This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer &#8216;Midwest Cancer Nanotechnology Training Center&#8217; Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.

아래에서 설명하는 프로토콜은 UIUC 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다. 1. 수집 및 수술 조직 샘플의 소화 <ol><li> 우측 결장 절제술 (도 1a 및도 1b) 후 종양 조직 샘플을 수집. 뿐만 아니라 인접한 건강한 사이트에서 조직을 수집합니다. </li><li> 12 ㎖의 HBSS를 함유하는 용액 15 ml의 유리 병에 즉시 조직을 옮긴다. 절연 거품 상자 안에 얼음에 병을 보관하십시오. </li><li> 45 분 내에서 추가 처리를 위해 조직 배양 후드로 조직 함유 바이알 전송. 후드 안쪽에 얼음 블록에 병을 보관하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 HBSS 용액을 6-7 ml의를 포함하는 6 웰 플레이트에 공급 조직을 따르십시오. 참고 : 물론 당 조직의 양이 헹굼 단계에서 중요하지 않습니다. </li><li> 얼음 블록에 6 웰 플레이트를 유지합니다. 두번 HBSS 용액 조직을 씻어. </li><li> 멸균 SCIS와 분리 된 섹션으로 깔끔하게 조직을 잘라SOR. 작은 부분으로 말하다 조직 멸균 메스 블레이드와 크기가 1-2mm 3보다 크지. </li><li> 조직을 전송하기 전에 (0.1 % 트립신 용액 1㎖를 함유) 표지 된 0.1 % 트립신 바이알을 단다. 피펫으로 0.1 % 트립신 튜브의 각으로 ~ 20 mg의 조직을 전송합니다. </li><li> 트립신의 추가 희석을 방지하기 위해 트립신 유리 병에 HBSS의 전송을 최소화하려고합니다. </li><li> 조직 전송 후 트립신 유리 병의 무게를 측정; 조직 덩어리와 같은 차이를 문서화. </li><li> ~ 20 mg의 조직과 24 웰 플레이트의 각 웰에 트립신 1 ml에 붓고. </li><li> 16 ~ 20 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 진탕 기에서 24 웰 플레이트를 넣습니다. 이 대기 기간 동안 또는 이전 시점에서, 폴리 아크릴 아마이드 겔 기판을 준비하고 3 장에 설명 된대로 ECM 단백질로를 기능화. </li></ol> 2. 효소 단일 세포 현탁액으로 조직 샘플의 해리와 ECM 기능화 탄성 Substrat에 배양 분리 된 세포ES 및 강성 폴리스티렌 요리 <ol><li> 진탕 기에서 4 ° C에서 잘 트립신에서 배양 16 ~ 20 시간 후, 피펫을 사용하여 (전체 성장 미디어의 2-3 ml를 포함) 4 ° C의 전체 성장 미디어 바이알에 4 ° C의 트립신에서 조직을 전송합니다. 성장 매체에 트립신의 최소한의 전송을 보장합니다. 주 : 완전 성장 배지 제형은 다음과 같다 : 10 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 전체의 1 %의 최종 농도 말 혈청이 보충 된 RPMI 1640 배지 기재. </li><li> 12-15 분 동안 37 ℃의 온수 배스에서 미디어 바이알을 함유하는 조직을 배치. </li><li> 피펫을 사용하여 HBSS 용액을 포함하는 15 ㎖의 유리 병에 조직을 전송, 부드럽게 흔들어. </li><li> 2.3를 반복합니다. </li><li> HBSS 용액 1 ml의 솔루션을 포함하는 유리 병 (HBSS)에 전달 0.1 %에 콜라겐 솔루션에서 조직을 제거합니다. 가습 세포 배양 인큐베이터에서 45 ° C에서 37 분, 5 % CO 2 환경 부화. 대기 시간, 따뜻한 growt 중15 ㎖ 중의 H 매체는 수조에서 37 ° C에서 바이알. </li><li> 피펫 최소화 콜라게나 이월에 모든 조직 조각을 잡아 당깁니다. 미리 예열 문화 매체 유리 병에 바로 조직 조각을 꺼냅니다. </li><li> 6 웰 플레이트의 각 웰에 40 μm의 잘 삽입 필터를 놓습니다. 1 ml의 세포 배양 매체를 사용하여 필터를 적셔. </li><li> 조직이 완전히 분해 될 때까지 10 ㎖의 유리 피펫 수회 미디어 씹다 조직. </li><li> 바이알의베이스에 최대한 가까운 피펫 팁을 유지한다. </li><li> 파편과 해리되지 않은 부분을 제거하기 위해 필터 상에 용액을 증착. </li><li> 원심 RT에서 5 분 동안 150 XG에서 미디어 세포 현탁액을 여과 하였다. </li><li> 그 후 상층 액을 제거하고 2 ml의 신선한 문화 매체와 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 (필요한 경우)을 사용하여 세포를 카운트. 