This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer &#8216;Midwest Cancer Nanotechnology Training Center&#8217; Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.

Die nachstehend beschriebene Protokoll folgt den Richtlinien der UIUC menschlichen Forschungsethikkommission. 1. Erhebung und Verdauung der chirurgischen Gewebeprobe <ol><li> Sammeln Sie die Tumorgewebeprobe direkt nach dem Doppelpunkt Resektion (1A und 1B). Sammeln Gewebe von einem benachbarten gesunden Website als gut. </li><li> Übertragen des Gewebes sofort in ein 15 ml Fläschchen mit 12 ml HBSS-Lösung. Die Durchstechflasche auf Eis innerhalb einer isolierten Schaumkasten. </li><li> Transportieren Sie das Fläschchen, die Gewebe mit einem Gewebekultur Haube für die Weiterverarbeitung innerhalb von 45 min. Die Durchstechflasche auf einem Eis-Block innerhalb der Haube. </li><li> Gießen Sie die mitgelieferten Gewebe in eine 6-Well-Platte, die 6-7 ml HBSS-Lösung mit einer Pipette. Hinweis: Gewebemenge pro Vertiefung ist nicht kritisch in diesem Spülschritt. </li><li> Halten Sie die 6-Well-Platte auf einem Eisblock. Spülen Sie das Gewebe in HBSS-Lösung zweimal. </li><li> Schneiden Gewebe sauber in getrennten Abschnitten mit sterilem scissor. Mince Gewebes in kleinere Abschnitte nicht mehr als 1-2 mm 3 in der Größe mit einem sterilen Skalpell. </li><li> Wiegen eines markierten 0,1% Trypsin Phiole (enthaltend 1 ml 0,1% iger Trypsin-Lösung) vor dem Überführen des Gewebes. Übertragen ~ 20 mg Gewebe in jeder der 0,1% Trypsin Fläschchen mit einer Pipette. </li><li> Versuchen, die Übertragung von HBSS in das Trypsin Phiole zu minimieren, um eine weitere Verdünnung von Trypsin zu vermeiden. </li><li> Wiegen Sie die Trypsin-Fläschchen nach Gewebetransfer; dokumentieren den Unterschied, wie der Gewebemasse. </li><li> Gießen ~ 20 mg Gewebe und 1 ml Trypsin in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen auf Schüttler im Kühlschrank bei 4 ° C für 16-20 Stunden. Während dieser Wartezeit oder zu einem früheren Zeitpunkt, bereiten Polyacrylamidgel Substrate und funktionalisieren sie mit ECM-Proteine, wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol> 2. Enzymatische Dissoziation von Gewebeprobe in Einzelzellsuspension und Kultivieren isolierten Zellen auf ECM Funktionalisierte Elastic Substrat-es und Polystyrol-Geschirr <ol><li> Nach 16-20 h Inkubation in Trypsin und bei 4 ° C auf einem Schüttler, Transfer Gewebe von 4 ° C Trypsin bis 4 ° C vollständige Wachstumsmedien Fläschchen (mit 2-3 ml komplettem Wachstumsmedium) mit einer Pipette. Stellen Sie sicher, minimale Übertragung von Trypsin in Wachstumsmedien. Hinweis: Gesamt-Wachstumsmedienformulierung ist wie folgt: RPMI 1640-Grundmedium mit Pferdeserum auf eine Endkonzentration von 10% und Penicillin-Streptomycin 1% der gesamten Lösung. </li><li> Legen Sie die haltigen Medien Fläschchen in einem warmen Wasserbad bei 37 ° C für 12-15 min Gewebe. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe mit einem 15 ml Fläschchen mit HBSS-Lösung mit einer Pipette, leicht schütteln. </li><li> Wiederholen 2.3. </li><li> Entfernen Sie Gewebe von HBSS-Lösung und Transfer zum 0,1% Collagenase-Lösung (in HBSS) Fläschchen mit 1 ml Lösung. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C und 5% CO &amp; sub2; -Umgebung in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank. Während der Wartezeit, warm growth Medium in einem 15 ml Röhrchen bei 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Alle Gewebefragmente Ziehen in Pipetten Minimierung Kollagenase Verschleppung. Werfen Sie einfach die Gewebefragmente in vorgewärmten Kulturmedien Fläschchen. </li><li> Legen Sie eine 40 um gut Filtereinsatz in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Befeuchten Sie den Filter mit 1 ml Zellkulturmedien. </li><li> Man reibt Gewebe in Medien mit einem 10 ml Glaspipette mehrmals, bis Gewebe vollständig dissoziiert. </li><li> Pflegen Sie die Pipettenspitze so nah wie möglich an der Basis des Fläschchens. </li><li> Zahlen Sie die Lösung auf dem Filter, um Schmutz und undissoziierten Teile zu entfernen. </li><li> Zentrifuge filtriert Zellsuspension in Medium bei 150 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren danach Zell-Pellet mit 2 ml frischem Kulturmedien. </li><li> Zähle die Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers (falls erforderlich). Seed isoliert primären Zellen auf extrazellulären Matrix (ECM) funktionalisiert Gele und Polystyrol Gerichte gewünschte Konzentration.