This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer &#8216;Midwest Cancer Nanotechnology Training Center&#8217; Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.

הפרוטוקול המתואר להלן כדלקמן ההנחיות של ועדת אתיקה במחקר האנושי UIUC. 1. איסוף ועיכול של דגימת רקמת כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את דגימת רקמת גידול מייד אחרי כריתת מעי גס (איור 1 א ו -1 B). לאסוף רקמה מאתר בריא סמוך גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה מייד לבקבוקון המכיל 15 מיליליטר 12 מיליליטר פתרון HBSS. שמור את הבקבוקון על קרח בתוך תיבת קצף מבודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הבקבוקון המכיל רקמות למכסת מנוע בתרבית רקמה לעיבוד נוסף בתוך 45 דקות. שמור את הבקבוקון על גוש קרח בתוך מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הרקמה שסופקה לצלחת 6 היטב המכילה 6-7 מיליליטר של פתרון HBSS בעזרת פיפטה. הערה: הסכום של רקמה לכל גם הוא לא קריטי בשלב זה שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את צלחת 6 גם על גוש קרח. יש לשטוף את הרקמה בפתרון HBSS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך רקמות נקיות למקטעים מופרדים עם scis סטריליסור. רקמת בשר טחון לחלקים קטנים יותר שאינו עולה על 1-2 מ&quot;מ 3 בגודלו עם להב אזמל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל בקבוקון שכותרתו 0.1% טריפסין (המכיל 1 מיליליטר של 0.1% פתרון טריפסין) לפני העברת הרקמות. העבר ~ 20 מ&quot;ג לרקמה כל אחד מבקבוקוני טריפסין 0.1% עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נסה למזער את העברת HBSS לתוך בקבוקון טריפסין, כדי למנוע דילול נוסף של טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בקבוקוני טריפסין לאחר העברת רקמות; לתעד את ההבדל כמסת הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ~ 20 מ&quot;ג ורקמות מיליליטר 1 טריפסין לבאר כל צלחת גם 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצלחת גם 24 על שייקר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות. במהלך תקופת ההמתנה זה או במועד מוקדם יותר, להכין מצעי ג&#39;ל polyacrylamide וfunctionalize עם חלבוני ECM כאמור בסעיף 3. </li></ol> 2. אנזימתי דיסוציאציה של דגימת רקמה להשעית תא בודדת ותאים מבודדים Culturing על ECM פונקציונליות אלסטיים Substrates ומנות פוליסטירן קשיחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 16-20 שעות של דגירה בטריפסין גם ב 4 ° C על שייקר, להעביר רקמה מטריפסין 4 ° C עד 4 ° C בקבוקון שלם תקשורת צמיחה (המכיל 2-3 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה) בעזרת פיפטה. להבטיח העברה מינימאלית של טריפסין לתקשורת צמיחה. הערה: ניסוח תקשורת צמיחה מלא הוא כדלקמן: מדיום 1640 RPMI בסיס בתוספת סרום סוס לריכוז סופי של 10% ופניצילין, סטרפטומיצין עד 1% מפתרון כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה המכילה בקבוקון תקשורת באמבט מים חם על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה 15 מיליליטר בקבוקון המכיל פתרון HBSS בעזרת פיפטה, ללחוץ בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמה מפתרון HBSS והעברת 0.1% פתרון collagenase (בHBSS) בקבוקון המכיל פתרון 1 מיליליטר. דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בסביבת חממת תרבות תא humidified. במהלך תקופת ההמתנה, growt החםתקשורת h 15 מיליליטר בקבוקון על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את כל שברי הרקמה לתוך שריד collagenase צמצום פיפטה. הוצא רק שברי הרקמה לתוך צלוחיות תקשורת התרבות מחוממות מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסנן היטב להוסיף 40 מיקרומטר לבאר כל צלחת גם 6. להרטיב את המסנן עם תקשורת ותרבות תא 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת Triturate בתקשורת עם מספר פעמים פיפטה זכוכית 10 מיליליטר עד הרקמה ניתקה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קצה פיפטה הקרוב ככל האפשר לבסיס של הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד את הפתרון על המסנן כדי להסיר שאריות וחלקי undissociated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסוננת השעיה תא בתקשורת ב XG 150 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant לאחר מכן וresuspend תא גלולה עם 2 מיליליטר תקשורת תרבות הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer (אם נדרש). זרע מבודד תאים ראשוניים על מטריצה ​​תאית (ECM) ג&#39;לי פונקציונליות ומנות קלקר בריכוז רצוי.</li></ol> 3. הכנה וFunctionalization של ג&#39;לי שונה נוקשות polyacrylamide (הרשות הפלסטינית) ומצעי פוליסטירן הערה: הפגנה חזותית של סעיף 3, הצופים / קוראים מופנים לז&#39;ורנל האחרון של ניסויי Visualized (יופיטר) סעיף 17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקולי אימוץ פרסמו 18, 19, 12 מ&quot;מ להפעיל 2 כיסוי זכוכית מחליק כימי כדי להבטיח קוולנטיים המחייב של הידרוג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, כיסוי זכוכית פינוק מחליק עם 3 Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) במשך 7 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי הסר את ATS לחלוטין עם שטיפת המים DI ולטפל מחליק עם Glutaraldehyde 0.5% (בדילול מלא PBS 70% ממניות פתרון Glutaraldehyde) פתרון למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 2 פתרונות ג&#39;ל kPa ידי ערבוב 5% w / פתרון acrylamide נ &#39;ושל 0.05% N, -methylenebisacrylamide פתרון&#39; N (BIS) שבנאגר מלוח HEPES 10 מ&quot;מ 20. השתמש 8% w / v וacrylamide 0.13% N, -methylenebisacrylamide פתרון &#39;N (BIS) ב 10 נאגר מלוח HEPES מ&quot;מ לג&#39;ל 10 kPa 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשני המקרים, להשתמש 1: 200 persulfate אמוניום (10% w / v) ו -1: 2000 N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethylethylenediamine (TEMED) כיוזם והזרז לתהליך פילמור, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, להוסיף 100 חרוזי ניאון μl לפתרון 2 ג&#39;ל kPa כסמני אמונים 21, 22. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד ירידה של 20 μl מראש פולימר פתרון ג&#39;ל הרשות הפלסטינית על 12 מ&quot;מ 2 להחליק את מכסה הזכוכית הופעלה. מקום אחר 12 מ&quot;מ 2 כיסוי הזכוכית להחליק רגיל בירידה. ודא כי הירידה מתפשטת בין התלושים לכסות בשל קפילריות. הפוך את הכריך לג&#39;לי 2 kPa כדי להבטיח שרוב חרוזים להתקרב משטח תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את הג&#39;ל הרשות הפלסטינית במשך 45 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף להחליק את המכסה העליון באמצעות סכין גילוח קצה אחד. הערה: במהלך קילוף, ניתוק ממשיך מקצה אחדשל הכריך. ג&#39;ל נשאר חסיד לשקופית הזכוכית הופעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את ג&#39;לי בפתרון PBS לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Functionalize ג&#39;לי הרשות הפלסטינית וזכוכית עם מולקולות ECM, פיברונקטין אדם בריכוז של 50 מיקרוגרם שיטות מיליליטר הבא שפורסמו / 23. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, דגירה מצעים עם O 2 מיליליטר מימה הידרזין טהור / ​​N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מימה הידרזין ולשטוף את מצעים ביסודיות עם מים די. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מצעים עם 5% חומצה אצטית למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חומצה אצטית ולשטוף את מצעים ביסודיות עם מים די. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את מצעים שקועים במי DI למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מצעים עם פיברונקטין חמצון במשך 35 דקות בריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מצעים עם PBS על שייקר בסל&quot;ד נמוך במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל מצעים על 37 מעלות צלזיוס בתקשורת ותרבות 2-3 מיליליטר במשך 30 דקות לפני ציפוי התאים. הערה: תאי פלייט בלאכלס בדלילותאופן ד (1,000-3,000 תאים / 2 סנטימטר). כל תלוש זכוכית מכוסה ג&#39;ל צריך להיות כלול בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. לאפשר לתאים לדבוק לחלוטין לפני כל מיקרוסקופיה (לפחות O / N). </li></ol></li></ol> 4. מבחני מיקרוסקופית מיקרוסקופית הכוח וImmunofluorescence גרירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay מתיחה מיקרוסקופית כוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25% טריפסין-EDTA 10% פתרון חם / SDS על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות לפני שניסויי מתיחה להתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל אחד מתרבית תאי החממה בזמן ומקום על הבמה הניאון הפוך מיקרוסקופ (הגדלה 32x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תא בודד בשדה הראייה. הסר את מכסה צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה בניגוד שלב של תא (לדוגמא, איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את מצב ההדמיה לקרינה ובחר מסנן מתאים. אל תזיז את הבמה מיקרוסקופ או המדגם בתקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה של displac חרוזי ניאוןאד על ידי מתיחה סלולרית (איור 4C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 מיליליטר טריפסין פתרון / SDS לצלחת פטרי לנתק את התא מג&#39;ל. אל תזיז את הבמה מיקרוסקופ או המדגם בתקופה זו. כמו כן, לקחת תמונת שליטה של ​​התא על מנת להבטיח הסרה מלאה מג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונת התייחסות (כוח null) של חרוזים לאחר התא מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבי 4.1.2-4.1.8 לכל ג&#39;לים האחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ערימת תמונה באמצעות ImageJ משתי התמונות שנרכשו בשלב 4.1.6 ו4.1.8 לכל מקרה ומקרה. על מנת ליצור את ערימת התמונה, להשתמש הרצף הבא של פקודות בImageJ לאחר פתיחת התמונות: תמונת → → ערימות תמונות למחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את שדה העקירה וגרירה, להשתמש בתוספי ImageJ הבאים שיטות שפורסמו 21, 22 השג קודים ומדריכים מפורטים לתוספים אלה באמצעות הקישור הבא:. <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">Https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima</a>gejplugins. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את התמונות בערימה באמצעות התוסף &quot;התאמת תבנית &#39;. השימוש הבא רצף של פקודות בImageJ לאחר פתיחת ערימת תמונה שנוצרה בשלב 4.1.10: תוספים → התאמת תבנית → פרוסות ישרו בסטאק → אישור. שמור את ערימת התמונה כתוצאה מכך. השתמש ערימת תמונה חדשה זו בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את שדה העקירה באמצעות תוסף PIV (velocimetry תמונת חלקיקים) (איור 4D). שימוש הבא רצף של פקודות לאחר פתיחת ערימת התמונה שנשמרה בצעד 4.1.11.1: התוספים → PIV PIV → איטרטיבי (יסוד) → אישור → קבל PIV זה ופלט → בסדר. שמור את פלט PIV באותה הספרייה כמו בערימת התמונה המקורית. להשתמש בזה כקלט בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף להשתמש FTTC (התמרת פורייה מתיחת cytometry) תוסף לך את מפת המתיחה (איור 4E). רצף השימוש הבא של פקודות: התוספים → FTTC → Insתכונות חומר ERT, כלומר, מודולוס של יאנג ומקדם פואסון של אישור → ג&#39;ל הרשות הפלסטינית → בחרו את קובץ פלט PIV שמר בשלב 4.1.11.2 → אישור. שמור FTTC תוצאות באותה הספרייה כמו בערימת התמונה ופלט PIV. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחני מיקרוסקופית immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מצעים לimmunostained למכסה המנוע למינרית ולהסיר את התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מצעים עם PBS ולתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS עבור 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם). כתוצאה מכך, דגירה מצעים עם משפר אות 500 μl למשך 30 דקות ולשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם נוגדן אנטי vinculin חד שבטי בדילול 1: 250 ב PBS במשך 45 דקות ב RT. שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות עם נוגדנים משני IgG אנטי עכבר 488 עיזים אלקסה פלואוריד בדילול 1: 200PBS ב RT למשך 30 דקות. שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את מבנה F- אקטין, דגירה תאים עם TRITC phalloidin conjugates ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז במשך 45 דקות ב RT. שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal (איור 5 א &#39;- 5D). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment.">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li><li>Kumar, S., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics,+malignancy,+metastasis:+the+force+journey+of+a+tumor+cell.">Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+&#64258;exibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate &#64258;exibility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).</li><li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates.">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).</li><li>Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+flexibility+regulates+growth+and+apoptosis+of+normal+but+not+transformed+cells.">Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells.">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).</li><li>Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+Stiffness+Mediated+Metastasis+Like+Phenotype+of+Colon+Cancer+Cells+is+Independent+of+Cell+to+Gel+Adhesion.">Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion.</a> Cell. Mol. Bioeng. , (2014).</li><li>Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+cellular+phenotype+by+soft+collagen+gels.">Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels.</a> Soft Matter. , (2014).</li><li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential.">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).</li><li>Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity.">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys. Biol. 8 (1), (2011).</li><li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival.">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).</li><li>Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+established+tumourigenic+primary+human+colon+cancer+cell+lines+are+sensitive+to+TRAIL-induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo.">Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo.</a> Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).</li><li>Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+localizing+reporter+fluorescent+beads+near+the+cell+culture+surface+for+traction+force+microscopy.">A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (91), (2014).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+micro-patterning+proteins+and+cells+on+polyacrylamide+gels.">A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels.</a> Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties.">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell&#8211;cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell&#8211;cell junction positioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+integrin-mediated+mechanotransduction+by+hyaluronic+acid.">Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype.">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12905 (2010).</li><li>Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+rigidity+of+the+extracellular+matrix+regulates+the+structure,+motility,+and+proliferation+of+glioma+cells.">The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells.</a> Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).</li><li>Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-propelled+biohybrid+swimmer+at+low+Reynolds+number.">A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לחץ מתיחה סלולרי התפתח לאחרונה כמחוון biophysical פוטנציאל של מדינה גרורתי 13. עם זאת, אין נתונים מתיחה ניסיוניים עם תאי גידול ראשוניים קיימים בספרות עד כה. כמו כן, תאי מעי גס ראשוני מבודדים ישירות culturing על ג&#39;ל polyacrylamide הקשיחות שונה לא דיווחו עדיין. לפיכך, אנו קובעים ת?...

