The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.

Dieses Protokoll folgt den LUMC und AMC Richtlinien der menschlichen Forschung Ethik-Kommission. 1. Chirurgisches Verfahren und Gewebeentnahme Hinweis: Obwohl verschiedene Techniken zur chirurgischen Entfernung der Morbus Dupuytren vorhanden sind, ist der derzeitige Goldstandard die Teil Fasziektomie 15. Die meisten Patienten sind in der Tageschirurgie behandelt. <ol><li> Führen Operation unter Vollnarkose nach Präferenzen des Patienten und Anästhesisten und Begleiterkrankungen des Patienten. Diese Überlegungen sind über den Rahmen dieses Dokuments. Vor dem Schnitt, berühren Sie die Haut mit einem scharfen Gegenstand, um zu überprüfen, dass der Anästhesie ist zufriedenstellend. Verwenden Sie ein Tourniquet auf chirurgische Visualisierungs in einem unblutigen Bereich zu erleichtern. </li><li> Nach Steril prepping und Drapierungen, markieren die erwarteten Schnitt mit einem Stift. Inzision der Haut mit einem Skalpell unter Lupenvergrößerung entweder längs or mit Zickzackeinschnitte zusätzliche Kontrakturen zu verhindern und auch um eine ausreichende Belichtung zu ermöglichen. </li><li> Mit Schere Dissektion, befreien die Haut und Unterhaut aus den zugrunde liegenden Vertrag Fascia palmaris. Identifizieren und schützen das Gefäßnervenbündel des Fingers, weil der kranke Kabel kann es in Richtung der Mittellinie zu verschieben. Sobald der fibrotischen Gewebes (Knötchen und / oder Kabel) wird dargelegt, auszuschneiden es scharf und regional (Wert) mit einem Skalpell. Führen Sie sorgfältige Blutstillung unter Blutsperre am Ende des Verfahrens zur Hämatombildung zu verhindern. </li><li> Um die Haut zu schließen, verwenden Sie zusätzliche Z-Plastiken zu Teil Verlängerung der Haut zu erhalten. </li><li> Für diese Studien nur das Knötchen Teil des fibrotischen Kabel, die aktivsten und zellulären Teil der Krankheit. Haben der Chirurg durchführen makroskopischen Identifizierung. Die isolierten Knötchen in der Handfläche der Hand sind oft Vorläufer oder eine Schnur dabei jedoch kaum reseziert, wie sie in der Regel keine Symptome verursachen.Die, die wir herausgeschnitten waren die Knötchen, die Teil einer Schnur der vertraglich Finger waren. Identifizieren Sie diese Knötchen von der harten dicken Teil der Kabel in der handpalm (1A). </li><li> Sobald der Chirurg entfernt das Gewebe unmittelbar Übertragung mit Hilfe einer sterilen Pinzette in ein 50 ml Röhrchen, das DMEM-Medium mit 10% FCS und 1% (P / S) ergänzt. Halten Sie das Gewebe für maximal 2 Stunden in diesem Medium auf eine Schachtel mit nassem Eis (4 ° C) (zB Transport der Gewebe aus dem Operationssaal in die Zellkultur-Anlage). </li><li> Bewahren Sie die Proben auf nassem Eis (4 ° C), während der Vorbereitung für den nächsten Schritt. Herstellung der Materialien und Zellkulturkammer erfordert 10-20 min. </li></ol> 2. Vorbereitung des Instruments, Kulturmedium und Kultureinsätze Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben. <ol><li> Bereiten 500 ml DMEM mit 10% FCS und 1% (P / S) und Filter s ergänztterilize. Vorwärmen des Mediums bei 37 ° C. </li><li> Autoklav Pinzette, ein Paar von gebogenen Blatt Mayo Schere (150 bis 170 mm Länge) und ein Paar von Metzenbaumschere und an einem sterilen Behälter. </li><li> Unter laminaren Strömung, öffnen Sie eine sterile 12-Well-Kulturplatte. Setzen Sie einen Kultureinsatzes (0,45 um Porengröße, Durchmesser 12 mm) in jede Vertiefung der 12-Well-Platte (1B, unteres Bild). </li><li> Füllen der Platte mit 12 Vertiefungen mit 600 &amp; mgr; l vorgewärmtes (37ºC) Kulturmedium durch Pipettieren auf dem gut und nicht direkt auf die Membran des Einsatzes. