzieren Sie sie auf einem Heizkissen bei 37 ° C. Inject 100 ul von Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran (20 mg / ml in PBS) intravenös Zukunft Visualisierung des Blutflusses erlaubt. </li><li> Expose der Niere mit der transplantierten Thymus nach dem Protokoll bereits in Punkt 1.6 beschrieben. </li><li> Um zu verhindern, die Niere von der Rückkehr in seine ursprüngliche Position, in der Nähe der seitlichen Seiten der Hautschnitt mit Stichen. </li><li> Legen Sie ein Stück PBS-getränkte Baumwolle auf der Oberseite des Organs zu halten sie feucht. </li><li> Legen Sie die Heizkissen auf den Tierhalter Stufe (Abbildung 2A). </li><li> Legen Sie das Tier auf dem Heizkissen in der Tierhalter, Orgel up (Abbildung 2B). </li><li> Pinch das Organ an beiden Seiten mit einer Klemme made von dünnen Aluminiumfolie (Abbildung 2C). </li><li> Schließen Sie die Tierhalter und Ort der Oberheizung Sonde so nahe wie möglich zu Ihrem Gewebe (Abb. 2D). Diese Heizung Sonde misst ständig die Orgel Temperatur und sendet diese Informationen an die Heizung, die elektrischen Strom einzustellen, halten sie bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die PBS-getränkte Baumwolle und fügen niedrig schmelzende Agarose (2% in PBS) bei 30 ° C am Anfang Ihrer Vorbereitung. </li><li> Decken die gesamte Vorbereitung mit der Oberheizung (Abbildung 2E). In die Öffnung an dieser Heizung gibt es ein Deckglas Isolierung der Agarose von den objektiven (Abbildung 2f). Überwachen Sie die Maus Anästhesie und injizieren eine halbe Dosis erhöhen alle 40 min. Nach der Bildaufnahme, einschläfern des Tieres mit CO 2. </li></ol> Hinweis: Bilder von der Aluminiumfolie Clip und der Oberheizung sind in Abbildung 3 dargestellt. 3. Zwei-Photonen-Imaging-Übernahme Wir haben eine aufrechte &quot;Prairie Ultima XY&quot; Zwei-Photonen-Mikroskop. Unser System ist mit einem Ti ausgestattet: Saphir-Laser, vier Top-PMTs zur gleichzeitigen bis zu 4-Kanal-Akquisitionen und einem 20x Wasser Immersionsobjektiv. <ol><li> Schalten Sie den Ti: Saphir-Laser und die ganze Mikroskop-System. </li><li> Add dichroitische Spiegel und Filter-Sets nach den Wellenlängen gewünscht. In unserem Fall haben wir eine Olympus-BX2 Chroma Halter mit einem 565 nm dichroitischen Spiegel, ein 525/50 nm Filter (für Foxp3-GFP-Signal), und ein 595/50 nm Filter (für Dextran-Rhodamin-B-Signal in die Blutgefäße ). Die Laser-Wellenlängenbereich verwendet wurde zwischen 880 bis 900 nm liegt. </li><li> Fügen Sie den Tierhalter an das Mikroskop, anschließen und einschalten alle Heizungen, Wasser hinzufügen, auf der Oberheizung Blende, vorsichtig das Ziel ins Wasser, und konzentrieren sich auf ein Schiff oder ein GFP-Tregs. </li><li> Mit dem Mikroskop x, y, z externe Steuerung, schnell Umfrage des Gewebes zu einer Region finden<html> von Interesse. </li><li> Stellen Sie den Gewinn aus dem PMTs zu Farbseparation optimieren und die Höhe der Laser benötigt, um ein ausreichendes Signal gegenüber dem Hintergrund zu erreichen. Versuchen Sie, die minimale Menge von Laser verwenden, um Foto-Schaden von Gewebe zu vermeiden. </li><li> Sobald der Region Interesse liegt, beginnen Zeitraffer-Bildgebung. In unserem Fall ein typisches 5D (x, y, z, t und Farbe) besteht Übernahme-Protokoll für den Erwerb aufeinander folgenden Bildern einer 50 mu m-Tiefe Gewebe Volumen, in 4,0 um z-Schritten, x-und y-Länge von 140 um geteilt jeder. Jeder Band dauert etwa 30 Sekunden erfasst werden. Daher werden 60 Akquisitionen durchführen rund 30 min von der Bildaufnahme. </li><li> Übertragen Sie die Daten zu den institutionellen Server und verwenden ImageJ, Imaris oder Volocity Software, multi-dimensionale Darstellung und Zell-Tracking durchzuführen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <html> g1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. . Embryonale Thymus Akzeptanz und Funktion Nach BM erholen, wurden embryonale Thymus zu BM rekonstituierten Tieren transplantiert, zwei Wochen nach Thymus Transplantation dieser Mäuse wurden einmal pro Woche ausgeblutet der Anteil der T-Zell-Subtypen durch Färbung mit anti-CD4 oder anti-CD8-Monitor MAbs. Wir haben überlegt, den Thymus wurde erfolgreich bei Tieren mit einer CD4 akzeptiert: CD8-Verhältnis um 1.5-2.0:1 (A). Um zu bestätigen, seine Funktionalität, wir einigen Thymus-transplantierten Tiere getötet und gegenüber der Prozentsatz der verschiedenen Thymozyten-Subpopulationen mit WT-Mäusen (B). Der Anteil der Doppel-negative (DN; CD4 - CD8 - Thymozyten) Subpopulationen (durch Färbung mit anti-CD25 und anti-CD44 mAk), Doppel-positive (DP; CD4 + CD8 + Thymozyten) und Single-positive (SP) CD4 + oder CD8 + Thymozyten waren ähnlich zwischen diesen Tieren. ig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Tierische Inhaber Montage. Nach tief narkotisiert, das Tier auf einem Heizkissen gelegt wird, die zuvor auf der Oberseite des Tieres Inhaber Stufe (A) montiert. Die Niere, die die transplantierten Thymus ist nach oben (B). Eine Aluminiumfolie Klemme zart kneift die ganze Niere (C) zu halten, statt. Abb.. 1C einfügen zeigt im Detail die Klemme. Der obere Teil des tierischen Halter ist in Ort (D) gestellt. Die PBS-getränkte Baumwolle ist von der Spitze des Organs, durch warme niedrig schmelzende Agarose ersetzt entfernt, und die Oberheizung hinzugefügt wird (E). Schließlich ist die ganze Versammlung an das Mikroskop übertragen, hier vertreten durch das Objektiv (F). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> Abbildung 3. Details der Inhaber Teile. Diese Bilder zeigen die Aluminiumfolie Klammer (A) hält die Niere (B). Beachten Sie auch die Region, in der die transplantierten Thymus befindet. Diese etwa zeigt die Regionin den Thymus Kapsel geschnitten und machen die Tasche, um die embryonale Thymus setzen. Die Oberheizung Deckglas (C) wurde mit Silikonkleber an ihrem unteren Teil (D) fest. Movie 1. Intravital Bildgebung von Foxp3-GFP + Thymozyten im Thymus, wo die physiologischen Ebenen der Sauerstoffversorgung und Temperatur (37 ° C) während des gesamten Prozesses gehalten wurden. Beachten Sie die Durchblutung und die Bewegung der Tregs. Diese Geschwindigkeiten können gemessen und verglichen werden mit den veröffentlichten Daten. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.</a> Movie 2. Intravital Bildgebung von Tregs in einem Thymus, wo die Bilder bei 30 erworben wurden ° C. Beachten Sie das Fehlen von Bewegung und die runde Form der Zellen trotz der Aufrechterhaltung der Durchblutung. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Klicken Sie hier um den Film anzusehen.</a>

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	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Papier haben wir gezeigt, die Verfahren für die Zwei-Photonen-Imaging von Thymozyten im Inneren eines lebenden Tieres. Wir haben auch beschrieben, einige Parameter, die man sorgfältig kontrollieren sollten, wie die Fortsetzung des Blutflusses und der Aufrechterhaltung der Orgel Temperatur während der bildgebenden Verfahren. Dennoch, trotz sorgfältiger Anstrengungen, um die Orgel stabil ist, kann Bewegungsartefakte wie &quot;Organ driften&quot; auftreten. Posterior Bildkorrektur kann durch die Entwicklung von Algorithmen speziell für diesen Zweck konzipiert durchgeführt werden. Weitere Bildanalyse könnte auch die Quelle für neue Protokolle Entwicklung, die Fehler zu minimieren sucht. Der Thymus ist das Organ, wo alle T-Zellen produziert und sind daher es das Organ, in dem Immunologen in das Verständnis der Generation von γδ interessiert ist, wird CD4 oder CD8 T-Zellen ihre Aufmerksamkeit. Die meisten Studien über T-Zellen sind auf Unterschiede in den Zahlen und / oder Stabilität dieser Basis cEllen nach verschiedenen in vitro / in vivo Manipulationen. Allerdings erst nach der in vivo-Visualisierung konnten wir beobachten die Interaktion zwischen Zellen des Immunsystems in der Aufrechterhaltung der Homöostase 3-7 beteiligt. Daher ist die in vivo Beobachtung von Thymozyten wahrscheinlich eine der wichtigsten fehlenden Informationen besser zu verstehen, T-Zell-Biologie. Intravital TPM bietet ein detailliertes Bild der T-Zell-Bewegungen und Interaktionen, und wir zeigen hier, wie es für detaillierte Thymozyten Studien eingesetzt werden kann. Allerdings hat jede Technik ihre Grenzen. Während intravital Imaging Acquisition ist die genaueste System zur reflektierenden Zellen Verhalten im Inneren des Körpers, es ist auch wahr, dass explantierten Bildaufnahme von Organen weniger aufwändig ist und verwendet wurde, um wichtige Informationen über das Immunsystem 8,9 sammeln. Darüber hinaus kann man nicht leugnen intravital bildgebenden Verfahren eine Operation erforderlich, um Gewebe und Blutgefäße in narkotisierten Tiere auszusetzen,die per se könnte eine Veränderung in der gesamten Organs Physiologie 10. Dennoch gibt es nicht-invasiv Methoden, die die Artefakte, die durch den chirurgischen Eingriff 11 und neue Methoden verursacht abschaffen werden entwickelt, die besser im Voraus vorbereiten zu verwendenden Tiere 12 sein. Daher werden neue chirurgische Verfahren und Gebühren zu minimieren oder zu umgehen tatsächlichen Grenzen der intravitalen Imaging Erwerb und sich mehr und mehr zugänglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Wir haben gezeigt, dass die Methode, die wir beschrieben haben, machbar ist und es meldet alle in vivo systemische Manipulationen, wie Medikamentengabe, die wir verwendet haben. Daher empfehlen wir den Einsatz dieser Methode in Verbindung mit ex vivo Techniken bereits zur Verfügung, um die Ergänzung und Verstärkung weitere Studien über die Thymozyten Entwicklung.