종자는 세포 외 기질 (ECM) 작용 젤 원하는 농도의 폴리스티렌 요리에 기본 세포입니다.</li></ol> 3. 준비 및 다른 강성 폴리 아크릴 아미드 (PA) 젤과 폴리스티렌 기판의 기능화 참고 : 제 3의 시각 데모를 들어, 시청자가 / 독자가 가시화 실험의 최근 저널 (주피터) 제 17 조라고합니다. <ol><li> 채택 공개 프로토콜 18, 19, 12mm 2 유리 커버가 하이드로 겔의 공유 결합을 보장하기 위해 화학적으로 미끄러 활성화. <ol><li> 첫째, 치료 유리 커버 실온에서 7 분 동안 3 Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)로 미끄러 져. </li><li> DI 물 린스 완전히 ATS를 제거하고 치료 커버 (70 % 글루 타르 알데히드 주식 솔루션에서 PBS에 희석) 0.5 % 글루 타르 알데히드 30 분 동안 용액으로 미끄러 져. </li></ol></li><li> / V 아크릴 아미드 솔루션 및 0.05 %, N, 10 mM의 HEPES 완충 식염수 (20)에 N &#39;-methylenebisacrylamide (비스) 솔루션 승 5 %를 혼합하여 2 kPa의 젤 솔루션을 얻습니다. / V 아크릴 아미드 0.13 승 8 %를 사용% N, 10 kPa의 젤 (20) 10 mM의 HEPES 완충 식염수에 N &#39;-methylenebisacrylamide (비스) 솔루션입니다. <ol><li> 200 황산 암모늄 (/ w 10 % V) 및 1 : 두 경우 모두 1을 사용 2,000 N, N, N &#39;, N&#39;각각 중합 공정 용 개시제 및 촉매로서 -tetramethylethylenediamine (TEMED). </li><li> 또한, 신탁 마커 (21, 22)로 2 인민군 겔 용액 100 μL 형광 구슬을 추가합니다. </li></ol></li><li> 20 μL 12mm이 활성화 된 유리 커버 슬립에 미리 PA 고분자 겔 용액의 방울을 증착. 드롭 다른 12mm 2 일반 유리 커버 슬립을 놓습니다. 드롭 인해 모세관 현상에 커버 슬립 사이에 퍼져 있는지 확인합니다. 2 kPa의 겔 비드가 대부분 세포 배양 표면 가까이 오지 않도록하기 위해 샌드위치 전환. </li><li> 실온에서 45 분 동안 PA 젤 치료. </li><li> 하나의 가장자리 면도기를 사용하여 상단 커버 슬립을 벗겨. 참고 : 필링 동안 분리 한 가장자리에서 진행샌드위치. 겔은 활성화 된 유리 슬라이드에 접착 유지된다. </li><li> 사용하기 전에 PBS 용액에 젤을 저장합니다. </li><li> 50 μg의 / ㎖ 출판 다음 방법 (23)의 농도로 PA 젤과 ECM 분자, 인간 피브로넥틴 유리를 기능화. <ol><li> 간단히, 2 ml의 순수한 히드라진 하이드레이트 O / N과 기판을 품어. </li><li> 히드라진 하이드레이트를 제거하고 탈 이온수로 철저하게 기판을 씻어. </li><li> 30 분 동안 5 % 아세트산으로 기판을 세척 할 것. </li><li> 아세트산을 제거하고 탈 이온수로 철저하게 기판을 씻어. </li><li> 30 분 동안 탈 이온수에 침지 기판을 유지합니다. </li><li> 50 μg의 / ml의 농도에서 35 분 동안 산화 피브로넥틴과 기판을 품어. </li><li> 10 분 동안 낮은 rpm에서 진탕에 PBS로 기판을 씻어. </li><li> 세포를 도금하기 전에 30 분 동안 2-3 ml의 배양 배지에서 37 ° C에서 모든 기판을 품어. 참고 : 플레이트 세포를 띄엄 띄엄 채우기에D 방식 (1,000-3,000 세포 / ㎠). 각 겔 피복 유리 슬립은 35mm 페트리 접시에 포함되어야한다. 세포가 어떤 현미경 (적어도 O / N) 전에 완전히 준수하도록 허용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 견인 힘 현미경과 면역 형광 현미경 분석 실험 <ol><li> 견인 힘 현미경 분석 <ol><li> 10 분 동안 물을 욕조에 37 ℃의 따뜻한 0.25 % 트립신 - EDTA / 10 % SDS 솔루션 견인 실험을 시작하기 전에. </li><li> 한번에 세포 배양 인큐베이터에서 한 겔을 분리하여 형광 현미경 반전 스테이지 (32X 배율)에 배치했다. </li><li> 시야에서 하나의 셀을 찾을 수 있습니다. 