This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor&#8217;s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.

다음 프로토콜은 신생아 쥐 새끼 (10-14 새끼)의 한 쓰레기에서 심근 세포의 분리를 위해 설계되었습니다. 쓰레기의 크기가 현저하게 다른 경우, 절차는 보상을 확장 할 필요가있다. 새끼는 약 48 ± 6 시간 이전이어야한다. 모든 절차가 여기에 노스 캐롤라이나 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1. 세포 격리 준비 참고 : 분리하기 전에 다음 단계 일을 수행합니다. <ol><li> 큰 가위, 작은 가위, 작은 날카로운 집게, 큰 집게 다음을 압력솥. 121 ° C의 최소 30 분의 건조 시간을 60 분 동안 중력 사이클을 사용한다. </li><li> / N을 O를 해동 냉장고에 0.1 % 트립신 용액 40ml를 놓습니다. 냉장 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 이미 감기 아니라면. 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 스톡 미디어 솔루션을 준비. <ol><li> 단락 전류의 400 mL에비켜의 수정 된 둘 베코의 미디어 (IMDM)는 100 ML의 FBS 5 ML의 L 글루타민 (200 mM)을 2.5 ml의 겐타 마이신 (10 ㎎ ml의 1), 0.9 ml의 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. 진공 필터를 이용하여 멸균. 저장 최대 3 주 동안 4 ℃에서 미디어와이 작거나 큰 볼륨의 확장이다. 10 % FBS NRCM 미디어를 생산하는 IMDM와 1 : 20 % FBS 스톡 미디어 1을 희석. 만 반복 가열 및 미디어의 냉각을 방지하기 위해 작은 일괄 적으로 확인합니다. </li></ol></li></ol> 2. 세포 분리 1 일 <ol><li> 시료의 오염을 방지하기 위해 배양 후드에서 다음 작업을 수행한다. O / N 배양이 있기 때문에 최적의 타이밍의 경우 오후에이 일을 시작합니다. </li><li> 멸균 문화 후드 내부 작업 공간을 준비합니다. 문화 후드에서 벤치 패드를 놓습니다. 70 % 에탄올로 두 250ml의 비커를 입력하고 그들에 수술 도구를 배치합니다. 후드에서 얼음의 작은 양동이를 놓습니다. 그것은 여러 튜브와 150mm 접시를 개최 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. FO 후드를 살균 UVR 10 분. 얼음에 40 ml의 0.1 % 트립신을 놓습니다. </li><li> 어머니로부터 신생아 쥐 새끼를 검색합니다. 사용할 때까지 따뜻한 동물을 유지하기 위해, 예를 따뜻하게 유지하는 벤치 패드에 싸서 얼음 양동이로 절연 컨테이너에 배치합니다. </li><li> 25 ml의 HBSS와 150mm 배양 접시를 입력하고 얼음에 배치합니다. 포장을 벗긴 2-3 거즈 패드와 작업 영역에 위치. 목에의 뒷면에 피부가 강아지를 잡고 후드에서 70 % 에탄올과 장소를 스프레이. 주 : 최상의 무균 상태를 유지하려면,이 후 후드 청소 강아지를 배치 다른 사람에 의해 수행 될 수있다. </li><li> 목에의 뒷면에 피부가 강아지를 잡으십시오. 그런 다음 잘린 안락사 한 빠르고 강력한 컷, 큰 가위를 사용하여. 거즈와 혈액을 오 점. 주 : IACUC 요건 분산하기 위해서는 에탄올 강아지 청소 더 적절할 수도 그것으로 인해 분무보다는 와이프. 이 단계에 대한 자신의 가이드 라인과 대학 IACUC 확인해야합니다. </li><li> 채널의 전방 측면을 자르고 계속흉곽을 통해 동부 표준시. 마음이 보일 때까지 흉곽을 열 수 있도록 목에 피부를 짜내. 작은 가위를 사용하여 얼음에 HBSS 배양 접시에 심장과 장소를 제거합니다. 다른 새끼에 대해 반복합니다. </li><li> 샘플에서 비 심장 조직을 제거하고 마음을 씻어 부드럽게 HBSS 소용돌이 친다. 신선한 HBSS 포함하는 다른 배양 접시에 심장 조직을 전송하고 더 조직을 씻는다. 