우리는 팬텀 실험을 수행하기위한 마렉 WEILER 감사합니다. 이 작품은 유럽 연구위원회 (ERC 시작 부여 309495 : NeoNaNo)에 의해 지원되었다, 노르 트라 인 베스트 팔렌의 독일 연방 주 (노르 트라 인 베스트 팔렌, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2 programm에 (EFRE) ForSaTum), 독일 교육 및 연구 (BMBF)에 대한 정부 (재정 지원 프로그램 가상 간 (0315743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung 독일 (13N13355)), RWTH 아헨 대학 (나는 3 TM 종자 기금), 필립스 연구 (아헨, 독일).

프로토콜은 다음 단계의 상세한 설명이 포함 우선, 팬텀 또는 마우스와 봉형 마우스 베드 이미징을 위해 준비된다. 이어서 전신 스캔 μCT에서 획득된다. 그 후 마우스 침대는 두 개의 스캔이 (위 거꾸로) 취득 FMT로 전송됩니다. 이것은 여러 시점에서 여러 생쥐에 대해 반복 될 수있다. 데이터 수집의 완료 후에, 데이터는 내보내고 자동 세그멘테이션 (Definiens 소프트웨어 라이센스를 요구)뿐만 아니라, 화상 융합 및 (Imalytics 전임상 소프트웨어 라이센스를 요구하는) 형광 재를 사용하도록 정렬 될 필요가있다. 마지막으로 장기 대화식 형광 프로브의 생체 분포를 정량화하기 위해 분할되는 방법을 멀티 모드 데이터 세트가 시각화 방법과 같다. 1. 팬텀 준비 주 : 팬텀 이미징 시스템을 시험하는 데 유용하지만, 또한 사실상 교정을 결정할새로운 프로브 R. <ol><li> 200ml의 물, 2 % 아가로 오스 1.8 g 이산화 티탄 분말, 50 ㎕의 트리 판 블루 용액을 준비한다. 끓는 후 약 8cm 길이 3cm 폭 1.5 cm 높이의 직사각형 형태로 솔루션을 입력합니다. </li><li> μCT 형광 조영제의 혼합을 포함하는, 피펫 팁을 사용하여 가상 선으로 여러 형광 개재물을 준비한다. 흠을 만들려면, 피펫 팁을 잘라 라이터로 봉인. </li><li> 용액이 응고 후, 팬텀에 흠을 넣습니다. 불규칙한 형상을 달성하고 복합 마우스 홀더에 맞도록 팬텀의 일부를 버려야. </li><li> 새로운 프로브에 대한 보정 계수를 결정하기 위해, 일부 팬텀 검사가 필요합니다. 이 경우, 기본 FMT 팬텀은 프로브의 공지 된 양으로 혼합하여 사용된다. 증가 된 정확도를 같이 포함 내부 동일한 산란 계수를 수신하기 위해 용액에 4 % 지질 에멀젼을 추가팬텀의 나머지. 또한 쉽게 화상 분석 μCT 조영제 소량 (2 %)를 추가한다. </li></ol> 2. 마우스 준비 참고 : μCT-FMT 이미징은 마취 헤어 제거하는 등 특별한 준비가 필요합니다. <ol><li> 칠일 이미징 전에 엽록소가없는 음식에 마우스를 놓습니다. 이것은 배경 신호를 감소시키고 750 nm의 아래 FMT 채널 특히 중요 할 것이다. </li><li> 모든 동물 실험은 마취하에 수행됩니다. 마우스가 잠들 때까지 공기 (유량 5 L / 분)에서 2 % 이소 플루 란으로 채워진 챔버에 마우스를 놓고 마취를 시작합니다. 부드러운 발가락이나 피부 곤란에 의한 근육 TONUS의 휴식을 확인하여 (예., 턱 근육) 적절한 마취를 확인합니다. 마취를 유지하기 위해, (레이트 1 L / min의 흐름 공기 중에서 2 % 이소 플루 란) 마우스의 코에 배치되어 튜브를 사용하여 이소 플루 란 어플리케이션을 계속한다. 눈 drynes을 방지하기 위해서들, 마취 된 쥐에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 조영제를 주입하기 위해, 테이프를 이용하여 가열 패드에 마취 된 마우스를 고정한다. 꼬리 정맥에 카테터 (튜브에 부착 된 주사기 바늘)를 놓고 형광 조영제를 주입 (예를 들어, 2 nmol의를 5 ㎖의 최대 주입량 / kg 체중, 즉, 30g 마우스 150 μL)와. </li><li> 털이 마우스를 스캐닝하기위한 스캐닝 영역을 미리를 면도해야한다. 