Die mini-endoskopische Bewertung des Dickdarms bei lebenden Mäusen bietet eine wichtige experimentelle Unterstützung für die Untersuchung von Darmmanifestationen der akuten Graph-versus-Host-Krankheit GvHD bei allogener, hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Die nicht-invasive Beurteilung der akuten GvHD-bedingten Kolitis kann als funktionierender Ersatz für Goldstandard-Histopathologie fungieren, wodurch wiederholte Tieropfer überflüssig werden, um Gewebeproben zu erhalten. Demonstriert wird das Verfahren von Vera Buchele, einer Post-Doc aus meinem Labor.
Einen Tag nach der Ganzkörperbestrahlung der Empfänger-BALB/c-Mäuse legen Sie eine CD-45.1 live 5B6 SJL-Spendermaus in die anfällige Position auf eine saubere Arbeitshülle und verwenden Sie eine 13 cm gekrümmte und gezackte Spitze einer Simkinzange, um das Fell an einer Achillesferse zu heben. Mit gehärteten 8,5 cm feine Schere mit geraden Spitzen, incise die Haut zwischen der Zange und eine Ferse, längen den Schnitt kranially, um die Entfernung der Haut und Fell von den Hinterbeinen zu erleichtern. Wenn die Haut von den Hinterbeinen entfernt wurde, durchschneiden Sie jede Hüfte, knöchel- und Kniegelenk.
Bewahren Sie den Oberschenkel und den Schaft jedes Hinterteils in einer einzigen 92-mm-Petrischale auf Eis, und entfernen Sie sorgfältig so viel Muskel wie möglich von jedem Knochen, wobei jeder gereinigte Oberschenkelknochen und jede Tibia in ein 50-ml-Rohr sterilen RPMI 1640 Medium auf nassem Eis übertragen wird. Um das Knochenmark zu isolieren, übertragen Sie einen Knochen nach dem anderen in eine neue 92-ml Petrischale, die mit frischem RPMI 1640 Medium gefüllt ist, und verwenden Sie ein Skalpell, um die Enden von jedem Knochen abzuschneiden. Als nächstes verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 26-Spur-Nadel, um die Knochen mit 1 ml frischem Medium gleichzeitig in ein 50-ml-Sammelrohr mit 5 ml Medium zu spülen.
Wenn alle Knochen gespült wurden, pipette die krümeligen Knochenmarkstücke mehrmals auf und ab, um eine einzellige Suspension zu erzeugen, bevor die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Netzsieb-Zellensieb in ein neues 50-ml-Sammelrohr gefiltert werden. Pellet die Zellen durch Zentrifugation und re-suspendieren die Zellen in 5 ml Ammoniumchlorid Kaliumlyse Puffer für eine dreiminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation, stoppen Sie die Reaktion mit 10 ml PVS, und zentrifugieren Sie die Zellen wieder.
Setzen Sie das Pellet in 2 ml frischer PVS zum Zählen wieder aus, und legen Sie sechsmal 10 auf die sechste Zelle aliquot für die zytometrische Analyse des Downstream-Flusses beiseite. Als nächstes verwenden Sie ein handelsübliches Zellreinigungskit, um die CD90.2-positiven T-Zellen aus der einzelzelligen Knochenmarksuspension nach den Anweisungen des Herstellers magnetisch zu dezimieren und eine einmal 10 bis zur sechsten Zelle aliquot des T-Zell-depleted Eluats für die nachgeschaltete zytometrische Analyse der Zellreinheit und -zusammensetzung vor und nach der Trennung beiseite zu legen. Verwenden Sie dann eine 1-ml-Spritze, die mit einer 30-Spur-Nadel ausgestattet ist, um fünfmal 10 in die fünfte T-Zell-depleted Knochenmarkzellen in 100 Mikroliter PVS intravenös in den retrobulbaren Raum der venösen Sinus jedes bestrahlten Empfängers zu injizieren.
Legen Sie am nächsten Tag eine Milz, die von einem Spendertier geerntet wurde, auf ein 40-Mikrometer-Netzsieb in einem 50-ml-Sammelrohr und drücken Sie mit einem Spritzenkolben das Milzgewebe durch das Sieb in das Rohr. Waschen Sie das Sieb und den Kolben mit PVS, um alle Splenozyten zu sammeln, und pellet die Zellen durch Zentrifugation. Nachdem rote Blutzelllyse nachgewiesen wurde, suspendieren Sie die weißen Blutkörperchen für die Zählung erneut und legen Sie eine sechsmal 10 zur sechsten Zelle aliquot für die nachgeschaltete zytometrische Analyse des Flusses beiseite.
