This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor&#8217;s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.

Il seguente protocollo è stato progettato per l&#39;isolamento di cardiomiociti da una cucciolata di cuccioli di ratto neonatale (10-14 PUP). Se la dimensione cucciolata è significativamente diverso, la procedura può avere per essere scalata a compensare. I cuccioli devono essere di circa 48 ± 6 ore fa. Tutte le procedure qui sono stati approvati dalla North Carolina State University Istituzionale cura degli animali e Comitato Usage (IACUC). 1. cella di isolamento Preparazione NOTA: Effettuare le seguenti operazioni il giorno prima di isolamento. <ol><li> Autoclave le seguenti: grandi forbici, forbicine, piccole pinze taglienti, grandi pinze. Utilizzare un ciclo di gravità per 60 min a un minimo di 121 ° C e un tempo di essiccazione di 30 min. </li><li> Mettere 40 ml di soluzione di tripsina 0,1% in frigo a scongelare O / N. Mettete in frigorifero di Hank Sali Balanced Solution (HBSS) se non già freddo. Preparare un siero bovino fetale (FBS) soluzione madre dei media al 20%. <ol><li> In 400 ml di Iscsupporti Modified Dulbecco del ove (IMDM) aggiungere 100 ml di FBS, 5 ml di L-glutammina (200 mm), 2,5 ml di gentamicina (10 mg ml -1), e 0,9 ml di 2-mercaptoetanolo. Sterilizzare con filtro a vuoto. Conservare i supporti a 4 ° C per un massimo di 3 settimane e questo è scalabile per volumi più piccoli o più grandi. Diluire il 20% FBS magazzino supporti 1: 1 con IMDM per produrre il 10% FBS NRCM media. Fare solo in piccoli lotti per evitare il riscaldamento ripetute e raffreddamento dei media. </li></ol></li></ol> 2. cella di isolamento Day 1 <ol><li> Eseguire i seguenti lavori in una cappa di coltura per evitare la contaminazione dei campioni. Per una migliore tempistica iniziare questo lavoro nel pomeriggio poiché non vi è un O / N di incubazione. </li><li> Preparare lavoro all&#39;interno di una cappa di coltura sterile. Mettere panchina pad in cappa di coltura. Riempire due 250 ml bicchieri con il 70% di etanolo e inserire gli strumenti chirurgici in loro. Mettere piccolo secchio di ghiaccio nella cappa. Assicurarsi che sia abbastanza grande da contenere diversi tubi e un piatto di 150 mm. UV sterilizzare il cofano for 10 min. Porre 40 ml 0,1% tripsina su ghiaccio. </li><li> Recupera ratti neonatali dalla madre. Per mantenere gli animali al caldo fino al momento dell&#39;uso, mettetele in un contenitore isolato come un secchio di ghiaccio avvolto in un pad panchina per tenerli al caldo. </li><li> Riempire un piatto di coltura di 150 mm con 25 ml di HBSS e disporli sul ghiaccio. Separa 2-3 garze e in luogo di lavoro. Tenendo pup dalla pelle sulla parte posteriore del collo, spruzzare con 70% etanolo e posto in cappuccio. NOTA: Per mantenere meglio la sterilità, questo si può essere fatto da un&#39;altra persona che poi mette il cucciolo pulito nella cappa. </li><li> Mantenere il cucciolo dalla pelle sul retro del collo. Quindi con i grandi forbici, in una rapida, forte taglio eutanasia per decapitazione. Asciugare il sangue con una garza. NOTA: A causa di variazioni nei requisiti IACUC, potrebbe essere più appropriato per pulire il cucciolo con un etanolo pulire anziché spruzzo. Assicuratevi di controllare con l&#39;università IACUC da loro linee guida per questo passo. </li><li> Continuare a tagliare verso il basso lato anteriore chest attraverso la gabbia toracica. Stringere la pelle del collo per aiutare ad aprire la gabbia toracica fino a quando il cuore è visibile. Utilizzando le piccole forbici, rimuovere il cuore e il luogo nel piatto cultura HBSS sul ghiaccio. Ripetere l&#39;operazione per gli altri cuccioli. </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto non-cardiaco dai campioni e agitare la HBSS delicatamente per lavare i cuori. Trasferire il tessuto cardiaco di un altro piatto di coltura contenente fresco HBSS e lavare ulteriormente il tessuto. Tagliare il tessuto ulteriormente fino a quando i pezzi sono 1-3 mm 3, e poi trasferire alla soluzione tripsina. Mettere soluzione tripsina il rocker a 4 ° C frigorifero O / N. </li></ol> Isolamento cellulare Day 2 NOTA: Mentre aspirazione nei seguenti passaggi, utilizzare una pipetta piuttosto che una linea del vuoto. Il tessuto si muove facilmente, e una linea di vuoto intasare o rimuovere il tessuto ancora contenente cellule. E &#39;meglio utilizzare una pipetta per l&#39;aspirazione, invece. Se il tessuto entra nella pipetta, pipetta indietro per rimuoverlo. <ol><li> Fai taliquote hree 10% NRCM media: uno con 25 ml e due con 15 ml. Posizionare un tubo 25 ml di media in 37 ° C bagnomaria. Aggiungere 4 ml HBSS a 5 tubi conici diversi da 15 ml e mettere tutti sul ghiaccio. Etichettare ogni 15 ml provetta # 1-5. </li><li> Aggiungere 40 ml HBSS ad una provetta conica da 50 ml. Aggiungere 10 ml di HBSS per collagenasi, pipetta di sospendere, e combinano le soluzioni per creare 50 ml di 1 mg ml -1 soluzione collagenasi. Sterilizzare con 0,22 micron filtro a vuoto, e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Recupera