</li></ol> 3. Herstellung und Funktionalisierung von unterschiedlicher Steifigkeit Polyacrylamid (PA) Gels und Polystyrol Gründe Hinweis: Für die visuelle Demonstration von Abschnitt 3, die Zuschauer / Leser einer aktuellen Journal of Visualized Experiments (JoVE) Artikel 17 Absatz. <ol><li> Annahme veröffentlichten Protokollen 18, 19, 12 mm 2 aktivieren Deckgläsern chemisch kovalente Bindung des Hydrogels zu gewährleisten. <ol><li> Zuerst rutscht treat Glasabdeckung mit 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) für 7 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die ATS vollständig mit DI-Wasser spülen und zu behandeln, Deckgläser mit 0,5% Glutaraldehyd (in PBS von 70% Glutaraldehyd Stammlösung verdünnt) Lösung für 30 min. </li></ol></li><li> Erhalt von 2 kPa Gellösungen durch Mischen von 5% w / v Acrylamid und 0,05% N, N &#39;Methylenbisacrylamid (Bis) -Lösung in 10 mM HEPES-gepufferter Kochsalzlösung 20. Verwenden von 8% w / v Acrylamid und 0,13% N, N &#39;Methylenbisacrylamid (Bis) -Lösung in 10 mM HEPES-gepufferter Kochsalzlösung für 10 kPa Gel 20. <ol><li> In beiden Fällen nutzen 1: 200 Ammoniumpersulfat (10% w / v) und 1: 2000 N, N, N &#39;, N &quot;Tetramethylethylendiamin (TEMED) als Initiator und Katalysator für die Polymerisation sind. </li><li> Fügen Sie außerdem 100 ul fluoreszierende Kügelchen bis 2 kPa Gel-Lösung als Bezugsmarkierungen 21, 22. </li></ol></li><li> Zahlen Sie einen Tropfen von 20 &amp; mgr; pre-Polymer PA-Gel-Lösung auf dem 12 mm 2 aktiviert Deckglas. Stellen Sie ein weiteres 12 mm 2 Standard-Deckglas auf den Drop. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen breitet sich zwischen den Deckgläsern aufgrund der Kapillarwirkung. Invertieren des Sandwich für 2 kPa Gele zu gewährleisten, dass die meisten der Perlen kommen in der Nähe der Zellkulturoberfläche. </li><li> Härten des PA-Gel 45 min bei RT. </li><li> Ziehen Sie weg der oberen Deckglas mit einer einzigen Kante Rasierer. Hinweis: Während der Peeling, geht Loslösung von einer Kanteder Sandwich. Das Gel bleibt Anhänger der aktivierten Glasobjektträger. </li><li> Lagern Sie die Gele in PBS-Lösung vor dem Gebrauch. </li><li> Funktionalisieren PA-Gelen und Glas mit ECM-Moleküle, humanem Fibronektin mit einer Konzentration von 50 ug / ml nach veröffentlichten Verfahren 23. <ol><li> Kurz gesagt, inkubieren Substraten mit 2 ml reinem Hydrazinhydrat O / N. </li><li> Entfernen Hydrazinhydrat und spülen die Substrate gründlich mit DI-Wasser. </li><li> 30 min Waschen der Substrate mit 5% Essigsäure. </li><li> Entfernen Essigsäure und spülen die Substrate gründlich mit DI-Wasser. </li><li> Halten Sie die Substrate in DI-Wasser für 30 Minuten eingetaucht. </li><li> Inkubieren der Substrate mit oxidierter Fibronektin für 35 min bei einer Konzentration von 50 ug / ml. </li><li> Spülen der Substrate mit PBS auf Schüttler bei niedriger Drehzahl für 10 min. </li><li> Alle Substrate inkubieren bei 37 ° C in 2-3 ml Kulturmedium für 30 Minuten vor dem Ausplattieren der Zellen. Hinweis: Tafel-Zellen in einem dünn populated Weise (1000-3000 Zellen / cm 2). Jedes Gel bedeckten Glasschleif muss in einer 35 mm Petrischale enthalten sein. Erlauben Zellen vollständig vor jedem Mikroskopie (mindestens O / N) zu halten. </li></ol></li></ol> 4. Traktionskraftmikroskopie und Immunfluoreszenzmikroskopie Assays <ol><li> Traction Force Microscopy Assay <ol><li> Warm 0,25% Trypsin-EDTA / 10% SDS-Lösung bei 37 ° C im Wasserbad für 10 Minuten bevor die Schlupf Experimente beginnen. </li><li> Entfernen Sie eine Gel aus dem Zellkulturbrutschrank bei einer Zeit und Ort auf dem Leucht invertierten Mikroskoptisch (32-fache Vergrößerung). </li><li> Finden Sie eine einzelne Zelle in Sichtfeld. Entfernen Sie die Petrischale Deckel. </li><li> Nehmen Sie ein Phasenkontrastbild der Zelle (zB Abbildung 3). </li><li> Schalten Sie den Aufnahmemodus zur Fluoreszenz und wählen Sie entsprechende Filter. Den Mikroskoptisch oder Proben während dieser Zeit nicht bewegen. </li><li> Nehmen Sie ein Bild von der fluoreszierenden Kügelchen displacdurch zelluläre Traktion (4C) ed. </li><li> 1 ml Trypsin / SDS-Lösung auf Petrischale, um die Zelle von Gel zu lösen. Den Mikroskoptisch oder Proben während dieser Zeit nicht bewegen. Werfen Sie auch einen Kontrollbild der Zelle, um die vollständige Entfernung von Gel zu gewährleisten. </li><li> Werfen Sie einen Verweis (null Kraft) Bild der Perlen, nachdem die Zelle entfernt wird. