This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor&#8217;s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.

Das folgende Protokoll wird für die Isolierung von Kardiomyozyten aus einem Wurf von neonatalen Ratten-Jungen (10-14 Jungtiere) ausgelegt. Wenn die Wurfgröße signifikant unterschiedlich, kann das Verfahren müssen so skaliert, zu kompensieren. Die Welpen sollten um 48 ± 6 Stunden alt sein. Alle Verfahren hierin sind von der North Carolina State University Institutional Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) genehmigt worden. 1. Zell Isolierung Vorbereitung HINWEIS: Führen Sie folgende Schritte am Tag vor Isolation. <ol><li> Autoklavieren Sie die folgenden: große Schere, eine kleine Schere, kleinen scharfen Zangen, große Zange. Verwenden einer Fließzyklus für 60 min bei einem Minimum von 121 ° C und einer Trocknungszeit von 30 min. </li><li> Die 40 ml 0,1% Trypsin-Lösung im Kühlschrank auftauen O / N. Kühlen Sie Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) falls noch nicht kalt. Bereiten Sie eine 20% fötalem Rinderserum (FBS) stock Media-Lösung. <ol><li> In 400 ml IscOve modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) werden 100 ml FBS, 5 ml L-Glutamin (200 mM), 2,5 ml Gentamicin (10 mg ml -1) und 0,9 ml 2-Mercaptoethanol. Sterilisieren mit Vakuumfilter. Speichern von Medien bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen und dies ist für kleinere oder größere Volumina skalierbar. Verdünnen Sie 20% FBS Lager Medien 1: 1 mit IMDM zu 10% FBS NRCM Medien zu produzieren. Nur in kleinen Chargen zu machen wiederholte Aufheizen und Abkühlen der Medien verhindern. </li></ol></li></ol> 2. Zellisolation Tag 1 <ol><li> Führen Sie die folgende Arbeit in einer Kultur Haube, um eine Kontamination der Proben zu verhindern. Für beste Timing starten diese Arbeit am Nachmittag, da gibt es eine O / N Inkubation. </li><li> Bereiten Sie Arbeitsbereich in einem sterilen Kultur Kapuze. Zeigen Bank Pad in Kultur Kapuze. Füllen zwei 250 ml-Becher mit 70% Ethanol und platzieren chirurgische Werkzeuge in ihnen. Legen Sie kleine Eimer Eis in Kapuze. Stellen Sie sicher, dass es groß genug, um mehrere Rohre und ein 150-mm-Schale zu halten ist. UV entkeimen die Haube for 10 min. Die 40 ml 0,1% Trypsin auf Eis. </li><li> Abrufen neonatalen Rattenjungen von der Mutter. Um die Tiere bis zur Verwendung warm zu halten, legen Sie sie in einem isolierten Behälter wie einem Eiskübel in einer Bank-Pad, um sie warm eingewickelt. </li><li> Füllen Sie eine 150 mm Kulturschale mit 25 ml HBSS und setzen auf Eis. Packen Sie 2-3 Gaze-Pads und Platz im Arbeitsbereich. Halten Welpe von der Haut auf der Rückseite des Halses, sprühen Sie es mit 70% Ethanol und in Kapuze. HINWEIS: Um beste halten Sterilität, dies kann durch eine andere Person, dann legt das gereinigt Welpen in der Haube erfolgen. </li><li> Halten den Welpen von der Haut auf der Rückseite des Halses. Dann mit den großen Scheren, in einem schnellen, starken Schnitt durch Enthauptung einschläfern. Tupfen Sie das Blut mit Gaze. HINWEIS: Aufgrund der eher Abweichungen in IACUC Anforderungen kann es sinnvoller sein, den Welpen mit einem Ethanol reinigen wischen als Besprühen. Achten Sie darauf, mit der Universität IACUC auf ihre Leitlinien für diesen Schritt zu überprüfen. </li><li> Weiter Senkung vorderen Seite chdurch den Brustkorb est. Drücken Sie die Haut am Hals, um den Brustkorb zu öffnen, bis das Herz ist sichtbar. Mit den kleinen Schere, entfernen Sie das Herz und in den HBSS Kulturschale auf Eis. Wiederholen Sie für die anderen Welpen. </li><li> Entfernen Sie alle nicht-Herzgewebe aus den Proben und schwenken Sie die HBSS sanft um das Herz zu waschen. Übertragen Sie das Herzgewebe zu einem anderen Kulturschale mit frischem HBSS und das Gewebe