이를 위해, 면도기 나 제모 크림을 사용합니다. 생쥐의 일부 변종은 머리 제거 크림에서 발진을 개발할 수 있습니다. 따라서, 피부 변화에 대한 쥐를 모니터링하고 필요한 경우 치료에 대한 수의학 직원에게 문의하십시오. 새로운 마우스 균주를 사용하는 경우 또한, 동물의 소수에 내성을 테스트한다. </li><li> (속도 1 L / 분 흐름, 공기의 2 % 이소 플루 란) μCT 및 FMT 이미징 동안 마취 마우스를 유지합니다. </li></ol> 3. 마우스 침대 준비 참고 : μCT-FMT 주사를 들어, 멀티 모드를 사용μCT 및 FMT에 모두 맞는 마우스 침대. <ol><li> 촬영하기 전에, 물티슈와 마우스 침대를 청소하십시오. 이 아크릴 유리가 손상 될 수 있기 때문에 에탄올을 사용하지 마십시오. 이 자동화 된 마커 검출을 방해 할 수 있기 때문에, 마커 물이 없는지 확인합니다. </li><li> 복합 마우스 침대의 나사를 열고 상단 부분을 제거합니다. </li><li> 마우스 침대에 마취 가스 튜브를 연결하고 테이프로 고정하세요. </li><li> 마우스 침대에 마취 마우스를 놓고 가스 튜브에 코를 넣어. 마우스의 머리가 마우스 침대의 전면 표시 등 (그림 1)에 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스를 최적으로 FMT의 시야를 사용하는 마우스 침대의 중간에 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스 침대를 닫고 마우스가 긴밀하게 유지 될 때까지 나사를 조입니다. 마우스가 흉부 호흡의 움직임을 시각적으로 모니터링하여 지속적으로 호흡 할 수 있는지 확인합니다. </li></ol> 4. μCT 나는maging 주 : 전신 스캔은 μCT를 사용하여 수행됩니다. 생성 된 데이터는 해부학 향상된 형광 재건 및 이미지 분석을 위해, 이미지 합성을 위해 요구된다. <ol><li> μCT에 마우스로 마우스 침대를 놓습니다. 마우스는 μCT에 &quot;꼬리 먼저&quot;가는 길에 배치되어 있는지 확인합니다. 이것은 자동 융합 중요하다. </li><li> μCT 뚜껑이 폐쇄 될 때 마취를 유지하기 위해, μCT의 케이스를 통해 가스를 채널에 튜브를 연결합니다. 먼저 마우스 침대에서 긴 튜브를 분리하고이를 μCT의 외부에있는 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 μCT 내부 커넥터에 나머지 끝을 연결합니다. </li><li> μCT에 마우스 침대를 운전. 가스 튜브가 느슨하지 않고 회전 갠트리에 의해 잡힐 수 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 테이프를 이용하여 그것을 고정하세요. 마우스 침대의 홀더의 단면에 튜브를 삽입합니다. </lI&gt; <li> μCT를 닫고 topogram을 획득. 융합과 재건을 위해 중요하다 마우스와 마우스 침대의 상당 부분을 충당하기 위해 두 개 이상의 subscans을 선택합니다. </li><li> 서브 스캔 당 90 s의 스캔 시간을 필요로 하나의 전체 회전시 1,032 X 1,012 픽셀 (720) 전망을 취득의 HQd-6565-360-90라는 μCT 검사 프로토콜을 선택합니다. 튜브는 전압이 65 kV의 전류 1.0 mA에서 작동된다. 또한, 방사선 량과 검사 시간을 줄일 스캔 프로토콜 스캔 시간 서브 스캔 당 29의와 516 X 506 픽셀 (720) 전망을 획득 SQD - 6565-360-29를 선택합니다. </li><li> μCT 스캔을 시작합니다. 파란색 막대는 진행 상태를 나타냅니다. subscans 이후 취득됩니다. 저체온증 유체 손실 때문에 단 몇 분의 짧은 검사 시간의 문제가되지 않습니다. 