조각 1-3mm 3 때까지 더 조직을 절단 한 후 트립신 용액에 전송할 수 있습니다. 4 ° C 냉장고 O / N에서 로커에 트립신 솔루션을 놓습니다. </li></ol> 세포 분리 2 일 주 : 다음 단계로 흡인하면서, 진공 라인보다는 ​​피펫을 사용한다. 조직은 쉽게 이동시키고, 진공 라인은 막힘 또는 세포를 포함하는 조직을 아직 제거 할 것이다. 대신 포부 피펫을 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다. 조직 피펫을 입력하면, 피펫을 제거 철회. <ol><li> t 확인10 % NRCM 미디어하는 hree 분량 : 15 ml를 25 mL를 하나, 둘. 37 ° C의 물을 욕조에 미디어의 한 25 ML 튜브를 놓습니다. 5 가지 15 ML 원뿔 튜브에 4 ml의 HBSS를 추가하고 얼음에 모두 배치합니다. 각 15 ml의 튜브 # 1-5 레이블. </li><li> 50 ML 원뿔 관에 40 ml의 HBSS를 추가합니다. HBSS 10 ml의 일시 중단, 피펫을 콜라에 추가, 50 ml의 1 mg의 ml의 -1 콜라겐 솔루션을 만드는 솔루션을 결합한다. 0.22 μm의 진공 필터를 사용하여 소독하고, 실온에서 보관하십시오. </li><li> 심장 조직 / 트립신 튜브를 검색합니다. 그 확인 트립신 맑아 조직 무성 나타난다. 조직 튜브와 흡인의 코너에 많은 액체 가능한 정착하도록 허용합니다. </li><li> 손으로 튜브와 소용돌이에 25 ml의 따뜻한 10 % FBS NRCM 미디어를 추가합니다. 캡 및 2 분 동안 37 ° C까지 수조에서 회전한다. 다시 대기음 액체. 조직이 단계에서 부유한다; 그렇다면, 튜브의 바닥에서 흡 인물. </li><li> 10 ml의 콜라겐을 추가합니다. 2 분 동안이나 솔루션이 흐린 때까지 물을 욕조에 돌립니다. 숨어ickly 액체를 대기음. 조직을 포함하는 튜브에 10 ml의에게 신선한 콜라게나 제를 추가하고 2 분 동안 물을 욕조에 회전. 피펫, 튜브 # 1에 전송 솔루션을 혼합하고 얼음에 배치합니다. 그것은 모든 액체를 제거하는 것이 가능하지 않을 수있다. 반복하여 다른 세 15 ML 원뿔 튜브에 대한 3.2-3.6 단계를 반복합니다. 튜브 # 5에 남아있는 액체를 전송합니다. </li><li> 원심 분리기 8 분 410 RCF에서 15 ml의 튜브. 원심 분리하는 동안 물을 욕조에 15 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 관을 배치합니다. 40 μm의 세포 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 스트레이너 2 ml의 차가운 HBSS 젖은 놓습니다. </li><li> 스핀 다운 세포에서 대기음 뜨는. 각각의 튜브에 resuspend 6 ml의 차가운 HBSS를 추가합니다. 50 ML 원뿔에 스트레이너를 통해 피펫 세포 현탁액은 조직을 제거합니다. 3 ㎖ 차가운 HBSS 각 15 ML 튜브의 측면을 씻어 여과기를 추가 할 수 있습니다. 10 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기 세포. 대기음 뜨는. T-75 플라스크에 10 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 및 전송에 재현 탁 세포 펠렛. 5ml의 미디어 원뿔을 씻어 FL에 추가부탁드립니다. </li><li> 37 ° C에서 1 시간, 5 % CO 2 품어. 물을 욕조에 지난 15 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 튜브를 놓습니다. T-75 새로운 T-175 플라스크의 내용을 전송, 15 ml의 매체와 T-75을 씻어 T-175에 추가. 1 시간 동안 품어. </li></ol> 4. 냉동 보존 <ol><li> 얼음에 미디어를 동결 놓습니다. T-175-50 ML 원뿔 튜브에서 세포 미디어를 전송하고, 셀 트리 판 블루를 사용하여 계산에 대한 세포 현탁액의 10 μl를 수집합니다. 5 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 원심 동안 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 1 mL 당 2-4000000 세포의 농도로 미디어를 동결 대기음 배양액과 세포를 재현 탁. 