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) (Abbildung 1B, oberes Bild). <ol><li> Alternativ können Sie einen 24-Well-Platte und 300 ul Medium pro Vertiefung. Das Volumen des Mediums pro Vertiefung ist optimal, wenn ein Meniskus Schicht zwischen der Flüssigkeit und dem unteren Teil der Membraneinsatz gebildet. Anmerkung: das Medium an der Unterseite des Bohrlochs diffundiert durch die Nitrocellulose membrane Bildung des Meniskus Schicht, wie in Systemen von 1B (unten) dargestellt. </li></ol></li></ol> 3. Gewebepräparation und Ex-vivo-Gewebekultur-Setup Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben. <ol><li> Übertragen Sie die Knoten Teil des Netzkabels aus der 50 ml Tube auf einer 100 mm Petrischale und 10 ml der vorgewärmten (37 ° C) Medium. Sicherzustellen, dass das Gewebe in während des gesamten Verfahrens mit der Flüssigkeit. <ol><li> Entfernen Sie die perinodular Fettschicht über die Metzenbaumschere. Entsorgen Sie das Fettgewebe. Mit der Verwendung von Pinzetten und die gebogenen Blatt Schere, geschnitten quer das Gewebe in kleinere Stücke (maximale Dicke von 200 um). </li></ol></li><li> Übertragung der 12-Well-Platte aus dem Inkubator in das laminare Haube. Überprüfen Sie, dass die Membran der Beilage transparent (nass) gedreht und ist daher in Kontakt mit dem Medium. </li><li> Mit einer Pinzetteheben ein Gewebeteil durch Berühren der Außenschicht (nicht die Spannung auf das Gewebe Aufpreis). Platzieren einer Gewebeteil auf der Membran des Zellkultureinsatzes, so daß das Gewebe in der Luft-Medium Interphase verbleibt. Kultur maximal zwei Gewebeteile auf dem gleichen Einsatz / gut. </li><li> Sicherzustellen, dass das Gewebe flach auf der Membran mit dem Medium angeordnet ist, in Längskontakt, so daß das Gewebe nicht schwimmt von der Membran noch vollständig vom Füllgut bedeckt. Vermeiden Sie Luftblasen. Anmerkung: In diesem Stadium ist es möglich, Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren von Interesse dem Medium hinzuzufügen; beispielsweise Testverbindungen (A, B, C, D, E) in Wiederholungen und / oder im Konzentrationskurve. Mindestens 2 Steuer (unbehandelt) Gewebestücke unter normalen Wachstumsbedingungen, um sicherzustellen, dass das Experiment wurde richtig eingerichtet. Gewebe für 3-7 Tage Inkubieren in einem Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Infizieren das Gewebe entweder mit lentiviralen oder adenoviralen Konstrukt, wenn die Überexpression oder knock down eXperimente eines Gens von Interesse müssen (Figur 2) durchgeführt werden. Übertragen einer Gewebeteil aus der 12-Well-Platte in eine 35 mm-Schale mit einer Pinzette. <ol><li> Verwenden ein maximales Volumen von 10 ul Virus mit hohem Titer. </li><li> Führen Sie die Injektion unter einem Präpariermikroskop mit einer Insulinspritze mit 50 ul PBS, enthaltend 10 ul des ausgewählten Virus belastet. Die Nadel senkrecht zu der Mitte des Gewebes. </li><li> Langsam spritzen den Inhalt der Spritze. Sie nicht die Nadel direkt zurückzuziehen. Beim Durchstechen des Gewebes, lassen Sie die Nadel durch die andere Seite zu gehen, aber halten Sie die Nadel im Gewebe selbst (um die Mitte des Gewebes). </li><li> Übertragen Sie das Gewebe wieder in die 12-Well-Platte, schließen Sie die Kulturplatte und legen Sie sie in den Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol></li></ol> 4. Whole-mount Immunfluoreszenzfärbungen und 3D-Rekonstruktion Hinweis: Alle