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 셀의 위상차 이미지 (예를 들어,도 3)을 가지고. </li><li> 형광 적절한 필터를 선택할 수있는 영상 모드를 전환합니다. 이 시간 동안 현미경 단계 또는 샘플을 이동하지 마십시오. </li><li> 형광 비드 displac의 이미지를 촬영휴대 견인 (그림 4C)에 의해 에드. </li><li> 겔에서 세포를 분리 배양 접시에 1 ml의 트립신 / SDS 솔루션을 추가합니다. 이 시간 동안 현미경 단계 또는 샘플을 이동하지 마십시오. 또한, 겔의 완전한 제거를 보장하기 위해 셀의 제어 영상을 취할. </li><li> 세포가 제거 된 후 비드 기준 (NULL 힘) 이미지를 가져. </li><li> 다른 모든 젤에 대한 단계를 반복 4.1.2-4.1.8. </li><li> 각각의 경우에 대한 단계 4.1.6과 4.1.8에서 획득 한 두 개의 이미지에서 ImageJ에를 사용하여 이미지 스택을 확인합니다. 스택 스택 → 이미지 → 이미지 : 이미지 스택을 생성하려면, 이미지를 연 후 ImageJ에의 명령 다음과 같은 순서를 사용합니다. </li><li> . 변위 필드와 견인을 얻으려면, 발표 방법 (21), (22) 다음 ImageJ에 플러그인을 사용하여 다음과 같은 링크를 사용하여 이러한 플러그인에 대한 코드와 상세한 튜토리얼을 얻 <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima을</a>gejplugins. <ol><li> &#39;템플릿 매칭&#39;플러그인을 사용하여 스택의 이미지를 맞 춥니 다. → 확인을 스택에 플러그인 → 템플릿 매칭 정렬 조각 → : 단계 4.1.10에서 생성 된 이미지 스택을 연 후 ImageJ에의 명령 순서 다음 사용. 결과적으로 이미지 스택을 저장합니다. 다음 단계에서이 새로운 이미지 스택을 사용합니다. </li><li> PIV (입자 영상 유속계) 플러그인 (그림 4D)를 사용하여 변위 필드를 얻습니다. 단계 4.1.11.1에 저장된 이미지 스택을 연 후 명령의 순서 다음 사용 : 플러그인 → PIV → 반복 PIV (기본) → → 확인 확인 →이 PIV 및 출력을 수락합니다. 원본 이미지 스택과 동일한 디렉토리에있는 PIV 출력을 저장합니다. 다음 단계에서 입력으로 사용합니다. </li><li> 마지막으로 FTTC 견인지도 (그림 4E)을 얻기 위해 플러그인을 (푸리에 세포 계측법 견인 변환)를 사용합니다. 명령을 사용하여 다음과 같은 순서 : 플러그인 → FTTC → 기능ERT의 재료 특성, 즉, 탄성 계수 및 PA 젤 → 확인 →의 포아송 비는 확인 → 단계 4.1.11.2에 저장된 PIV 출력 파일을 선택합니다. 저장 FTTC 이미지 스택과 PIV 출력과 동일한 디렉토리에 발생합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 면역 형광 현미경 분석 실험 <ol><li> 층류 후드에 면역 염색 할 수있는 기판 가지고 배양 배지를 제거합니다. </li><li> PBS로 기판을 세척하여 실온에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 고정합니다. </li><li> 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. 따라서, 30 분 동안 500 ㎕의 신호 인핸서와 기판을 배양하고 PBS로 헹군다. </li><li> 실온에서 45 분 동안 PBS 250 희석 : 1 단일 클론 항 vinculin 항체와 세포를 품어. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> (200) 희석 : 1 차 항체 알렉사 플 루어 488 염소 항 마우스 IgG를 가진 샘플을 품어실온에서 30 분 동안 PBS에서. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> F - 굴지 구조를 시각화하기 위해, TRITC 실온에서 45 분 동안 농도를 50㎍ / ㎖에서 접합체를 Phalloidin의와 세포를 품어. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> 이미지 공 초점 주사 레이저 현미경을 사용하여 샘플 (도 5a -도 5d). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