weiter zu waschen. Schneiden Sie das Gewebe weiter, bis die Stücke 1-3 mm 3, und dann auf die Trypsin-Lösung übertragen. Zeigen Trypsinlösung auf Wippe in 4 ° C Kühlschrank O / N. </li></ol> Zellisolation Tag 2 HINWEIS: Während Ansaugen in den folgenden Schritten, mit einer Pipette, anstatt eine Unterdruckleitung. Das Gewebe bewegt sich leicht, und eine Vakuumleitung verstopfen oder zu entfernen Gewebe noch die Zellen enthält. Es empfiehlt sich, eine Pipette zum Ansaugen zu verwenden. Wenn Gewebe in die Pipette, Pipetten wieder heraus, um sie zu entfernen. <ol><li> Stellen trei Teilmengen von 10% NRCM Medien: eine mit 25 ml und zwei mit 15 ml. Setzen Sie einen 25-ml-Tube von Medien im 37 ° C Wasserbad. 4 ml HBSS zu 5 verschiedene 15 ml konische Röhrchen und setzen alles auf Eis. Beschriften Sie jedes 15-ml-Tube # 1-5. </li><li> Man fügt 40 ml HBSS in ein 50 ml konischen Röhrchen. 10 ml HBSS, um Kollagenase, Pipette zu unterbrechen, und kombinieren Sie die Lösungen für 50 ml von 1 mg ml-1 Kollagenase-Lösung zu erstellen. Sterilisieren mit 0,22 um Vakuumfilter, und speichern Sie bei RT. </li><li> Abrufen Herzgewebe / Trypsin Rohr. Stellen Sie sicher, dass Trypsin ist klar, und das Gewebe wird locker. Lassen Sie das Gewebe auf Ecke Rohr und saugen so viel Flüssigkeit wie möglich zu regeln. </li><li> 25 ml warmem 10% FBS NRCM Medien auf das Rohr und Wirbel mit der Hand. Cap und drehen in 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten. Flüssigkeitsaufnahme wieder. Das Gewebe sollte bei diesem Schritt zu schweben; wenn ja, Aspirat vom Boden des Röhrchens. </li><li> 10 ml Kollagenase. Drehen im Wasserbad für 2 Minuten oder bis die Lösung trüb. Quickly saugen die Flüssigkeit. 10 ml frisches Kollagenase zu Rohr das Gewebe enthält, und drehen Sie im Wasserbad für 2 Minuten. Pipette zu mischen, Transfer Lösung Rohr # 1, und setzen auf Eis. Es kann nicht möglich sein, die gesamte Flüssigkeit zu entfernen. Die Schritte 3,2-3,6 für die anderen drei 15 ml konischen Röhrchen. Die zurückbleibende Flüssigkeit zu Rohr # 5. </li><li> Zentrifuge 15-ml-Röhrchen bei 410 rcf für 8 min. Während der Zentrifugation, legen 15 ml 10% FBS NRCM Medienrohr im Wasserbad. Die 40 &amp; mgr; m Zellsieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen und nass mit 2 ml kaltem HBSS. </li><li> Absaugen Überstand von Zellen zentrifugiert. 6 ml kaltem HBSS zu jedem Röhrchen und resuspendieren. Pipette Zellsuspensionen durch das Sieb in 50 ml konischen, jede Gewebe zu entfernen. Spülen Seiten jedes 15-ml-Röhrchen mit 3 ml kaltem HBSS und in den Sieb. Zentrifugenzellen bei 410 RCF für 10 min. Überstand entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 10 ml 10% FBS NRCM Medien und Übertragung auf T-75-Kolben. Spülen konisch mit 5 ml Medium und in den flwie k. </li><li> Inkubieren für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. Zeigen letzten 15 ml 10% FBS NRCM Medienrohr in Wasserbad. Übertragen Sie Inhalte der T-75 auf ein neues T-175-Kolben gründlich T-75 mit 15 ml Medien und in den T-175. Inkubation für 1 Std. </li></ol> 4. Kryokonservierung <ol><li> Zeigen gefrierenden Medien auf Eis. Übertragen Zellmedien von T-175 von 50 ml konischen Röhrchen und sammelt 10 ul Zellsuspension zur Zellzählung unter Verwendung von Trypan Blau. Zentrifuge bei 410 rcf für 5 min. Während der Zentrifugation zählen Zellen mit einem Zellzähler. </li><li> Aspirat Kulturmedien und Zellen in Gefriermedium in einer Konzentration von 2-4 Millionen Zellen pro ml. Zeigen 1 ml Zellsuspension in kryogene Fläschchen, dann Ort Fläschchen eine kontrollierte Abkühlgeschwindigkeit Einfriergeräte, und in -80 ° C Gefrierschrank O / N. Innerhalb von 1-2 Tagen, Transfer Ampullen in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 5. Auftauen Cells <ol><li> Coat