Unsere Methode ist von Bedeutung, weil sie es Forschern ermöglicht, verschiedene Zelltypen zu isolieren und zu manipulieren, um ihre individuellen Abstammungsbeiträge zur Gewebeform und -funktion zu untersuchen. Diese Technik ist eine sanfte und effiziente Methode zum Trennen von Zelltypen, sodass die Integrität der Zellen für die 3D-Kultur erhalten bleibt. Diese Technik kann auch auf andere Systeme angewendet werden, um Zellen zu isolieren, die keine gut charakterisierten Biomarker haben.
Um die Nummer zwei, drei, vier und fünf Brustdrüsen von einer 10 bis 14 Wochen alten weiblichen Maus zu ernten, machen Sie zuerst einen einen Zentimeter Schnitt an der Mittellinie zwischen den beiden Hinterbeinen. Verlängern Sie den Schnitt bis zum Hals und machen Sie kleine seitliche Schnitte vom Mittellinienschnitt in Richtung der Gliedmaßen. Dann dehnen Sie die Haut gelehrt, bevor Sie es mit einem Stift auf jeder Seite des Tieres zu sichern.
Mit Zangen, sammeln Sie die Lymphknoten aus der Zahl vier Drüsen. Um die Brustdrüsen zu entfernen, verwenden Sie scharfe Schere, um unter jede Region des Gewebes zu schneiden, die Platzierung der Gewebe in 50 Milliliter von vier Grad Celsius DMEM-F12 mit 5%FBS und Antimykotik bei der Ernte ergänzt. Wenn alle Gewebe gesammelt sind, hacken Sie die Drüsen, bis die Stücke leicht durch eine Ein-Milliliter-Pipette-Spitze passen können, die die Platte nach Bedarf dreht, so dass alle Gewebe gleichmäßig gehackt werden.
Dann übertragen Sie die Fragmente in drei Milliliter Verdauungsmedium in einen einzigen Brunnen einer sechs-Well-niedrigen Haftschale für 14 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Morgen, sanft Pipette das Gewebe 10 Mal mit einem Milliliter Mikropipette und übertragen die Gewebefragmente in eine 15 Milliliter Rohr. Sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern frischen DPBS.
Filtern Sie die Suspension durch ein vornasses 70 Mikrometer Nylon-Zellsieb, spülen Sie das Rohr im Sieb viermal mit 10 Millilitern 37 Grad Celsius DMEM-F12 pro Waschgang. Um die Gewebefragmente freizugeben, halten Sie die Sieblasche mit den Handschuhen und kehren Sie das Sieb über eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale um. Geben Sie vier Milliliter-Aliquots wartungsmittel durch den Boden des Siebs und untersuchen Sie schnell die Schale auf einzelne Zellen, Fetttröpfchen und kontaminierendes Gewebe unter einem invertierten Mikroskop.
Legen Sie dann die Platte für 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator, damit die Gewebefragmente an der Schale haften und zweischichtige Fragmente erzeugen können. Um die Myoepithelzellen von den luminalen Epithelzellen zu trennen, spülen Sie die Schale mit einem Milliliter DPBS ab, bevor Sie den Zellen einen Milliliter frische0,5%trypsin-EDTA hinzufügen. Überwachen Sie die Verdauung sorgfältig unter einem invertierten Mikroskop.
Die äußere Schicht der Myoepithelzellen beginnt sich innerhalb von drei bis sechs Minuten zu lösen. Wenn sich die Myoepithelzellen gelöst haben, übertragen Sie den Überstand in ein 15-Milliliter-Rohr, das zwei Milliliter 10%FBS in DPBS enthält. Ohne die luminalen Epithelzellen zu stören, spülen Sie die Schale vorsichtig mit zwei Millilitern DPBS ab, bevor Sie den verbleibenden Zellen einen frischen Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen.
Nach sieben bis 15 Minuten die enzymatische Reaktion mit zwei Millilitern 10%FBS in PBS ablöschen und die Zellen in ein neues 15-Milliliter-Rohr übertragen. Es ist wichtig, die Zellen während der Differentialtrypsinisierung genau zu überwachen und die Zellen nicht zu verdauen. Wenn beide Fraktionen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie die Zellen, um alle Restdissoziationsreagenz zu entfernen und die Pellets in 250 Mikroliter Wartungsmedium pro Tube wieder aufzusetzen.