בשנים האחרונות זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי מיקרו-סביבה מכאנית, בנוסף לגורמים ביו-כימיים, ממלא תפקיד חשוב בויסות פונקציות תא. תאים יכולים לחוש ולהגיב לקשיחות המצע שעליו הם דבקים (כמו בתרבות 2D) או מוקפת ב( כמו בתרבות 3D) 3-7. בעשותם כך, תאים יכולים לווסת בידולם 3, מורפולוגיה 4, הגירה / תנועתיות 5, נכסים ביו-פיזי 6, צמיחת 7, ותהליכים אחרים. תאים סרטניים גם להגיב למטריצת קשיחות 2D and 3D באמצעות שילוב מתואם, היררכי mechano-כימי של קולטני הידבקות וחלבוני קרום הולך האותות הקשורים, ארכיטקטורת cytoskeletal, ומנועים מולקולריים 1, 2. לדוגמא, תאי אפיתל החלב (MECs) טופס parenchyma acinar הנורמלי כאשר בתרבית על 150 מצעי אבא שדומה לנוקשותשל רקמת שד בריאה. מעניין לציין, הם מפגינים סימני ההיכר של גידול מתפתח, גם מבני ותעתיק, כאשר בתרבית על מצעים נוקשה (&gt; 5000 אבא) המחקים את הנוקשות של סטרומה גידול 8. בנוסף, ניסוי נוסף מראה כי tumorigenesis השד מלווה בcrosslinking קולגן וECM התקשות 9. ניסויים שנעשו לאחרונה מראים כי קרצינומה מעי גס אנושית (HCT-8) תאים להציג גרורות כמו פנוטיפ (MLP) כאשר הם בתרבית על מצעי 2D שיש נוקשות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (20-47 kPa), אבל לא על נוקשה מאוד (3.6 GPA) מצעים 10 12 .These תאי צבירי תאים כמו גידול בצורה הראשונה ולאחר מכן לנתק את זה מזה, החל מהפריפריה. כאפיתל זה למעוגל מורפולוגיים (E למעבר R) שינוי מתרחש, הם מתרבים, להפחית תאי תאים והידבקות התא-ECM, והפכו נודד. HCT-8 תאים בתרבית על מצעי קלקר מאוד קשים אינו מציגים אלהתכונות ממאירות. כך זה כבר שיערו כי HCT-8 התאים להפוך לגרורתי בשל חשיפתם למייקרו-הסביבה מתאימה. ראוי לציין שניסויים אלה מבוצעים עם קווים הנציחו תא סרטני או תאים ראשוניים בעכברים נגזרים, לא עם תאי סרטן אנושיים ראשוניים. מחקר שנערך לאחרונה מציע כי לחץ מתיחה סלולארי Augmented עשוי לשמש כחתימת biophysical פוטנציאל לתאים גרורתי 13 מחקר .the כרוך מדידת כוח מתיחה לשורות תאי הסרטן אנושיות שונות על ג&#39;ל polyacrylamide. הוא מצא כי תאי סרטן גרורתי יכולים להפעיל לחץ מתיחה גבוה יותר באופן משמעותי בהשוואה לתאים שאינם גרורתי בכל המקרים 13. עם זאת, תוצאות אלה ישירות בסתירה לממצאים שפורסמו קודם לכן בשורות תאי סרטן השד בעכברים נגזרו 14. כמו כן, מחקר שנערך לאחרונה מדגיש הבדלים ראויים לציון בין תאים אנושיים הנציחו והעיקריים בפרו שיפוץ cytoskeletalפרופיל חלבון והביטוי חלבון הישרדות תא 15. לפיכך, חשוב לבקר רב של מבחני biophysical כוללים מתיחה לתאי סרטן אנושיים ראשוניים. זה יעסוק בשאלה אם התאים הראשוניים לשחזר מגמת מתיחת שורות תאי הסרטן הונצחה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא מותאם לבידוד של תאים ראשוניים אדם מעי גס (גם בריאים וסרטניים), ועבור culturing על מצעים רכים (הידרוג polyacrylamide), כמו גם על צלחות פטרי. הפרוטוקול מבוסס על מערכת עיכול ודיסוציאציה האנזימטית הסוגר של דגימת רקמה כירורגית לתוך תא בודד השעיה 16. למיטב ידיעתנו, זה הוא ההפגנה הראשונה של culturing גידול במעי הגס ראשוני מבודד ותאים נורמלים ישירות על מצעים רכים הידרוג&#39;ל עם microbeads פלורסנט המשובץ למתיחת cytometry. מצעי ג&#39;ל שקופים גם לאפשר immunostaining. assay זה מתגלה הבדלים בארגון F- אקטין והידבקויות מוקד בתאי מעי גס אנושיים עיקריים שינויי מצע נוקשות. פלטפורמת תרבית תאים זה מפותחת את האפשרות לחקור מאפייני biophysical שונים של תאים אנושיים העיקריים כגון תא נוקשות ומתיחה כפרמטרים לprognostics הסרטן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collagenese</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>01201-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N- methylenebisacrylamide (bis)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N&#714;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human fibronectin</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td >354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrazine hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >18412</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Signal enhancer</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>I36933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monoclonal anti vinculin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V9131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRITC phalloidin conjugates&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.1 &#181;m fluroscent beads</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	
		<tr >
			<td ></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 mm2 glass cover slips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2865-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary human colon tumor cells from surgical tissues and culturing them directly on soft elastic substrates for traction cytometry