cuore tubo tessuto / tripsina. Assicurarsi che la tripsina è chiara, e il tessuto appare soffice. Lasciare che il tessuto a stabilirsi a angolo di tubo e aspirare quanto più liquido possibile. </li><li> Aggiungere 25 ml calda 10% FBS NRCM supporto al tubo e agitare a mano. Cap e ruotare in 37 ° C bagnomaria per 2 min. Aspirare il liquido di nuovo. Il tessuto deve galleggiare in questa fase; in caso affermativo, aspirare dal fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 10 ml di collagenasi. Ruotare in bagno d&#39;acqua per 2 minuti o fino a quando la soluzione è torbida. Quickly aspirare il liquido. Aggiungere 10 ml di collagenasi fresco al tubo contenente il tessuto e ruotare in bagnomaria per 2 min. Pipetta a mescolare, soluzione di trasferimento a tubo # 1, e posto sul ghiaccio. Può non essere possibile rimuovere tutto il liquido. Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per gli altri tre tubi da 15 ml coniche. Trasferire il liquido in eccesso al tubo # 5. </li><li> Centrifugare 15 ml provette a 410 rcf per 8 minuti. Mentre centrifugazione, posizionare 15 ml 10% FBS NRCM tubo supporti a bagnomaria. Inserire 40 micron filtro cella sulla cima di una provetta conica da 50 ml e bagnato con 2 ml HBSS freddo. </li><li> Aspirare il surnatante dalle cellule filate in giù. Aggiungere 6 ml HBSS freddo ad ogni provetta e risospendere. Sospensioni cellulari pipetta attraverso il filtro in 50 ml conica per rimuovere qualsiasi tessuto. Sciacquare i lati di ciascun tubo 15 ml con 3 ml HBSS freddo e aggiungere al filtro. Cellule centrifugare a 410 rcf per 10 min. Aspirare il surnatante. Risospendere pellet cellulare in 10 ml 10% dei media FBS NRCM e trasferimento a T-75 pallone. Sciacquare conica con i media 5ml e aggiungere al flchiedere. </li><li> Incubare per 1 ora a 37 ° C e 5% CO 2. Posizionare lo scorso 15 ml 10% FBS NRCM tubo supporti in bagno d&#39;acqua. Trasferire contenuto di T-75 in un pallone a T-175, T-75 lavare con 15 ml media e aggiungere al T-175. Incubare per 1 ora. </li></ol> 4. Crioconservazione <ol><li> Mettere congelamento media su ghiaccio. Media Transfer cellulare da T-175 a 50 ml tubo conico, e raccogliere 10 ml di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule con Trypan blu. Centrifugare a 410 rcf per 5 min. Mentre centrifugazione, contare le cellule con un contatore di cellule. </li><li> Aspirare i media cultura, e risospendere le cellule in congelamento dei media ad una concentrazione di 2-4 milioni di cellule per ml. Inserite 1 ml di sospensione cellulare in flacone criogenico, quindi posto fiale velocità controllata di raffreddamento congelamento container, e il luogo in -80 ° C freezer O / N. Entro 1-2 giorni, trasferire fiale in azoto liquido. </li></ol> 5. Le cellule scongelamento <ol><li> Piatto Coat in fibronectina sciogliendo 250 microlitri60, di fibronectina (concentrazione magazzino 1 mg ml -1) in 9,75 ml di acqua (concentrazione finale 0,025 mg ml -1). Aggiungere la soluzione sufficiente a coprire piastra di coltura e incubare a 37 ° C per almeno 30 minuti. <ol><li> In quattro 15 ml conici, fare le miscele DMSO / multimediali come segue aggiungendo DMSO al 20% di media. Aggiungi (5%) di 9,5 ml media con 500 microlitri DMSO. Aggiungi (2,5%) 9.75 ml media con 250 microlitri DMSO. Aggiungere 10 ml multimediale (fare due di questi). </li></ol></li><li> Riscaldare le miscele di media di cui sopra a 37 ° C bagnomaria. Rimuovere le cellule da azoto liquido e mettere in ghiaccio secco. Quando le miscele dei media sono calde, scongelare le cellule in 37 ° C bagnomaria fino a poco scongelati. Non lasciare le celle a bagnomaria per troppo tempo in quanto ciò potrebbe causare danni alle cellule. </li><li> Trasferire contenuto del flacone criogenico al 5% tubo DMSO / media. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Aspirare il surnatante lasciando pellet. Aggiungi contenuto del 2,5% tubo DMSO / media per cella pellet e resuspend. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Aspirare il surnatante lasciando pellet. </li><li> Aggiungere il contenuto di una 0% tubo DMSO / media alla cella pellet e risospendere. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Aspirare il surnatante lasciando pellet. </li><li> Aggiungi contenuto del secondo 0% DMSO / media a pellet e risospendere. Prendete piccolo campione per il conteggio delle cellule. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Mentre centrifugazione cellule di conteggio in una emocitometro utilizzando Trypan Blue per etichettare le cellule morte. Quantità delle cellule Record, nonché redditività. </li><li> Aspirare il surnatante lasciando pellet. Risospendere in 10% NRCM supporti (optional: aggiungere 100 micron bromodeossiuridina (BrdU)) e le cellule piastra su piatti fibronectina rivestite. </li></ol> Cultura 6. cellulare <ol><li> Cellule piastra a circa 100k cellule per cm 2. Regolare la densità di placcatura basata sull&#39;uso previsto della cultura. Preparare 2% NRCM supporti diluendo il 20% di media in IMDM in un rapporto di 1:10. Di seguito una descrizione di una cultura tipica. &lt;/ Li&gt; <li> Il giorno 1, lavare le cellule morte via con IMDM caldo, aggiungere il 10% NRCM (optional 100 micron BrdU). Il giorno 2, lavare via le cellule morte con IMDM caldo, aggiungere il 10% NRCM. Giorno 3-aggiungere 2% NRCM. Il giorno 4 aggiungere 2% NRCM. Il giorno 5 in modo che le cellule sono confluenti e percosse. Mantenere le cellule in coltura per circa una settimana. A quel punto i fibroblasti possono iniziare a superare in modo significativo i NRCMs. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblasts+Induce+Ectopic+Activity+in+Cardiac+Tissue.">Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue.</a> Circulation Research. 101, 755-758 (2007).</li><li>Simpson, P., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+myocytes+in+single+cell+cultures+with+and+without+proliferating+nonmyocardial+cells.+Cross-striations,+ultrastructure,+and+chronotropic+response+to+isoproterenol.">Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol.</a> Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).</li><li>Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines.">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li><li>Rohr, S., Fl&#252;ckiger-Labrada, R., Kucera, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographically+defined+deposition+of+attachment+factors+as+a+versatile+method+for+patterning+the+growth+of+different+cell+types+in+culture.">Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture.</a> Pfl&#252;gers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).</li><li>Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+enrichment+of+functional+cardiomyocytes+using+microfluidic+deterministic+lateral+flow+displacement.">Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement.</a> PloS One. 7 (5), e37619 (2012).</li><li>Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+cardiac+myocyte+cultures+by+surface+microtopography.">Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).</li><li>Fu, J. -. D., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+developmental+regulation+of+Ca2++transients+and+contraction+in+cardiomyocytes+derived+from+embryonic+stem+cells.">Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).</li><li>Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Functional+sarcoplasmic+reticulum+for+calcium+handling+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+insights+for+driven+maturation.">a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation.</a> Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li><li>Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+temperature+range+for+low-temperature+preservation+of+dissociated+neonatal+rat+cardiomyocytes.">Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes.</a> Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).</li><li>Miyamura, K., Nagayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viability+of+cryopreserved+rat+cardiac+myocytes+and+effects+of+dimethyl+sulfoxide+concentration+on+cryopreservation.">Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation.</a> Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).</li><li>Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+bioenergetics+and+utilization+in+safety+screening.">Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening.</a> Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).</li><li>Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+conditions+for+heart+cell+cryopreservation+for+transplantation.">Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).</li><li>Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines.">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li><li>Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=array+analysis+of+cell+cycle+protein+changes+during+the+hyperplastic+to+hypertrophic+transition+in+heart+development.">array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).</li><li>Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> , 205-214 (2012).</li><li>Zlochiver, S., Mu&#241;oz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotonic+myofibroblast-to-myocyte+coupling+increases+propensity+to+reentrant+arrhythmias+in+two-dimensional+cardiac+monolayers.">Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers.</a> Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).</li><li>Chang, M. G., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+waves+and+reentry+dynamics+in+an+in+vitro+model+of+the+healed+infarct+border+zone.">Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone.</a> Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo permette ai NRCMs di essere isolati, crioconservati e scongelati. Scongelamento delle cellule è una parte essenziale del procedimento. Una serie di diluizioni DMSO viene utilizzato per rimuovere lentamente DMSO dalle cellule 14. È importante che l&#39;estrazione di DMSO essere eseguita rapidamente le cellule sono particolarmente sensibili a morire immediatamente dopo lo scongelamento. Se sono richieste celle più o meno per scongelamento, i volumi delle soluzioni DMSO possono essere scalat...