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2-4.1.8 für alle anderen Gelen. </li><li> Vereinbaren Sie einen Bildstapel mit ImageJ aus den beiden Bildern in Schritt 4.1.6 und 4.1.8 für jeden Fall übernommen. Um den Bildstapel zu erzeugen, verwenden Sie folgende Befehlsfolge in ImageJ nach dem Öffnen der Bilder: Bild → Stapel → Bilder zu stapeln. </li><li> Um das Verschiebungsfeld und Traktion zu erhalten, verwenden ImageJ Plugins folgenden veröffentlichten Verfahren 21, 22 erhalten Codes und detaillierte Anleitungen für diese Plugins mit dem folgenden Link:. <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima</a>gejplugins. <ol><li> Richten Sie die Bilder in den Stapel mit dem &quot;Template Matching &#39;plugin. Verwenden Sie folgende Befehlsfolge in ImageJ nach dem Öffnen des Bildstapels in Schritt 4.1.10 erzeugt: Plugins → Template Matching → Align Slices in Stack → OK. Speichern Sie das Bild Stapel damit. Verwenden Sie diese neue Bildstapel in den folgenden Schritten. </li><li> Besorgen Sie sich die Verschiebungsfeld mit der PIV (Particle Image Velocimetry) Plugin (4D). Verwenden Sie folgende Befehlssequenz nach dem Öffnen der in Schritt 4.1.11.1 gespeicherten Bildstapel: Plugins → → Iterative PIV PIV (Basic) → OK → Übernehmen Sie diese PIV und Ausgangs → OK. Speichern Sie die PIV-Ausgang in das gleiche Verzeichnis wie im Originalbild Stack. Verwenden Sie diese als Eingabe im nächsten Schritt. </li><li> Schließlich verwenden die FTTC (Fourier-Transformation Traktion Zytometrie) Plugin, um die Traktion Karte (4E) zu erhalten. Verwenden Sie folgende Befehlsfolge: Plugins → FTTC → Insert Materialeigenschaften, dh E-Modul und das Verhältnis der PA-Gel → OK → Poisson-Wählen Sie die in Schritt 4.1.11.2 → OK gespeichert PIV Ausgabedatei. Speichern FTTC ergibt sich im selben Verzeichnis wie im Bilderstapel und PIV-Ausgang. </li></ol></li></ol></li><li> Immunfluoreszenz-Assays <ol><li> Nehmen Sie die Substrate an den laminaren Haube immungefärbt werden, und entfernen Sie den Kulturmedien. </li><li> Spülen der Substrate mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei RT. </li><li> Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS. Folglich Inkubation der Substrate mit 500 ul Signalverstärker für 30 Minuten und spülen Sie mit PBS. </li><li> Zellen, die mit monoklonalen Anti-Vinculin-Antikörpern inkubieren bei einer 1: 250 Verdünnung in PBS für 45 min bei RT. Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS. </li><li> 200-Verdünnung: die Proben mit sekundärem Antikörper Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Maus-IgG bei einem 1 inkubierenin PBS bei RT für 30 min. Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS. </li><li> Um die F-Aktin-Struktur sichtbar zu machen, zu inkubieren Zellen mit Phalloidin-TRITC-Konjugaten bei einer Konzentration 50 ug / ml für 45 min bei RT. Für 3-mal (jeweils 5 min) Waschen der Substrate mit PBS. </li><li> Bild die Proben mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (5A - 5D). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Cellular Zugspannung wurde kürzlich als eine mögliche biophysikalische Indikator des metastasierten Zustand 13 entstanden. , In der Literatur keine experimentellen Daten Traktion mit primären Tumorzellen besteht jedoch auf dem Laufenden. Auch direkt Kultivierung isolierten primären Darmzellen auf unterschiedlichen Steifigkeit Polyacrylamidgelen noch nicht gemeldet. Damit schaffen wir eine optimierte Primärdoppelpunkt Zellkulturbedingungen auf Gelen und Polystyrol (Abbildung 2). Fluoreszi...