Gericht in Fibronektin durch Auflösen von 250 ul60; von Fibronektin (Stammkonzentration 1 mg ml -1) in 9,75 ml Wasser (Endkonzentration 0,025 mg ml -1). Fügen Sie genug Lösung für Kulturplatte abdecken und bei 37 ° C für mindestens 30 min. <ol><li> In vier 15 ml konische Röhrchen, nehmen Sie die DMSO / Medien-Gemischen als durch Zugabe von DMSO zu 20% Medien folgt. Hinzufügen (5%) 9,5 ml Medium mit 500 &amp; mgr; l DMSO. Hinzufügen (2,5%) 9,75 ml Medium mit 250 &amp; mgr; l DMSO. 10 ml Medium (machen zwei von ihnen). </li></ol></li><li> Erhitzen Sie die genannten Medien Mischungen in 37 ° C warmes Wasserbad. Entfernen Zellen aus flüssigem Stickstoff und setzen auf Trockeneis. Wenn Medien Mischungen sind warm, tauen Zellen in 37 ° C warmes Wasserbad bis kurz aufgetaut. Lassen Sie keine Zellen im Wasserbad zu lange, da dies zu Schäden an den Zellen verursachen. </li><li> Übertragen Sie Inhalte kryogene Fläschchen zu 5% DMSO / Medienrohr. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Überstand entfernen lassen Zellpellet. Hinzufügen Inhalt von 2,5% DMSO / Medienrohr zu Pellets und r Zelleesuspend. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Überstand entfernen lassen Zellpellet. </li><li> Inhalt einer 0% DMSO / Medienrohr In den Pellet resuspendieren Zell. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Überstand entfernen lassen Zellpellet. </li><li> Inhalt der zweiten 0% DMSO / media In den Zellpellet resuspendieren. Nehmen Sie kleine Probe für die Zellzählung. Zentrifuge bei 410 rcf für 8 min. Während der Zentrifugation Zahl Zellen in einem Hämocytometer mit Trypanblau toten Zellen zu kennzeichnen. Nehmen Zellmenge sowie Rentabilität. </li><li> Überstand entfernen lassen Zellpellet. Resuspendieren in 10% NRCM Medien (optional: mit 100 &amp; mgr; M Bromdesoxyuridin (BrdU)) und Platte Zellen auf Fibronektin-beschichtete Platten. </li></ol> 6. Zellkultur <ol><li> Platten Zellen bei ungefähr 100K Zellen pro cm 2. Stellen Sie die Beschichtung Dichte basierend auf der beabsichtigten Verwendung der Kultur. Bereiten Sie 2% NRCM Medien durch Verdünnen von 20% Medien in IMDM im Verhältnis 1:10. Hier finden Sie eine Übersicht über eine typische Kultur. &lt;/ Li&gt; <li> Am Tag 1, spülen toten Zellen weg mit warmem IMDM, fügen Sie 10% NRCM (optional 100 uM BrdU). Am 2. Tag gründlich abgestorbene Zellen entfernt mit warmem IMDM, fügen Sie 10% NRCM. Tag 3-add 2% NRCM. Am Tag 4 mit 2% NRCM. Am Tag 5 zu gewährleisten, dass die Zellen konfluent und Ausklopfen wird. Pflegen Zellen in Kultur für etwa eine Woche. An diesem Punkt kann Fibroblasten beginnen, die NRCMS deutlich entwachsen. </li></ol>

<ol>
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M., Berenfeld, O., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotonic+myofibroblast-to-myocyte+coupling+increases+propensity+to+reentrant+arrhythmias+in+two-dimensional+cardiac+monolayers.">Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers.</a> Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).</li><li>Chang, M. G., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+waves+and+reentry+dynamics+in+an+in+vitro+model+of+the+healed+infarct+border+zone.">Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone.</a> Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll ermöglicht die NRCMS isoliert werden, kryokonservierten und aufgetaut. Auftauen der Zellen ist ein wesentlicher Teil des Verfahrens. Eine Reihe von Verdünnungen DMSO verwendet wird, um DMSO langsam zu entfernen von den Zellen 14. Es ist wichtig, dass die Gewinnung von DMSO schnell durchgeführt werden, da die Zellen besonders empfindlich gegenüber unmittelbar sterben nach dem Auftauen sind. Wenn mehr oder weniger Zellen werden zum Auftauen erforderlich ist, kann das Volumen der DMSO-Lösun...