셀룰러 견인 스트레스는 최근 전이 상태 (13)의 잠재적 인 생물 물리학 적 지표로 떠오르고있다. 그러나 차 종양 세포와의 실험 견인 데이터는 현재까지 문헌에 존재하지 않습니다. 또한, 다른 강성 폴리 아크릴 아마이드 젤에 직접 배양 고립 된 차 대장 세포는 아직보고되지 않습니다. 따라서, 우리는 겔 및 폴리스티렌 (도 2)에 최적화 된 일차 결장 세포 배양 조건을 확립한다....

기계적인 미세 환경은, 생화학 적 요인 외에, 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것이 최근 점점 분명하게되었다. 세포를 감지하고이 3-7 (2D 배양에서와 같이)에 부착 또는 (3D 배양에서와 같이)에 의해 포위되어있는 기판의 강성에 응답 할 수있다. 이렇게함으로써, 세포 분화 3, 4 형태, 이주 / 운동성 5 바이오 물성 (6), (7)의 성장 및 기타 프로세스를 변조 할 수있다. 암세포는 또한 접착 수용체의 조정, 계층 - 기계 화학적 결합과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 2 차원 및 3 차원 매트릭스 강성 응답한다. 예를 들어, 유선 상피 세포 (MEC의) 150 아빠 기판에 배양 할 때 강성과 유사 정상적인 선포 실질을 형성건강한 유방 조직. 흥미롭게도, 이들은 종양 기질 (8)의 강성을 모방 딱딱한 기판 (&gt; 5,000 PA)에서 배양 구조와 전사 모두 현상 종양의 특징은 나타낸다. 또 다른 실험은 유방 종양 콜라겐 가교 ECM 9 보강 동반되는 것을 나타낸다. 최근의 실험들은 생리적으로 중요한 강성 (20-47 kPa의)을 갖는 2 차원 기판에서 배양 있지만 (3.6 GPA) 기판 상에 매우 뻣뻣하지 않을 때 인간 결장암 (HCT-8) 세포 표현형 (MLP) 등의 전이를 표시하는 것을 보여준다 10- 제 12 .These 셀 폼과 같은 종양 세포 클러스터와 그 주변부터 서로 해리. 변화는 그들은 세포 - 세포 및 세포 - ECM 부착을 줄이고, 철새가, 확산, 발생 (R 전환에 E) 둥근 형태이 상피로. 이 발생하지 않는 매우 어려운 폴리스티렌 기판에 HCT-8 세포 배양악성 특징. 따라서이 HCT-8 세포 인해 적절한 미세 환경에 대한 노출로 전이 될 수 있음을 가정하고있다. 이들 실험이없는 일차 인간 암 세포 불멸화 암 세포주 또는 일차 쥐 유래 세포로 수행되는 것을 주목할 필요가있다. 최근 연구 증강 셀룰러 트랙션 응력 전이성 세포 13 국지적 연구는 폴리 아크릴 아미드 겔에서 다른 인간 암 세포주에 대한 견인력을 측정하는 것을 포함하는 잠재적 생물 리 학적 특성으로서 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 또한, 전이성 암세포가 모든 경우에 13 비 전이성 세포에 비해 상당히 높은 트랙션 응력을 발휘할 수있는 것을 알 수있다. 그러나,이 결과는 직접적으로 유도 뮤린 유방암 세포주 (14)에 앞서 발표 결과와 모순. 또한, 최근의 연구는 세포 골격 리모델링 프로 불후 및 기본 인간의 세포 사이에 현저한 차이를 강조TEIN 프로파일과 세포 생존 단백질 발현 15. 따라서, 일차 인간 암 세포에 대한 견인을 포함한 생물 물리학 적 분석의 많은 방문하는 것이 중요하다. 일차 세포가 불멸화 된 암 세포주 견인 경향 요점을 되풀이 것인지 이는 질문을 다룰 것이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부드러운 기판 (폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔)뿐만 아니라에 페트리 접시에 그들을 배양 (건강과 암 모두) 주 인간의 대장 세포의 분리에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 소화 및 단일 세포 현탁액 (16)에 외과 적 조직 샘플의 결과의 효소 분해에 기초한다. 우리가 아는이 직접 세포 계측법 견인 용 내장형 형광 마이크로 비드와 부드러운 하이드로 겔 기판에 절연 차 대장 암과 정상 세포를 배양의 첫 번째 데모입니다. 투명 겔 기판은 또한 면역 염색을 할​​ 수 있습니다. 이 분석은 밝혀 F - 굴지 조직의 차이기판 강성 변화와 같은 주요 인간의 대장 세포에 초점 유착. 이 세포 배양 플랫폼은 암 사전 진단을위한 매개 변수로 셀 강성과 견인 1 차 인간 세포의 다양한 생물 물리학 적 특성을 탐구의 가능성을 열어.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003736</td><td></td></tr><tr><td>Collagenese</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>01201-5</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-methylenebisacrylamide (bis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin</td><td>BD biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazine hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18412</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>Signal enhancer</td><td>Life technologies</td><td>I36933</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti vinculin antibody&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>TRITC phalloidin conjugates&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m fluroscent beads</td><td>Life technologies</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>12 mm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;glass cover slips</td><td>Corning</td><td>2865-12</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of primary human colon tumor cells from surgical tissues and culturing them directly on soft elastic substrates for traction cytometry