Pro-verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben. Das Protokoll für die ganze Berg Immunfärbung und Imaging unten beschrieben ist eine Adaption von für andere Gewebe 16-19 verwendet die zuvor beschriebenen Verfahren. Puffer und Materialien sind in Tabelle 1 und Materialliste beschrieben. <ol><li> Übertragungsgewebe von der Kulturplatte zu 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS. 2 x Waschen für 5 min in PBS-Lösung auf einer rotierenden Plattform. Fix Gewebe in 4% PFA gepuffert (1,5 ml Lösung pro Gewebe in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen), O / N bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform. </li><li> PFA entfernen und waschen 3x in PBS für jeweils 5 min. </li><li> Dehydratisieren Gewebe durch Eintauchen in eine 25% ige Methanollösung 2 h lang bei RT auf einer rotierenden Plattform. Erhöhen des Methanolprozent allmählich (50%, 75%, 100%) mit den in jeder Lösung 2 h lang bei RT auf einer rotierenden Plattform eingetaucht Geweben. </li><li> Übertragungsgewebe in DMSO / Methanol-Lösung (Permeabilisierung Schritt) für 3 Wochen bei 4 ° C,wie zuvor 18 beschrieben. Anmerkung: In diesem Stadium können Gewebe langfristig in 100% Methanol bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Fahren Sie mit dem Färbeverfahren 16, 17; allmählich rehydrieren Gewebe (75% -50% -25% -0% Methanol-Serie). Führen Sie jede Rehydratisierungsschritt für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C, unter ständigem Rühren. </li><li> Proben mit primären Antikörpern in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 20% DMSO O / N bei 4 ° C inkubieren. Verwenden Antikörper in den folgenden Verhältnissen über die kommerziellen Vorräte in PBS: anti-α Glattmuskelaktin (1: 500, Maus), Anti-Kollagen Typ I (1: 500, Ziege), anti-Kollagen Typ III (1: 500, Ziege). </li><li> Umfassend Waschen in PBS für 48 Stunden bei 4 ° C (Änderung PBS-Lösung 3 bis 4 mal). </li><li> Verdünne geeigneten sekundären Antikörper (Alexa 555-Anti-Maus, Alexa 488-Anti-Ziegen) bei 1: 250 Verdünnung in PBS, enthaltend 1% (BSA) und 20% DMSO. Inkubieren Sie O / N bei 4 ° C. </li><li> Umfassend Waschen in PBS für 48 Stunden bei 476; C und Inkubation mit Kerngegenfärbung, TO-PRO-3, verdünnt 1: 500 in PBS bei dem letzten Waschschritt. Anmerkung: TO-PRO-3 ist eine weit rotemittierende DNA-Farbstoff (mit einem He-Ne-Laser mit 633 nm-Linie) und ist für die gleichzeitige Abbildung mit anderen Kanälen kombiniert; in diesem Fall von Kollagen Typ I / Kollagen Typ III (488 nm), α Glattmuskelaktin (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). </li><li> Übertragen die Gewebe auf ein Methanol-Reihe (25% -50% -75%), langsam in das Gewebe zu entwässern; Ausführen der einzelnen Entwässerungsschritt für 2 h bei RT und O / N bei 4 ° C unter konstantem Rühren. <ol><li> Übertragungsgewebe in Polypropylenröhrchen. Klar Gewebe in Methylsalicylat (Griff unter chemischen Abzugshaube) 18 oder eine alternative Nutzung BABB Lösung 19. Inkubation bei RT unter ständigem Rühren, bis die Gewebe transparent. Berg zwischen einer Rutsche und einem Deckglas mit harten Satz Eindeckmedium (1C, oberes Bild) abgedichtet. </li></ol></li><li> Bild Proben auf einem invertierten konfokalen MikroRahmen mit hoher NA 63X und / oder 100X Ölimmersionsobjektiven (1C) ausgestattet. <ol><li> Reinigen Sie das Objektiv mit der Mikroskopherstellers Reinigungslösung. </li><li> Einen Tropfen des Öls auf die Objektivlinse. Den Objektträger mit der Probe auf dem Mikroskoptisch und Fokus auf der Probe. </li></ol></li><li> Eingestellt, die