תאים סרטניים להגיב למטריקס קשיחות מכאנית באופן מורכב באמצעות מערכת מתואמת, היררכית mechano-כימי מורכבות מקולטנים הידבקות וחלבוני קרום הולך האותות הקשורים, ארכיטקטורת cytoskeletal, ומנועים מולקולריים 1, 2. Mechanosensitivity של תאי סרטן שונים במבחנה הם חקר בעיקר עם קווים הנציחו תא או תאים ראשוניים בעכברים נגזרים, לא עם תאי סרטן אנושיים ראשוניים. לפיכך, מעט מאוד ידוע על mechanosensitivity של תאי סרטן המעי הגס אנושיים ראשוניים במבחנה. כאן, פרוטוקול מותאם מפותח המתאר את הבידוד של תאי מעי גס אנושיים ראשוניים מדגימות אנושיות כירורגית בריאה וסרטניות ברקמה. תאי מעי גס מבודדים אז הם מתורבתים בהצלחה על רך (2 kPa נוקשות) ונוקשה (10 kPa נוקשות) הידרוג polyacrylamide וקלקר קשיח (~ 3.6-GPA נוקשות) מצעים פונקציונליות על ידי מטריקס (פיברונקטיןבמקרה הזה). microbeads פלורסנט מוטבע בג&#39;לי רך ליד משטח תרבית תאים, וassay המתיחה מבוצע על מנת להעריך לחצי התכווצות סלולריים באמצעות תוכנת גישה פתוחה בחינם. בנוסף, מיקרוסקופיה immunofluorescence על מצעי קשיחות שונים מספקת מידע שימושי על מורפולוגיה העיקרית תא, ארגון שלד התא וvinculin מכילה הידבקויות מוקד כפונקציה של קשיחות מצע.