<table border="1">
<thead>
<tr>
<td>Name of the reagent</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue number</td>
<td>Comments</td>
</tr>
</thead>
<tbody>
<tr>
<td>Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R9379</td>
<td>prepare stock at 20 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Two-photon microscope</td>
<td>Prairie Technologies Inc.</td>
<td>Prairie Ultima X-Y</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser</td>
<td>Coherent, Inc.</td>
<td>Chameleon Ultra Family</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>20x/1.00 NA immersion objective</td>
<td>Olympus Inc.</td>
<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Holder (Filters/Dichroic)</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>91018 BX2 (U-MF2)</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>525 nm/50 filter</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>ET525/50m</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>595 nm/50 filter</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>ET595/50m</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>565 nm dichroic</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>565dcxr</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaris software</td>
<td>Bitplane AG Inc.</td>
<td>Imaris</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Volocity</td>
<td>PerkinElmer Inc.</td>
<td>Volocity</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>NIH, USA</td>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) bietet Bildaufnahme in tiefe Bereiche innerhalb Geweben und Organen. In Kombination mit der Entwicklung neuer Werkzeuge und stereotaktische Eingriffe, wird TPM eine leistungsfähige Technik, die auf &quot;Nischen&quot; im Inneren Organe zu identifizieren und zellulären &quot;Verhaltensweisen&quot; in lebenden Tieren zu dokumentieren. Während intravital Bildgebung liefert Informationen, die am ehesten der realen zellulären Verhalten innerhalb des Organs, ist es sowohl aufwändiger und technisch anspruchsvoll im Hinblick auf erforderliche Ausrüstung / Verfahren als alternative ex-vivo-Bildgebung Akquisition. So beschreiben wir ein chirurgischer Eingriff und Roman &quot;stereotaktische&quot; Organ Halter, die uns an die Bewegungen des Foxp3 + Zellen innerhalb des Thymus verfolgen können. Foxp3 ist der Master-Regler für die Generierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Dh: Darüber hinaus können diese Zellen nach ihrer Herkunft klassifiziert werden. Thymus-differenzierten Tregs sind &quot;natürlich vorkommenden Tregs&quot; (nTregs) genannt, als opposed zu peripher umgewandelt Tregs (pTregs). Obwohl erhebliche Menge an Forschung hat in der Literatur über den Phänotyp und die Physiologie dieser T-Zellen berichtet wurde, ist sehr wenig über ihre in-vivo-Wechselwirkungen mit anderen Zellen bekannt. Dieser Mangel kann durch das Fehlen von Techniken, die solche Beobachtungen ermöglichen würde. Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen Abhilfe schafft eine für diese Situation. Unser Protokoll besteht in der Verwendung Nacktmäusen, dass eine endogene Thymus fehlen, da sie eine pünktliche Mutation in der DNA-Sequenz, die die Differenzierung von einigen epithelialen Zellen, einschließlich Thymus Epithelzellen Kompromisse. Nacktmäuse wurden gamma-bestrahlt und rekonstituiert mit Knochen Zucchini (BM) aus Foxp3-KI gfp / GFP-Mäusen. Nach BM Erholung (6 Wochen), erhielt jedes Tier embryonalen Thymus-Transplantation in die Nierenkapsel. Nach Thymus Akzeptanz (6 Wochen) wurden die Tiere narkotisiert, der Niere, die dietransplantierten Thymus ausgesetzt war, fest in unsere Orgel Inhaber und hielt unter physiologischen Bedingungen in vivo Bildgebung von TPM. Wir haben mit diesem Ansatz auf dem Einfluss von Drogen in die Generierung von regulatorischen T-Zellen zu studieren.

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Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K Aufrufe.  Instituto Gulbenkian de Ciência. We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of “niches” within the thymus where T cell development occurs.

Serie: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...