Konfigurationen am Mikroskop für die gleichzeitige Abbildung von Dreikanal-Fluoreszenz mit Laserlinien bei 488 nm, 514 nm und 633 nm. </li><li> Erfassung Einzel XY Bilder oder mehrere Fokalebene Bilder (Z stack) (3A). Verwenden Sie erhöhte Breite der Z-Stack zur Ausführung 3D-Rekonstruktion. Zu erhalten, ein hochauflösendes Bild zu verwenden niedrige Scangeschwindigkeit, Anzahl der durchschnittlichen Scans (≥ 3) und zu erwerben 16-Bit-Bildern von 1024 x 1024 Pixel Auflösung. </li><li> Analysieren Sie die Z-Stack aufgenommenen Bilder: zuerst benennen und speichern Bilddatei (xyz). Mit dem Software-Programm des konfokalen Mikroskops, konfigurieren Sie eine maximale Intensität projection der Z-Stapel-Bildern in ein 3D-Bild rekonstruiert. <ol><li> Wählen Sie das xyz-Datei, in der &quot;Process Tools&quot;, klicken Sie unter &quot;Visualisierung&quot; und &quot;3D-Projektion&quot;. Enter &quot;Maximum&quot; in dem Verfahren der Vorsprung (oder &quot;Normal&quot;, wenn das Fluoreszenzsignal gesättigt ist). Für eine einzige Projektion nicht die X, Y, und Z-Ebenen ändern, und wenden Sie das Projektierungstool (3B, r1). </li></ol></li><li> Verwenden Sie die Z-Stack Bilder, um eine 3D-Projektion mit Animation (konfokalen Software) zur Ansicht erstellen. Wählen Sie das xyz-Datei, in der Prozess Extras auf unter &quot;Visualisierung&quot; und &quot;3D-Projektion&quot;. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Film erstellen&quot;. Geben Sie die Start-Drehwinkel in Grad (zB 0 ° als Ausgangspunkt des Films, Y-Achse) und klicken Sie auf &quot;Set Start&quot;. Geben Sie die End-Drehwinkel in Grad (Y-Achse) als Endpunkt des Films (zB 180 ° oder 3606; Eine vollständige Drehung) und klicken Sie auf &quot;Set End&quot;. </li><li> Wähle &quot;Maximum&quot; als ein Verfahren zur Projektion (oder &quot;Average&quot;, wenn das Fluoreszenzsignal gesättigt ist). Geben Sie den &quot;Number of Frames&quot; für die Drehung des 3D-Rekonstruktion (beispielsweise 20 Umdrehungen oder höher, um die Drehgeschwindigkeit zu verringern). Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;. Exportieren Sie den Film als visuelle Datei (zB &quot;avi&quot;) (Ergänzende Film 1) oder Export als Datei &quot;tiff&quot;, die ein Bild-Datei für jeden Drehwinkel erzeugt (3B; Dreh r4, r10, r18). </li></ol></li></ol> 5. Kombinierte Second Harmonic Generation (Kollagen) und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Excited (Elastin) Imaging auf Ex vivo Tissue während Kultur Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben. <ol><li> Entfernen Transwell-Platten von Inkubator und legen Sie eine einzelne (nicht fixierte) tiUSGABE an einer 35 mm-Zellkulturplatte mit 500 ul Medium. </li><li> Positionieren Sie das Gewebe, so dass die lange Achse ist flach auf der Platte. Halten Gewebe nass zu allen Zeiten aber nicht schwimmen. </li><li> Zeigen wassereingetaucht Ziel der Multiphotonen-Mikroskop direkt in Kontakt mit dem Gewebe (Abbildung 1C). </li><li> Erhalten Bilder mit einer Anregungswellenlänge von 800 nm und sammeln emittierten Lichts zwischen 371 bis 425 nm (SHG-Kollagen) und 474 bis 532 nm (Autofluoreszenz, Elastin) (3C). Führen Zwei-Photonen-Mikroskopie in aufrechter konfokalen Mikroskop mit einem Femtosekundenlaser mit einer 20X / 1.0 NA Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet. Prozess konfokalen Stacks mit Herstellersoftware. Hinweis: Die Anregung mit einem Nah-Infrarot-Laser der Kollagen-Moleküle erzeugt kontrastreiche Darstellung von nativem Kollagen-Strukturen in verschiedenen Tiefen. </li></ol>