הפרוטוקול שתואר לעיל מועסק בהצלחה לדגימות רקמה מרובות (n = 12) מארבעה חולים שונים תחת הנחיות של ועדת הבדיקה המוסדית. איור 1 א ממחיש גידול מעי גס נציג מייד לאחר הניתוח שממנו סעיפי הרקמות לתרביות תאים מתקבלים. סעיף רקמה טיפוסי בפתרון HBSS לאחר העברה למכסה המנוע למי?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry at JoVE.com

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

isolation-primary-human-colon-tumor-cells-from-surgical-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign. A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses. 

Video: Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of &gt;50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.

Circulating tumor cells are isolated from the blood of cancer patients without inflicting cellular damage. Isolation of tumor cells is accomplished using a bimolecular surface of E-selectin in addition to antibodies against epithelial markers. A nanotube coating specifically promotes cancer cell adhesion resulting in high capture purities.

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should mimic the human tissues they are aiming to replace; to provide the required anatomical shape, the materials must be able to sustain the mechanical forces they will experience when implanted at the defect site. Although the mechanical properties of tissue-engineered scaffolds are of great importance, many human tissues that undergo restoration with engineered materials have not been fully biomechanically characterized. Several compressive and tensile protocols are reported for evaluating materials, but with large variability it is difficult to compare results between studies. Further complicating the studies is the often destructive nature of mechanical testing. Whilst an understanding of tissue failure is important, it is also important to have knowledge of the elastic and viscoelastic properties under more physiological loading conditions.
This report aims to provide a minimally destructive protocol to evaluate the compressive and tensile properties of human soft tissues. As examples of this technique, the tensile testing of skin and the compressive testing of cartilage are described. These protocols can also be directly applied to synthetic materials to ensure that the mechanical properties are similar to the native tissue. Protocols to assess the mechanical properties of human native tissue will allow a benchmark by which to create suitable tissue-engineered substitutes.

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

אפיון ביומכנית של רקמות רכות אדם באמצעות זחה ו מתיחת בדיקה

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.