In den letzten Jahren wurde es immer deutlicher, dass eine mechanische Mikroumgebung, zusätzlich zu bio-chemische Faktoren spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellfunktionen. Zellen können Erkennen und Reagieren auf das Substrat Steifigkeit auf dem sie bis 3-7 eingehalten (wie in 2D Kultivierung) oder umgeben (wie in 3D-Kultur). Dadurch können die Zellen ihre Differenzierung 3, Morphologie 4, Migration / Motilität 5, biophysikalischen Eigenschaften 6. Wachstums 7 und andere Prozesse zu modulieren. Krebszellen in den 2D und 3D-Matrix Steifigkeit mit einem koordinierten hierarchischen mechano-chemische Kombination von Adhäsionsrezeptoren und assoziierte Signaltransduktion Membranproteine, die Zytoskelett Architektur und molekulare Motoren 1, 2 reagieren auch z. B. Brustepithelzellen (MEC) bilden normale acinar Parenchym, wenn auf 150 Pa Substraten kultiviert, die ähnlich der Steifigkeitvon gesundem Brustgewebe. Interessanterweise weisen sie die Merkmale eines Entwicklungs Tumor, sowohl strukturelle als auch Transkriptions, wenn auf steifer Untergründen (&gt; 5000 Pa), die die Steifigkeit eines Tumorstroma 8 imitieren kultiviert. Zusätzlich zeigt ein weiteres Experiment, dass die Brusttumorgenese durch Kollagenvernetzung und ECM Versteifung 9 verbunden. Kürzlich durchgeführte Experimente zeigen, dass menschliche Kolonkarzinom (HCT-8-Zellen) anzuzeigen Metastasierung Phänotyp (MLP), wenn sie auf Substrate mit 2D physiologisch relevanten Steifigkeit (20-47 kPa) kultivierten, jedoch nicht auf sehr steif (3,6 GPa) Substrate 10- 12 .Diese Zellen erste Form tumorartige Zellcluster dissoziieren dann voneinander, ausgehend von der Peripherie. Da diese epithelialen abgerundete morphologischen (E bis R Übergang) Änderung auftritt, sie vermehren, zu reduzieren Zell-Zell- und Zell-ECM-Adhäsion und werden Migrations. HCT-8-Zellen, die auf sehr harten Polystyrol-Substrate weisen nicht diese kultiviertbösartige Züge. So wurde die Hypothese aufgestellt, dass HCT-8-Zellen werden metastasierendem aufgrund ihrer Exposition gegenüber geeigneter Mikroumgebung. Es ist erwähnenswert, dass diese Versuche werden mit immortalisierten Krebszelllinien oder primäre Zellen murine abgeleiteten, nicht mit primären menschlichen Krebszellen durchgeführt. Eine neue Studie schlägt vor, dass Augmented zellulären Zugspannung kann als Potential biophysikalischen Signatur für metastatischen Zellen 13 .Die Untersuchung umfaßt das Messen Zugkraft für verschiedene menschliche Krebszelllinien auf Polyacrylamidgelen verwendet werden. Es wird festgestellt, dass metastatische Krebszellen deutlich höhere Zugspannung im Vergleich zu nicht-metastatischen Zellen in allen Fällen 13 auszuüben. Allerdings sind diese Ergebnisse direkt im Widerspruch zu den früher veröffentlichten Ergebnisse auf murine abgeleitet Brustkrebs-Zelllinien 14. Auch eine aktuelle Studie zeigt deutliche Unterschiede zwischen immortalisierte und primäre menschliche Zellen in ihrer Zytoskelett Umgestaltung proProtein-Profiling und das Überleben der Zellen Protein-Expression 15. Daher ist es wichtig, viele der biophysikalischen Untersuchungen, wie Traktion für primäre menschliche Krebszellen zu überdenken. Dies wird auf die Frage eingegangen, ob die Primärzellen rekapitulieren immortalisierten Krebszelllinien Traktion Trend. Das hier beschriebene Protokoll wird für die Isolierung von primären menschlichen Darmzellen (beide gesund und Krebs), und für die Kultivierung sie auf weichen Substraten (Polyacrylamid-Hydrogele) sowie auf Petrischalen optimiert. Das Protokoll basiert auf der Verdauung und daraus enzymatische Dissoziation des chirurgischen Gewebeprobe in Einzelzellsuspension 16 basierend. Unseres Wissens ist dies die erste Demonstration der Kultivierung isolierten primären Dickdarmtumorzellen und normalen Zellen direkt auf weiche Hydrogel-Substrate mit integrierten Leuchtstoffmikroperlen für Traktion Zytometrie. Transparentes Gel Substrate erlauben auch Immunfärbung. Dieser Test zeigte Unterschiede in der F-Actin-Organisation undfokalen Adhäsionen in primären menschlichen Darmzellen als Substrat Steifigkeitsänderungen. Diese Zellkultur-Plattform eröffnet die Möglichkeit zu erforschen biophysikalischen Eigenschaften von primären humanen Zellen, wie Zelle Steifigkeit und Traktion als Parameter für die Krebs Prognostik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenese</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>01201-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N- methylenebisacrylamide (bis)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#714;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human fibronectin</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td >354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >18412</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Signal enhancer</td>
			<td>Life technologies</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monoclonal anti vinculin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V9131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRITC phalloidin conjugates&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.1 &#181;m fluroscent beads</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 mm2 glass cover slips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2865-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary human colon tumor cells from surgical tissues and culturing them directly on soft elastic substrates for traction cytometry