이 자동에서 사용자를 보호하기 위해 검색을 방해하기 때문에 스캔하는 동안 μCT의 뚜껑을 열지 마십시오방사선. </li><li> 스캐닝이 완료되면, 덮개를 열 마취제 튜브를 연결하고 FMT에 수송하는 홀더로부터 마우스 베드 분리. </li></ol> 5. FMT 이미징 참고 : 직접 μCT 검사 후, 마우스가 개선 된 형광 재건을 위해 함께 사용되는 두 개의 구성 (최대 거꾸로)에 FMT에서 스캔됩니다. <ol><li> FMT에 마우스 침대를 배치하기 전에 FMT에 대한 (속도 1 L / min의 유량, 공기의 2 % 이소 플루 란) 마취 가스 공급을 켭니다. FMT 제어 소프트웨어를 사용하여, 환자의 적절한 수의 (즉, 마우스)와 함께 연구 그룹을 만듭니다. (나열되지 않은 새로운 프로브를 사용 OsteoSense) 영상에 사용되는 프로브를 선택합니다. </li><li> FMT에 마우스로 복합 마우스 침대 캐리. 긴가요 마취 가스 튜브는 가스 유동을 유지한다. FMT에 마우스 침대를 삽입하기 전에주의 깊게부터 튜브를 제거FMT 내부에 필요하지 않습니다. 마우스 침대의 나사를 돌려 피하십시오. </li><li> ( &quot;머리 처음&quot;) 먼저 빨간색 표시와 FMT에 마우스 침대를 놓습니다. 이미지 융합 μCT과 일치하는 중요합니다. </li><li> FMT를 닫습니다. </li><li> 올바른 연구 그룹과 대상을 선택합니다. FMT의 요구 채널 선택 (OsteoSense 750EX를 들어, 750 nm의 채널을 사용). </li><li> 설명, 예를 추가합니다. &quot;위로&quot;또는 &quot;아래&quot;와 &quot;캡처&quot;를 눌러 개요 스캔을 획득. 이보기의 전체 필드의 반사 이미지를 캡처한다. 그렇지 않으면 3D가 연속적으로 스캔 획득 할 수 없기 때문 &quot;반사율 이미지 만&quot;을 선택하지해야합니다. </li><li> 3 차원 스캔 이미지 매개 변수를 조정합니다. 마우스 최대한 포함 시야 확대. 일반적으로, 머리와 꼬리는 완전히 그러나, 시야에 적합하지 않습니다. 클릭 &quot;고급(221); 및 이미지 설정을 확인합니다. 각각 5000 및 50000에 정상 및 조명 최소 / 최대에 3mm, 감도 설정 샘플링 밀도. </li><li> FMT 스캔을 시작하는 &quot;스캔&quot;을 클릭 클릭 &quot;재건 대기열에 추가&quot;를. 더 긴 노출 시간이 두꺼운 물체 필요하기 때문에, 크기 및 마우스의 두께에 따라, 약 5 내지 15 분 걸릴 것이다. 장치 저체온증을 피하기 촬상 가열 챔버를 포함한다. </li><li> 스캔 후, 거꾸로 마우스를 포함한 마우스 침대를 뒤집어 다른 검색을 획득. 이것은 형광 재건을위한 추가 데이터를 제공한다. </li><li> μCT 및 FMT-스캔이 완료되고 마우스가 마취에서 깨어 났을 때 주변에 도보 또는 흉골 드러 누움을 유지하기 위해, 예를 들어 충분한 의식을 회복 할 때까지,이 방치하지 않습니다. </li></ol> 6. 이미지 퓨전 및 재건 참고 : 후연구 끝에 μCT-FMT 주사, 예를 들면, 완료는, 수집 된 데이터는 자동화 된 이미지 합성 및 형광 재를 사용하도록 정렬 될 필요가있다. <ol><li> 추가 처리를 위해 검사를 정렬하려면, 연구를위한 폴더를 만듭니다. 각 μCT-FMT 스캔의 경우, 이름이 마우스 ID와 시점, 예를 들면., M01_02h을 포함하는 하나의 하위 폴더를 만들 수 있습니다. </li><li> 각 μCT-FMT는 스캔, .fmt 파일과 FMT 검사 (위, 아래)를 내보내고 &quot;_up.fmt&quot;또는 &quot;_down.fmt&quot;하나 끝나는 파일 이름을 사용하여 하위 폴더에 저장합니다. 각 .fmt 파일 취득한 원 데이터를 포함하고, 즉, 그러한 노출 시간 등의 카메라, 메타 데이터에 의해 취득 된 여기 및 발광 이미지 및 FMT에 의해 생성 된 형광 재구성. </li><li> μCT 소프트웨어를 사용하여, 등방성 복셀 크기 35 μm의와 재건을 만들 수 있습니다. 부드러운 재건 커널 (T10)을 선택합니다. 그래서 시야를 조정표지를 포함한 전체 마우스 침대가 포함된다. 출력 형식으로 MIFX / 원료를 선택하고 복원을 시작합니다. 