Für eine gesamtCD3-positive T-Zell-Isolierung von Gesamtsplenozyten verwenden Sie ein handelsübliches Zellreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und legen sie ein mal 10 bis zum sechsten CD3-positiven T-Zell-Aliquot aus der positiven Zellfraktion für die nachgeschaltete zytometrische Analyse der Zellreinheit und -zusammensetzung vor und nach der Trennung beiseite. Dann injizieren Sie siebenmal 10 in die fünfte alloreaktive CD3-positive T-Zellen in 100 Mikroliter PVS intravenös in den Retrobulbar-Raum jeder Empfängermaus, um GvHD zu induzieren. Um GvHD-bezogene Läsionen durch Mini-Endoskopie des distalen dickdarmen Bereichs zu bewerten, heben Sie den Schwanz eines Empfängertiers mit einer Hand knapp über die Schwanzwurzel und verwenden sie mit der anderen Hand, um das Endoskop vorsichtig über den Anus in das Rektum einzufügen.
Während der Luftstrom das kolorektale Lumen aufbläht, bewegen Sie das Endoskop langsam und vorsichtig in aboraler Richtung vorwärts. Um Darmverletzungen zu vermeiden, halten Sie das Endoskop im mittleren Bereich des Lumens mit dem Live-Videobildschirm, um bei dieser Positionierung zu helfen. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Videostreams und der Bewertung der Entzündung, indem Sie die GvHD-bedingte Entzündung des Dickdarms bewerten, indem Sie die Parameter wie dargestellt bewerten.
Wenn ein Punkt gefunden wurde, bewegen Sie das Endoskop sanft und leicht hin und her, um die verschiedenen Parameter zu bewerten. Um den Parameter Transluzenz und Stuhlkonsistenz zu beurteilen, positionieren Sie das Endoskop in einem größeren Abstand in Bezug auf die Kolonwand. Um die Granularität und Vaskularität der Läsion zu beurteilen, positionieren Sie das Endoskop in unmittelbarer Nähe zur Kolonwand und tragen Sie sorgfältig gut dosierte Spannung auf die Kolonwand mit der Spitze des Endoskops auf.
Beenden Sie nach Abschluss des Bewertungsprozesses die Aufzeichnung. Im Vergleich zu Kontrollen produziert die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation, wie gezeigt, eine reproduzierbar robuste Induktion eines systemischen GvHD-Phänotyps mit zunehmend steigenden klinischen GvHD-Scores bei Empfängertieren. Diese mini-endoskopisch bewertbaren Kriterien wurden speziell an die zuvor gemeldete syngene Kolitis im Zusammenhang mit allo-response-gesteuerten Colitis-Scoring-Parametern für die genaue Beschreibung, Bewertung und Einstufung von Darm-GvHD-Krankheit-assoziierten Läsionen im distalen Dickdarm angepasst.
Tatsächlich ermöglicht das mini-endoskopisch basierte Benotungssystem eine einfache Diskriminierung von spender-lymphozytenempfangenden Mäusen mit schweren Anzeichen einer Darmentzündung von Kontrollmäusen, die im Wesentlichen ohne GvHD sind. Die Invalidität des mini-endoskopisch basierten Benotungssystems bestätigte, dass der Dickdarm von Mäusen, die stark von GvHD-bedingten Entzündungen betroffen sind, ähnlich starke histopathologische Anzeichen einer Entzündung aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigten Dickdarmgewebe von Kontrollmäusen keine möglichst leichten histopathologischen Anzeichen einer Entzündung, im Einvernehmen mit dem virtuellen Fehlen von mini-endoskopisch nachweisbaren Anzeichen einer Kolitis.
Darüber hinaus zeigen Korrelationsstudien zwischen mini-endooskopischer und histopathologisch bewerteter Kolitisaktivität und systemischen GvHD-Scores, dass mini-endoskopisch bestimmte Partituren von weniger als oder gleich drei zuverlässig das Fehlen von mittel- bis höhergradigen darmen GvHD-assoziierten Kolonentzündungen vorhersagen, die aus histopathologischer Benotung erhalten wurden. Darüber hinaus zeigt die Schwere der endoskopisch bewerteten Darm-GvHD eine Korrelation mit der systemischen GvHD-Krankheitsaktivität. Um die Ergebnisse der mini-endoskopischen Bewertung von Darmentzündungen zu standardisieren und die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Mäusen und Experimenten im Laufe der Zeit zu gewährleisten, sollte eine definierte anatomische Stelle für die Bewertung ausgewählt werden.
Neben der Punktierung von Kolonentzündungen ermöglicht der eingebaute Arbeitskanal innerhalb des mini-endoskopischen Aufbaus das Abrufen von sichtgeführten Gewebebiopsien, die für verschiedene nachgeschaltete Analysen, wie z. B. standardhistopathische Analysen, anwendbar sind. Aufgrund der nicht-invasiven Natur der Mini-Endoskopie kann die akute GvHD-bedingte Kolitis nahezu jederzeit innerhalb desselben Tieres wiederholt beurteilt werden, was faszinierende Einblicke in Darm-GvHD gibt.