Krebszellen reagieren auf mechanische Steifigkeit in komplexer Weise die Matrix unter Verwendung eines koordinierten hierarchischen mechanochemische System Adhäsionsrezeptoren zusammensetzt und assoziierten Signaltransduktion Membranproteine, die Zytoskelett Architektur und molekulare Motoren 1, 2. Tastsinns von verschiedenen Krebszellen in vitro vorwiegend mit immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen murine abgeleitet, mit primären humanen Krebszellen untersucht. Daher ist wenig über die Mechanosensitivität primärer humaner Kolonkarzinomzellen in vitro bekannt. Hier wird ein optimiertes Protokoll entwickelt, das die Isolierung von primären menschlichen Darmzellen von gesunden und kanzerösen chirurgischen menschlichen Gewebeproben beschrieben. Isoliert Doppelpunkt Zellen werden dann auf weichen (2 kPa Steifigkeit) und steif (10 kPa Steifigkeit) Polyacrylamid-Hydrogele und Polystyrol (~ 3,6 GPa Steifigkeit) Substrate durch eine extrazelluläre Matrix funktionalisiert (Fibronektin erfolgreich kultiviertin diesem Fall). Fluoreszierende Mikrokügelchen werden in weiche Gele in der Nähe der Zellkulturoberfläche eingebettet ist, und Traktion Test wird durchgeführt, um zelluläre Kontraktionsspannungen mit dem kostenlosen Open-Access-Software zu bewerten. Außerdem Immunfluoreszenzmikroskopie auf verschiedenen Substraten Steifigkeit liefert nützliche Informationen über primäre Zellmorphologie, Zellskelett Organisation und Vinculin enthält fokalen Adhäsionen als Funktion der Substratsteifigkeit.