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S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+&#945;-smooth+muscle+actin+determines+the+contractile+phenotype+of+Dupuytren's+nodular+cells.">Post-transcriptional regulation of &#945;-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).</li></ol>

3D-Organkultur: Die Autoren haben eine Patentanmeldung für Morbus Dupuytren eingereicht. # GB1307200. Kommerzielle Lizenz und Dienstleistungsverträge zur Verfügung.

Die kritischsten Schritte der Kultivierung ex vivo menschlichen Bindegewebes sind die sofortige Verwendung des Gewebes nach der operativen Entfernung der Rentabilität zu gewährleisten; Das Gewebe sollte in Medium oder Kochsalzlösung zu jeder Zeit bleiben; Aufrechterhaltung einer sterilen Kultur; Querschnitten von Gewebe sollte maximal 200 &amp; mgr; m Dicke zu haben; Einrichten der Ex-vivo-Kultursystem ist optimal, wenn Gewebe in Kontakt mit dem Medium, aber nicht vollständig untergetaucht. Medium ...

Dupuytren-Krankheit (DD), bewirkt eine gutartige fibroproliferative Krankheit Permanent Beugung der Finger aufgrund der Bildung von Knötchen und Leitungen in der Handfläche der Hand. Obwohl die Krankheit verbreitet ist besonders hoch bei Kaukasiern in Nordeuropa, die zugrunde liegenden genetischen Ursache der Erkrankung ist unbekannt 1. Das Hauptmerkmal der DD ist die Überproduktion von extrazellulärer Matrix (ECM), Proteine ​​(zB Kollagen), die den Raum zwischen den Sehnen und Haut der Handfläche der Hand und der Finger besetzen eine harte Fasergewebe zu bilden, die feinen Bewegungen dauerhaft gestört der Hand 2, 3. Die Wiederauftreten der Krankheit schlägt zugrunde liegenden genetischen Veränderungen als Ursache der Fibrose 1, 4. Eine wirksame Behandlung sein könnte, um direkt zielen auf die unkontrollierbare fibrotische Mechanismen auf zellulärer und molekularer Ebene. Unsere jüngsten Arbeiten zur Fibrose hat uns zur Entwicklung einer LED-neuartigen 3D Kultursystem, das Kurzzeitkultur der menschlichen fibrotischen Gewebes, die das Potenzial von Drogentests ermöglicht. Dieses System hat dazu beigetragen, die einschränkender Versuch 2D Fibroblastenkulturen zu überwinden und eine Rolle zum teilweisen Abregulation durch Exon-Skipping erreicht, von TGFß Stoffwechselwegaktivierung der Vermittlung Fibrose 5 definieren. Wir haben ein Verfahren zur ex vivo-Kultur menschlicher Resektionsproben aus DD-Patienten, die Wechselwirkung zwischen Myofibroblasten und der umgebenden ECM 5, 6 studieren entwickelt. Das Studium der DD Bindegewebe Fibrose sowie anderer fibrotischer Erkrankungen beruht auf histopathologische Analyse des ausgeschnittenen chirurgischen Proben, Isolation von Fibroblasten aus dem Gewebe und Etablierung von Primärkulturen oder Zellsortierverfahren. Diese Ansätze sind ziemlich statisch, da sie exogener Manipulation der Krankheit Eigenschaften oder therapeutischen Intervention vom Experimentator nicht zulassen. Außerdem primären cell Kulturen neigen dazu, zu den Kulturbedingungen anpassen und ihre Genexpression Eigenschaften unterscheiden sich im Wesentlichen aus der in vivo Situation bei jedem Durchgang, auch während der frühen Passagen (unter Durchgang 3 und 6) 7, 8. Es ist uns gelungen, den Abfall chirurgisches Material in zu erhalten Ex-vivo-Kulturbedingungen für eine Zeitdauer, die Studie über die patientenspezifische Eigenschaften und das Screening von anti-fibrotische oder entzündungshemmende Medikament Verbindungen ermöglicht. Das System wird auf eine Nitrocellulosemembran, die einen Kontakt des Gewebes mit dem Medium, jedoch nicht mit dem Kunststoff ermöglicht somit die Verhinderung der Veränderung des Gewebes bei der Befestigung, wie zuvor beobachtet, wenn die Kultivierung DD Fibroblasten sowie andere Zelltypen 9 basiert. Kein Kollagengel oder andere ECM-Protein Substrat erforderlich, da die DD Gewebe selbst produziert große Mengen dieser Proteine. Dies ist für die Erhaltung der nativen ECM-Mikroumgebung und Umsätze sin vorteilhaftce Matrix Substrate sind wichtiger Regulator der Gewebearchitektur und Funktion 10, 11. Zum Beispiel ECM Proteine, wie Fibronectin, Laminin und Kollagen