암 세포 접착 수용체 이루어지는 코디 계층 - 기계 화학적 시스템과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 복잡한 방식으로 기계적 강성 매트릭스 응답. Mechanosensitivity를 다른 암세포의 시험관에 하지 일차 인간 암 세포 불멸화 세포주 또는 일차 세포를 쥐 유래, 주로 연구 하였다. 따라서, 작은 시험관 일차 인간 대장 암 세포의 mechanosensitivity 대해 공지되어있다. 여기서, 최적화 프로토콜은 건강한 인간 암 수술 조직 샘플로부터 일차 인간 결장 세포의 분리를 설명하는 현상된다. 고립 대장 세포를 피브로넥틴 (세포 외 기질에 의해 기능화 기판 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔과 강성 폴리스티렌 (~ 3.6 GPa의 강성) (10 kPa의 강성) (2 kPa의 강성) 부드럽고 뻣뻣한에 성공적으로 배양이 경우에). 형광 마이크로 비드를 세포 배양 표면 근방 소프트 겔에 포함되고, 정지 마찰 분석법 자유로운 개방형 액세스 소프트웨어를 이용하여 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행된다. 또한, 다른 강성 기판상의 면역 형광 현미경 검사는 기판의 강성의 함수로서 초점 유착을 함유하는 일차 전지의 형태, 세포 골격 조직 및 vinculin에 대한 유용한 정보를 제공한다.

위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 기관 검토위원회의 지침에 따라 네 가지 환자에서 여러 조직 샘플 (N = 12)을 위해 사용된다. 그림 1A 바로 세포 배양에 대한 조직 섹션이 얻을 수있는 수술 후 대표적인 대장 종양을 보여줍니다. 추가 처리를 위해 층류 후드 전사 후 HBSS 용액 전형적인 조직 절편은도 1b에 도시되어있다. 소화 및 단일 세포 현탁액으로 수술 조직 샘플의 ...

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Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses. 

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Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

연구

암 연구학

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

의학

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 섬유 아세포

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

생물학

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: An Immunofluorescence-based Method to Study Cell Adhesion and Spreading on Substrates

Source: Ali, M. Y et al., <a href="https://www.jove.com/v/52532"> Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video describes the technique of studying the cytoskeleton and focal adhesions in primary human colon cancer cells to understand its variations depending on substrate rigidity. This culture of cancer cells on soft and hard substrates allows various downstream biophysical measurements for cancer prognosis.

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: 기질의 세포 접착 및 확산을 연구하기 위한 면역형광 기반 방법

Source: Ali, M. Y et al.,  Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Colorectal Cancer

Assays & techniques

Traction Cytometry Assay: A Method to Quantify Traction Force Exerted by Cancer Cells on ECM

Source: Ali, M. Y., et al.&#160; <a href="https://www.jove.com/v/52532"> Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video describes the traction force microscopy assay. The assay determines the cellular traction of human colon cancer cells on the extracellular matrix present on soft elastic hydrogel having embedded fluorescent beads. The resultant displacement of fluorescent beads is measured using an appropriate software.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

요약

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