Nach dem Zählen jede Zellpopulation auf 1,2 mal 10 auf die vier Zellen pro Brunnenkonzentration in frischem Pflegemedium verdünnen. Fügen Sie 90 Mikroliter 50% extrazelluläre Matrix in DMEM-F12 ohne Phenolrot zu jedem Brunnen eines Acht-Well-Kammerschlittens hinzu. Wenn alle Brunnen beschichtet sind, verfestigen Sie die Basisschicht im Zellkultur-Inkubator für 30 Minuten.
Während dieser Polymerisation sammeln Sie die Zellfraktionen durch Zentrifugation und setzen jede Population in 100 Mikrolitern von 10% extrazellulärer Matrix in 90% Wachstumsmedium pro Brunnen wieder aus. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie die Kokulturen für 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator sich nieder. Am Ende der Inkubation, sorgfältig 100 Mikroliter Wachstumsmedium an der Seite jeder Kammerwand hinzufügen und die Rutsche zum Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Bildn ison die Zellen alle 24 Stunden, um ihr Wachstum zu verfolgen und sanft erneuern das Wachstumsmedium alle zwei bis drei Tage. Um die Organoide für die Immunfärbung zu fixieren, zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt, saugen Sie sorgfältig das Medium von jedem Dia abundundes und spülen Sie jeden Brunnen mit 200 Mikroliter DPBS pro Brunnen. Fixieren Sie die Organoide mit 200 Mikrolitern von vier Grad Celsius Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie die Organoide mit 200 Mikrolitern 0,2% Glycin in DPBS pro Brunnen für 30 Minuten bei Raumtemperatur behandeln.
Am Ende der Inkubation permeabilisieren Sie die Organoide mit 0,25%triton X-100 in DPBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von der Blockierung der unspezifischen Bindung mit 5%Eselserum oder dem entsprechenden Serum, das eine Stunde lang mit Schaukeln zu den Arten des sekundären Antikörpers in DPBS passt. Dann beschriften Sie die Zellen mit 125 bis 200 Mikrolitern der entsprechenden primären Antikörper von Interesse in 1%Eselserum in DPBS über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schaukeln. Am nächsten Morgen mindestens zwei Mal mit 200 MikroliterDs plus Triton X-100 gut waschen, bevor die Organoide mit den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörpern 45 Minuten lang bei Raumtemperatur mit lichtgeschütztem Schaukeln markiert werden.
Dann waschen Sie dann jeden Brunnen zweimal mit frischem DPBS plus Triton X-100, wie gezeigt, und bilden Sie die Organoide durch Fluoreszenzmikroskopie nach Standardprotokollen ab. Nach 24 Stunden Inkubation haften gereinigte Epithelfragmente am Boden der Kulturschale und bilden flache Pfannkuchen-ähnliche Strukturen mit einer äußeren Schicht von Myoepithelzellen, die eine innere Schicht von luminalen Epithelzellen umschließen. Die Trypsin-Behandlung löst die Zellen differenziell, wobei sich die Myoepithelzellen zuerst lösen und als helle abgerundete Zellen erscheinen, die den Kern der verbleibenden quaderförmigen Luminalepithelzellen umschließen.
Die Gesamtreinheit der beiden Zellkompartimente beträgt etwa 90%, gemessen an der Keratin-14- und E-Cadherin-Expression innerhalb der beiden Populationen. Nach 10 Tagen Kultur in 10% extrazellulärer Matrix auf einer 50%extrazellulären Matrixbasis, wie gezeigt, bildeten die myoepithelialen Luminalzellorganoide große verzweigte Strukturen mit gut entwickelten Lumen. Die Differenzierung am fünften Tag mit der Zugabe zu alveologenese Medium induziert die Bildung größerer, verzweigter milchhaltiger Organoide.
Es ist wichtig, das Sieb beim Sammeln des Epithels sorgfältig zu waschen, um sicherzustellen, dass es keine stromalen Verunreinigungen gibt. Um die Veränderungen in der Genexpression abzufragen, können Forscher RNA aus den Organoiden sammeln, indem sie sie mithilfe einer Wiederherstellungslösung aus der extrazellulären Matrix freisetzen. Paraformaldehyd gilt als gefährlich und Forscher sollten persönliche Schutzausrüstung verwenden und in einer Dunstabzugshaube arbeiten, wenn sie dieses Reagenz verwenden.