kann von vorne nach hinten Polarität Fibroblasten ähnlich für apikal-basal Polarität in Epithelzellen 12 gezeigt, 13 beeinflussen . polarisierte Zellen haben asymmetrische Verteilung der extrazellulären Moleküle, die Zellmigration und Genexpression, zB α1β1 Integrin Zugänglichkeit auf die Membran wirkt Zelladhäsion an Kollagen Typ I 14 bestimmt. Da ein Hauptziel dieses 3D-Modell war es, die einheimischen Mikroumgebung zu erhalten, wurde keine künstlichen ECM Matrixsubstrat verwendet. Kurz: Resektion Proben sind gleichmäßig in einer sterilen Umgebung abgeschnitten und auf nitrocellular Membranen gelegt. Wenn die Behandlung mittels Injektion verabreicht wird benötigt das Gewebe injiziert werden, nachdem sie auf der Membran platziert. Wenn die Behandlung nicht benötigen, um über inj verwaltet werdenection dann wird die Verbindung zu dem Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin (P / S)) zugefügt. Die Kulturen werden für höchstens zehn Tage nach dem das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert, durch 30% Saccharose-Lösung verarbeitet werden, in OCT-Verbindung eingebettet und bei -80 ° C gelagert gehalten, wie zuvor beschrieben 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>high glucose, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PIHA01250</td>
			<td>0.45um pore size, 12mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1310-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- &#945; smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type III</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1330-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylsalicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsccope glass coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>BB024060A1</td>
			<td>24x60mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope SuperFrost slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>AA00000102E</td>
			<td>76x26mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 II confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 NLO upright confocal microscope</td>
			<td>Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA 
			water-immersion objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Verfahren ex vivo, 3D-Kultur des Bindegewebes ist eine einfache und robuste Aufbau-System, um die Beziehung zwischen ECM und andere Zellbestandteile der DD Gewebe bilden und möglicherweise andere Arten von Fibrose als auch zu verstehen. Außerdem erlaubt dieses System eine zuverlässige Methode, um die Wirkungen der Verbindungen auf die verschiedenen Zelltypen und deren Auswirkungen auf den fibrotischen Last 20 zu testen. Die Schritte von Gewinnung von Operationsabfälle...

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Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Morbus Dupuytren (DD) ist ein fibroproliferative Erkrankung der Handfläche der Hand. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultur Resektionsproben aus DD in einem dreidimensionalen (3D) Kultur-System. Solche Kurzzeitkultur-System ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und molekularen Eigenschaften des fibrotischen Gewebe.

Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

10.3K Aufrufe.  Leiden University Medical Center.  Morbus Dupuytren (DD) ist ein fibroproliferative Erkrankung der Handfläche der Hand. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultur Resektionsproben aus DD in einem dreidimensionalen (3D) Kultur-System. Solche Kurzzeitkultur-System ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und molekularen Eigenschaften des fibrotischen Gewebe. 

Serie: Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Forschung

Medizin

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Verfahren für Menschen V. saphena<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Perfusion und Außen Verstärkung

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Strategische Endothelzell Tubusbildung Assay: Ein Vergleich extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktor Reduzierte Extrazellulärmatrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...