Mit diesem Protokoll können die ubiquitinierten Formen eines bestimmten Proteins effizient von Säugetierzellen gereinigt werden, was Studien über die Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Proteinfunktion erleichtert. Die Reinigung von ubiquitinierten Proteinen in Säugetierzellen im Vergleich zur Reinigung in vitro behält den Ubiquitin-Bindungsmodus von Zielproteinen unter stärker radiologischen Bedingungen bei. Beginnen Sie mit der Zugabe von 1,5 Milliliter reduziertem Serummedium in drei 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Fügen Sie jeder Röhre transfektionsbereite Plasmid-DNA hinzu und fügen Sie 0,2 Mikrogramm grün fluoreszierendes Proteinplasmid hinzu, um die Transfektionseffizienz zu überwachen. Fügen Sie 78 Mikroliter Liposomentransfektionsreagenz zu 4,5 Milliliter reduziertem Serummedium in einem anderen Zentrifugenröhrchen hinzu, um die Liposomen zu verdünnen. Mischen Sie gründlich, indem Sie die Tube schnippen und lassen Sie sie dann fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen.
Geben Sie 1,5 Milliliter der verdünnten Liposomenlösung in jedes Röhrchen, das 1,5 Milliliter der verdünnten DNA-Lösung enthält. Die Plasmide gründlich mischen und mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur mit den Liposomen vernetzen. Verwerfen Sie das Originalmedium aus den Petrischalen und geben Sie neun Milliliter des reduzierten Serummediums in jede Schale.
Fügen Sie drei Milliliter der Liposomen-DNA-Mischung hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie die Platte dreimal vorsichtig hin und her und dann dreimal links und rechts schütteln, um eine gleichmäßige Verteilung der Mischung auf der Platte zu gewährleisten. Kulturieren Sie die Zellen im befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium nach vier bis sechs Stunden und kultivieren Sie die Zellen für 24 bis 36 Stunden.
Nach 24 bis 36 Stunden behandeln Sie die Zellen mit MG132 in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren für vier bis sechs Stunden. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. Geben Sie einen Milliliter PBS in die Schale.
Entfernen Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem sauberen Schaber abkratzen und die Zellsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen geben. Zentrifugieren Sie bei 700 G für fünf Minuten, um die Zellpellets zu sammeln. Fügen Sie 800 Mikroliter des eiskalten FLAG-Lysepuffers, ergänzt mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail, in die Zellen in jedem Röhrchen hinzu.
Mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator oder einer Pipettenpistole und inkubieren Sie die Mischung dann 30 Minuten lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius. Ultraschall die Mischung auf dem Eis mit jedem Puls von einer Sekunde Dauer und setzen Sie die Mischung fünf bis 10 kurzen Impulsen aus. Inkubieren Sie die Mischung auf einem Rotator bei 40 U/min für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann zentrifugieren Sie die Ultraschallproben bei 8.000 g für 20 bis 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Aliquot 80 Mikroliter des Zellextrakts und mischen Sie mit 20 Mikrolitern 5X SDS Ladepuffer.
Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 98 Grad Celsius. Zwei Minuten auf Eis abkühlen lassen und bis zum Gebrauch bei minus 20 Grad Celsius lagern. Verwenden Sie diese Proben als Eingabegruppe, um die Proteinexpression zu überwachen.
Als nächstes fügen Sie 30 Mikroliter des Anti-FLAG M2-Antikörpers konjugierte Perlen zu den verbleibenden Zellextrakten hinzu und inkubieren auf einem Rotator bei vier Grad Celsius für mindestens vier Stunden oder über Nacht. Zentrifugieren Sie bei 1.500 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius, um die Perlen zu sammeln. Fügen Sie einen Milliliter des eiskalten FLAG-Lysepuffers zu den Perlen hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen.
Wiederholen Sie diesen Schritt vier- bis sechsmal und fügen Sie dann 40 Mikroliter der FLAG-Peptide in einer Endkonzentration von 200 Nanogramm pro Mikroliter zu den Perlen hinzu. Wie zuvor gezeigt, auf einem Rotator inkubieren und dann bei gleicher Temperatur zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 10 Mikroliter 5X SDS-Ladepuffer hinzu.
Kochen Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 98 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann zwei Minuten auf Eis. Geben Sie einen Milliliter des eiskalten PBS zu den Zellpellets und mischen Sie gleichmäßig. Aliquot 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen als Eingangsprobe geben und bei 700 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um die Zellpellets zu sammeln.
Fügen Sie der Eingangsprobe 80 Mikroliter FLAG-Lysepuffer hinzu und mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator, wie zuvor gezeigt. Die Zellen eine Stunde lang auf Eis lysieren und dann erneut für 20 bis 30 Minuten zentrifugieren. Nach der Zentrifusion aliquot 80 Mikroliter des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben und 20 Mikroliter 5X SDS-Ladepuffer zum Überstand geben.