Das oben beschriebene Protokoll ist erfolgreich für mehrere Gewebeproben (n = 12) von vier verschiedenen Patienten unter Richtlinien der Ethikkommission eingesetzt. 1A veranschaulicht eine repräsentative kolorektalen Tumor direkt nach der Operation aus dem die Gewebeschnitte für Zellkulturen gewonnen werden. Ein typischer Gewebeschnitt in HBSS-Lösung nach der Übertragung auf den laminaren Abzugshaube für die weitere Verarbeitung ist in 1B gezeigt. Eine schematische Darstellung der...

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Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

isolation-primary-human-colon-tumor-cells-from-surgical-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Aufrufe.  University of Illinois at Urbana-Champaign. A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses. 

Serie: Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of &gt;50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.

Circulating tumor cells are isolated from the blood of cancer patients without inflicting cellular damage. Isolation of tumor cells is accomplished using a bimolecular surface of E-selectin in addition to antibodies against epithelial markers. A nanotube coating specifically promotes cancer cell adhesion resulting in high capture purities.

Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Forschung

Biotechnik

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should mimic the human tissues they are aiming to replace; to provide the required anatomical shape, the materials must be able to sustain the mechanical forces they will experience when implanted at the defect site. Although the mechanical properties of tissue-engineered scaffolds are of great importance, many human tissues that undergo restoration with engineered materials have not been fully biomechanically characterized. Several compressive and tensile protocols are reported for evaluating materials, but with large variability it is difficult to compare results between studies. Further complicating the studies is the often destructive nature of mechanical testing. Whilst an understanding of tissue failure is important, it is also important to have knowledge of the elastic and viscoelastic properties under more physiological loading conditions.
This report aims to provide a minimally destructive protocol to evaluate the compressive and tensile properties of human soft tissues. As examples of this technique, the tensile testing of skin and the compressive testing of cartilage are described. These protocols can also be directly applied to synthetic materials to ensure that the mechanical properties are similar to the native tissue. Protocols to assess the mechanical properties of human native tissue will allow a benchmark by which to create suitable tissue-engineered substitutes.

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

Biomechanische Charakterisierung humaner Weichgewebeproben mit Einrückungen und Zugprüfung

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.