Zellkultur von Herzmuskelzellen ist ein wichtiges Werkzeug in der modernen Herzforschung. Neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCMS) sind häufig, da die Isolierung verwendet und Kultur ist einfacher als die von Erwachsenen Rattenkardiomyozyten 1. Die NRCM Verfahren hat noch einige Beschränkungen einschließlich langer Isolationsverfahren und begrenzte Zellproliferation in der Schale. Es gibt zahlreiche Protokolle für die Isolierung von NRCMS meisten allgemeinen erfordern 4-48 hr Arbeits 2-6. Darüber hinaus werden die Zellen häufig 1 getrennt zu 2 Tage alten Rattenjungen 2,4-7; der Zeitpunkt der Geburt kann unberechenbar und Konflikte mit anderen Arbeit im Labor sein. Die Isolierungen kann ineffizient und verschwenderisch sein, wenn nur eine kleine Menge von Zellen für Experimente benötigt. Die meisten Anstrengungen auf die Verbesserung des Workflows konzentrieren sich auf die Verminderung der Isolation der Zeit, aber dies nicht die Probleme der Zeitmessung der Geburt der Jungtiere zu lösen. Als Alternativen vielen Labors nutzenKardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen (ESC) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet. Jedoch kann die Umprogrammierung und / oder Differenzierungsprozess sehr zeitaufwendig und teuer sowie sein. Es können auch andere Probleme bei der Verwendung dieser Zellen in vitro myocyte Modelle. Beide ESC- und iPSC- abgeleitete Kardiomyozyten wurde gezeigt, dass Unterschiede in der Elektrophysiologie von primären Cardiomyocyten 8-10 aufweisen. Dissoziierte NRCMS sind in der Lage, die für mehrere Tage mit Kälte 11 gespeichert, aber das bedeutet für die Langzeitlagerung zu ermöglichen. Flüssiger Stickstoff wird typischerweise verwendet, um Zellen für einen größeren Zeitraum zu erhalten, sondern erfordert ein Kryoschutzmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO). Zurück Forschung hat gezeigt, dass die ideale Konzentration zwischen 5-10% DMSO in gefrierenden Medien ermöglicht die Kryokonservierung von NRCMS, doch selbst dann ist die Überlebensfähigkeit nach wie vor gering 12. Obwohl DMSO hilft den Zellen zu schützen während der freienZing, kann giftig in Konzentrationen über 1,5% 13 sein, um Zellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich langsam entfernen DMSO aus den Zellen kann die Lebensfähigkeit der Zellen 14 zu verbessern. Wir haben versucht, die Effizienz des NRCM zellbasierten Assays durch Kryokonservierung der Zellen nach der Isolierung zu verbessern. Dies ermöglicht es, die Zellen aufgetaut und bei Bedarf verwendet werden, was die Häufigkeit der Isolationen und den Verbrauch von Tieren werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigen wir, dass es möglich ist, NRCMS Kryokonservierung und Auftauen sie für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt. Nach dem Auftauen der Zellen zu erhalten eine akzeptable Rentabilität und produzieren NRCM Kulturen, die positiv für α-sarkomerischen Actinin (α-SA) und Vertrags spontan sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td>With added 25mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (+Ca +Mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td>With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS5</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>205102</td>
			<td>Freezing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1889-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing Vacuum Filter (0.22&#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Conical</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ&#160;SLIDES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PEZGS0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-sarcomeric actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-7581KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cryopreservation of neonatal rat cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

Nach der Isolierung der neonatalen Rattenherzmuskelzellen werden die Zellen bis zu flüssigem Stickstoff eingefroren und für mindestens mehrere Monate gelagert werden. Typischerweise nach dem Auftauen wird die durch Trypanblau-Analyse bestimmt Lebensfähigkeit zwischen 40-60% liegen. Obwohl diese niedriger als bei anderen Zelltypen, mit der richtigen Säen und Kultur werden die Zellen proliferieren (Abbildung 1). Um Kontraktilität zu überprüfen, können die Zellen unter Verwendung eines Phasenkontra...

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Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K Aufrufe.  College of Veterinary Medicine, North Carolina State University. The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.