Coltura cellulare di cardiomiociti è uno strumento fondamentale per la ricerca cardiaca moderna. Cardiomiociti di ratto neonatale (NRCMs) sono comunemente usati poiché l&#39;isolamento e la cultura è più facile di quello di cardiomiociti di ratto adulto 1. Il metodo NRCM ha ancora diverse limitazioni, tra cui una lunga procedura di isolamento e la proliferazione cellulare limitata nel piatto. Ci sono numerosi protocolli per l&#39;isolamento di NRCMs con più generalmente richiedono 4-48 ore di lavoro 2-6. Inoltre, le cellule sono spesso isolate da 1 a 2 giorni cuccioli di ratto vecchio 2,4-7; i tempi della nascita può essere imprevedibile e in conflitto con altri lavori in laboratorio. I isolamenti possono essere inefficiente e dispendioso se solo una piccola quantità di cellule sono necessari per gli esperimenti. La maggior parte degli sforzi per migliorare l&#39;attenzione sul flusso di lavoro riducendo il tempo di isolamento, ma questo non risolve il problema della temporizzazione della nascita dei cuccioli. Come alternativa, molti laboratori utilizzanocardiomiociti derivati ​​da cellule staminali embrionali (ESC) o di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). Tuttavia, il processo di riprogrammazione e / o differenziazione può essere molto lungo e costoso pure. Ci possono essere altri problemi quando si utilizzano queste cellule come modelli miociti in vitro. Sia ESC- e iPSC- cardiomiociti derivati ​​hanno dimostrato di esporre le differenze di elettrofisiologia di cardiomiociti primari 8-10. NRCMs dissociati sono in grado di essere conservato per diversi giorni con refrigerazione 11, ma questo non consente per la conservazione a lungo termine. L&#39;azoto liquido è tipicamente usato per conservare le cellule per un maggiore periodo di tempo, ma richiede un crioprotettore come dimetil solfossido (DMSO). Precedenti ricerche hanno dimostrato che la concentrazione ideale tra il 5-10% DMSO nei media congelamento consente per la crioconservazione di NRCMs, ma anche allora la redditività rimane bassa 12. Sebbene DMSO aiuta a proteggere le cellule durante gratiszing, può essere tossico per le cellule a concentrazioni superiori a 1,5% 13. Studi precedenti hanno dimostrato che la rimozione lentamente DMSO dalle cellule, può migliorare la vitalità cellulare 14. Abbiamo cercato di migliorare l&#39;efficienza dei saggi cellulari NRCM dai cryopreserving cellule dopo l&#39;isolamento. Questo permette alle cellule di essere scongelati e utilizzati quando necessario, riducendo la frequenza di isolamenti e consumo di animali. Usando questo metodo, si dimostra che è possibile cryopreserve NRCMs e scongelare per uso in un secondo momento. Dopo lo scongelamento le cellule mantengono una redditività accettabile e producono culture NRCM che sono positivi per la α-sarcomerica actinina (α-SA) e del contratto spontaneamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td>With added 25mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (+Ca +Mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td>With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS5</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>205102</td>
			<td>Freezing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1889-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing Vacuum Filter (0.22&#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Conical</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ&#160;SLIDES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PEZGS0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-sarcomeric actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-7581KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cryopreservation of neonatal rat cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

Dopo l&#39;isolamento dei cardiomiociti neonatali di ratto, le cellule vengono congelate fino azoto liquido, e possono essere conservati per almeno diversi mesi. Tipicamente allo scongelamento, la vitalità determinata mediante analisi Trypan Blue sarà tra 40-60%. Anche se questo è inferiore rispetto ad altri tipi di cellule, con una corretta semina e coltura le cellule proliferano (Figura 1). Per verificare contrattilità, le cellule possono essere esposte utilizzando un microscopio a contrasto di fa...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Isolamento e Crioconservazione di neonatali Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

isolation-and-cryopreservation-of-neonatal-rat-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K Views.  College of Veterinary Medicine, North Carolina State University. The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.