극저온 유리 병에 세포 현탁액 1 ㎖를 꽂은 후, 장소는 -80 ° C 냉동고 O / N의 제어 냉각 컨테이너를 동결 속도, 장소를 유리 병. 1-2일 내에서 액체 질소에 튜브를 전송합니다. </li></ol> 5. 해동 세포 <ol><li> 250 μl를 용해하여 피브로넥틴의 코트 요리60; 9.75 ml의 물 (최종 농도 0.025 mg을 ml의 1)에 피브로넥틴 (재고 농도 1 mg을 ml의 1)의. 배양 플레이트를 커버하고 적어도 30 분 동안 37 O C에서 배양 할 수있는 충분한 솔루션을 추가합니다. <ol><li> 20 % DMSO 매체를 가산함으로써 다음과 같이 네 15ml의 원뿔형 튜브에, DMSO / 미디어의 혼합물을 만든다. 500 μL DMSO로 (5 %) 9.5 ml의 미디어를 추가합니다. 250 μL DMSO로 (2.5 %) 9.75 ml의 미디어를 추가합니다. 10 ml의 미디어를 (이 두을)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 37 ° C 물욕 상기 미디어의 혼합물을 가열한다. 액체 질소에서 세포를 제거하고 드라이 아이스에 배치합니다. 미디어 혼합물 따뜻한 때 바로 해동 될 때까지, 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동. 이 세포에 손상을 줄 수 있으므로 너무 오래 물을 욕조에 세포를 보관하지 마십시오. </li><li> 5 % DMSO / 미디어 관에 극저온 유리 병의 내용을 전송합니다. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. 2.5 % DMSO / 미디어 관의 내용은 펠릿 및 R 셀에 추가esuspend. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. </li><li> 펠릿에 resuspend 셀 하나의 0 % DMSO / 미디어 튜브의 내용을 추가합니다. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. </li><li> 세포 펠렛 및 재현 탁에 두 번째 0 %의 DMSO / 미디어의 내용을 추가합니다. 셀 카운팅을위한 작은 샘플을 가져 가라. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 혈구에서 원심 분리 카운트 세포는 트리 판 블루를 사용하는 동안 죽은 세포 레이블을. 기록 셀 량뿐만 아니라 생존. </li><li> 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. 10 % NRCM 매체에 재현 탁 (옵션 : 100 μM의 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 추가) 피브로넥틴 코팅 요리와 플레이트 세포를. </li></ol> 6. 세포 배양 <ol><li> cm 2 당 약 10 만개 세포에서 플레이트 세포. 문화의 사용 목적에 따라 도금 밀도를 조정합니다. 1:10 비율로 IMDM 20 % 미디어를 희석하여 2 % NRCM 미디어를 준비합니다. 다음은 일반적인 배양의 개요이다. &lt;/ 리&gt; <li> 1 일에, 멀리 따뜻한 IMDM와 죽은 세포를 씻어 10 % NRCM (옵션 100 μM의 BrdU)를 추가합니다. 2 일에, 멀리 따뜻한 IMDM와 죽은 세포를 씻어 10 % NRCM를 추가합니다. 3 일 - 추가 2 % NRCM을. 4 일에 2 % NRCM를 추가합니다. 5 일에 세포가 합류하고 구타되어 있는지 확인하십시오. 약 일주일 동안 문화의 세포를 유지한다. 그 시점에서 섬유 아세포는 크게 NRCMs을 빨리 성장하기 시작할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

NRCMs이, 고립 냉동 보관 및 해동 될 때까지이 프로토콜은 할 수 있습니다. 세포를 해동하여 절차의 중요한 부분이다. DMSO 희석액 시리즈 서서히 세포를 DMSO (14)로부터 제거하기 위해 사용된다. 그것은 DMSO의 추출 해동 세포 사망 직후에 특히 민감 재빨리 수행하는 것이 중요하다. 더 많거나 적은 세포가 해동이 필요한 경우 필요에 따라, DMSO 용액의 볼륨을 확장 할 수 있습니다. <p class="jove...