Kochen Sie die Mischung bei 98 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten und kühlen Sie dann zwei Minuten auf Eis ab. Zentrifugieren Sie die restlichen 900 Mikroliter der Zellsuspension bei 700 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um das Zellpellet zu sammeln. Fügen Sie einen Milliliter Ubiquitinpuffer 1 zu den Zellpellets hinzu und mischen Sie, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
Die Zelllysate 10 bis 20 Runden Ultraschall auf Eis unterziehen, bis die Lösung nicht mehr viskos ist, und dann die Lösung zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dem Überstand 30 Mikroliter nickelgeladenes Harz hinzu. Inkubieren Sie auf einem Rotator bei 15 U/min für vier Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann für zwei Minuten.
Nach der Zentrifusion die Perlen sammeln und einen Milliliter Ubiquitinpuffer 1 hinzufügen. Inkubieren Sie mit Rotation in einem Shaker für 10 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann erneut bei 1.500 G für zwei Minuten, wie zuvor gezeigt. Fügen Sie einen Milliliter Ubiquitinpuffer 2 zu den Perlen hinzu und führen Sie eine Inkubation gefolgt von einer Zentrifugation durch, wie zuvor gezeigt, um die Perlen zu sammeln.
Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Als nächstes fügen Sie den Perlen einen Milliliter PBS hinzu und befolgen Sie das gleiche Verfahren für Inkubation und Zentrifugation, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie diesen Schritt erneut.
Eluierte Proteine durch Inkubation der Beads mit 40 Mikrolitern Imidazol in einer Endkonzentration von 0,5 Molar für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation erneut bei 1.500 G für zwei Minuten zentrifugieren. Den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen geben und 10 Mikroliter 5X SDS-Ladepuffer hinzufügen.
Kochen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 98 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann zwei Minuten auf Eis ab. Die Proben werden mittels SDS-PAGE aufgelöst und dann durch Western Blotting auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, um Zielproteine mit den entsprechenden Antikörpern nachzuweisen. Starten Sie das Chemilumineszenz-Bildgebungssystem, um Signale von Western Blotting zu erkennen.
Legen Sie die Nitrozellulosemembran mit der Vorderseite nach oben in die Camera Obscura. Kodieren Sie die Substratlösung gleichmäßig auf der Membran mit einer Pipettenpistole. Wählen Sie schließlich das automatische Belichtungsverfahren, um die Chemilumineszenzsignale zu erfassen, und passen Sie die Belichtungszeit manuell an, bis ein ideales Signal erfasst wird.
Das gesamte p53-Protein, einschließlich ubiquitiniertem p53, wurde mit FLAG M2-Perlen aus H1299-Zellen unter nicht denaturierenden Bedingungen immunpräzipiert. Das Eluat wurde einem Western Blotting mit Anti-p53 und Anti-Hämagglutinin oder mit Anti-p53 und monoklonalen Antikörpern unterzogen. Hier wurden die Rohzellextrakte oder -inputs einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-MDM2-Antikörpern unterzogen.
Das Signal des ubiquitinierten p53-Proteins, das als verschmierte Bande von niedrigem bis hohem Molekulargewicht erscheint, war deutlich erhöht, wenn MDM2 in diesen Zellen ektopisch exprimiert wurde. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das ubiquitinierte p53-Protein effektiv aus Zellen gereinigt wurde. Als nächstes wurden die Zellen unter denaturierenden Bedingungen lysiert.
Die gesamten zellulären ubiquitinierten Proteine wurden mit nickelgeladenem Harz heruntergezogen und dann einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-Hämagglutinin-Antikörpern unterzogen. Ubiquitiniertes p53-Protein wurde mit einem Anti-p53-Antikörper und einem Anti-Hämagglutinin-Antikörper nachgewiesen. Hier wurden an den Rohzellextrakten oder -inputs Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-MDM2-Antikörpern unterzogen.
Die Ergebnisse zeigten, dass der gesamte ubiquitinierte Proteinspiegel unverändert war, aber der ubiquitinierte p53-Proteinspiegel dramatisch erhöht war, nachdem MDM2 in diesen Zellen überexprimiert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die gesamten Ubiquitinproteine, die ubiquitiniertes p53 enthalten, unter Denaturierungsbedingungen effektiv aus Zelllysaten gezogen wurden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie daran, die Zellen vor der Zellentnahme mit MG132 zu behandeln und die Zellen auf Eis zur Reinigung von ubiquitinierten Proteinen ordnungsgemäß zu beschallen.