심근 세포의 세포 배양 현대 심장 연구에 중요한 도구입니다. 신생아 쥐의 심근 세포 (NRCMs)는 일반적으로 분리 이후 사용되며 문화는 성인 쥐의 심근 세포 1보다 쉽다. NRCM 방법은 여전히​​ 접시에 오래 격리 절차 및 제한 세포 증식 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 가장 일반적으로 작업 2-6의 4-48 시간을 필요로와 NRCMs의 분리를위한 다양한 프로토콜이있다. 또한, 세포는 종종 2 일된 래트 새끼 2,4-7를 1에서 분리된다; 출생의 타이밍은 실험실에서 다른 작업과 예측 불가능하고 충돌 할 수 있습니다. 세포의 소량 만이 실험을 위해 필요한 경우 아이솔레이션은 비효율적이며 소모적 일 수있다. 분리 시간을 줄이는 데 초점 흐름을 개선 대부분의 노력은 아직이 새끼의 탄생을 타이밍의 문제를 해결하지 못한다. 대안으로, 많은 실험실 활용배아 줄기 세포 (는 ESC) 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)로부터 유도 된 심근 세포. 그러나, 리 프로그래밍 및 / 또는 분화 과정은 매우 시간 소모 및 비용을 또한 할 수있다. 체외 심근 모델로 이들 세포를 사용하는 경우 다른 문제가있을 수 있습니다. 두 ESC-및 심근 유래 iPSC- 1 차 심근 8-10 전기 생리학에서의 차이를 나타내는 것으로 나타났다. 해리 NRCMs 냉장 11을 사용하여 몇 일 동안 저장 될 수있는, 그러나 이는 장기 저장을 허용 않는다. 액체 질소는 일반적으로 더 큰 시간 동안 세포를 보존하기 위해 사용되지만, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 등의 동결 방지제 등을 필요로한다. 이전 연구는 동결 미디어의 5 ~ 10 % DMSO 사이의 이상적인 농도가 NRCMs의 냉동 보존을 허용 것을 보여 주었다, 그러나 그렇다하더라도 가능성은 낮은 12로 유지됩니다. DMSO는 무료 동안 세포를 보호하는 데 도움이되지만열정, 그것은 1.5 % 13 위의 농도에서 세포 독성이있을 수 있습니다. 이전 연구 천천히 DMSO를 세포로부터 제거, 세포 생존을 개선시킬 수있다 (14) 것으로 나타났다. 우리는 다음과 같은 격리 cryopreserving NRCM 세포에 의한 세포 - 기반 분석의 효율성을 개선하기 위해 노력했다. 이는 세포가 해동 필요한 절연 부 및 동물의 소비의 주파수를 감소 할 때 사용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는를 NRCMs cryopreserve 및 나중에 사용하기 위해 해동시킬 수 있음을 보여준다. 해동 후 세포 수용 가능성을 유지하고 자발적으로 α-sarcomeric 티닌 (α-SA)와 계약에 대한 긍정적 NRCM 문화를 생산하고 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td>With added 25mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (+Ca +Mg)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td>With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS5</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>205102</td>
			<td>Freezing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1889-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>542040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing Vacuum Filter (0.22&#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Conical</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ&#160;SLIDES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PEZGS0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-sarcomeric actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-7581KZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cryopreservation of neonatal rat cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

신생아 래트 심근 세포의 분리 후, 세포를 액체 질소로 동결 다운되고, 적어도 몇 달 동안 저장 될 수있다. 일반적 해동시 트립 판 블루 분석에 의해 측정 생존율​​ 40-60 % 사이가 될 것이다. 이 적절한 파종과 문화, 다른 세포 유형보다 낮은이지만 세포는 (그림 1) 증식합니다. 수축력을 검증하기 위해, 세포를 위상차 현미경을 이용하여 묘화 될 수있다. 세포는 자발적으로 3 일 (...

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Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

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12.4K 조회수.  College of Veterinary Medicine, North Carolina State University. The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.