복원이 완료되면 μCT-FMT 검사의 하위 폴더에 μCT 재건 파일을 이동합니다. </li><li> 모든 검사에 대한 μCT 및 FMT 데이터를 내 보냅니다. 각 하위 폴더가 두 .fmt (위, 아래) 파일과 MIFX / RAW 형식으로 μCT 재구성이 포함되어 있는지 확인합니다. 완전성을 확인하기&gt; 메뉴 -&gt; CT-FMT-을 선택 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 완전성을 확인합니다. 오류 목록은 파일이나 μCT 재구성 .fmt 누락 된 것으로 나타날 수 있습니다. 오류를 수정하고 모든 오류가 해결 될 때까지 완성도를 확인합니다. </li><li> 메뉴 -&gt; CT-FMT-&gt; 설정을 사용하여 Definiens 소프트웨어의 서버 이름을 확인하고 필요한 경우 조정합니다. 기본값은 HTTP입니다 : // localhost를 : 8184, Definiens 소프트웨어가 같은 컴퓨터에 설치되어 있다고 가정. Definiens 소프트웨어 AU를 수행하는 다음 단계에서 필요한마우스 침대와 마커의 tomated 분할. </li><li> 전체 연구를위한 자동화 μCT-FMT 융합을 수행 할 Imalytics 전임상 소프트웨어에서 메뉴 -&gt; CT-FMT-&gt; 퓨즈 그룹을 클릭합니다. μCT-FMT 검사 및 연구 폴더에 접미사 &quot;패키지&quot;평행 폴더에 결과 당이 작업은 몇 분 정도 걸립니다. 이 파일 추가 분석을 위해 관련된 (μCT 데이터와 융합 공급 업체에서 제공하는 FMT 재건)의 작은 부분 집합이 포함되어 있습니다. </li><li> 지도 (13) 흡수의 생성을 포함하고 산란 형광 재건을 수행 할 Imalytics 전임상 소프트웨어에서 메뉴 -&gt; CT-FMT-&gt; 재구성 그룹 (FMT)를 클릭합니다. 처리 GPU 가속 20 비록 각 재구성 마우스의 크기에 따라 1 내지 4 시간을 필요로한다. 결과는 패키지 폴더에 저장됩니다. 참고 : 높은 처리량을 가능하게하기 위해, 우리는 현재 56 GPU를 GPU 클러스터에서 이러한 복원을 수행합니다. </li&gt; </ol> 7. 이미지 분석 참고 : 이미지 데이터의 정량적 측정을 추출하려면, 병변 및 기관의 세분화가 필요합니다. <ol><li> 일단 세트를 융합하고 재구성되는 모든 데이터는 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 스캔 각 μCT-FMT에 대한 분할을 만들 수 있습니다. </li><li> 언더로 μCT 파일과 오버레이 형광 파일을로드합니다. 를 눌러 &quot;3D&quot;는 볼륨 렌더링을 켜고 데이터 세트를 검사합니다. </li><li> 세그먼트 폐에, 메뉴 -이&gt; 클래스 -&gt; 클래스를 추가하고 &quot;TMP&quot;라는 이름의 클래스를 만들기를 클릭합니다. 이것은 또한 상황에 맞는 메뉴를 통해 수행 할 수 있습니다. 새로운 클래스를 작성하면 자동으로 다음 분할 작업을위한 출력 클래스로 설정합니다. <ol><li> 세그먼트에 μCT 데이터 세트에서 낮은 강도의 모든 영역을 임계 작업을 수행 (클릭 아래 메뉴 -&gt; Segmentation-&gt; Thresholding-&gt;를 입력 600). 지금 TMP 클래스 MO 외부 공기를 포함뿐만 아니라 폐 조직을 사용한다. </li><li> &quot;폐&quot;클래스를 만듭니다. &quot;지역 채우기&quot;작업을 수행 외부 공기로부터 폐를 분리, (&gt; 인 지역 채우기 무제한 영역을 채우기&gt; 폐에 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 메뉴 - 선택). </li><li> 그것은 더 이상 필요하지 않기 때문에 TMP 클래스를 삭제합니다. </li></ol></li><li> 세그먼트 볼록 영역, 예를 들면., 방광, 낙서 모드를 사용합니다. 첫 번째 클래스 &quot;방광&quot;을 만들 수 있습니다. <ol><li> F1 키를 눌러 모든 낙서를 삭제합니다. </li><li> 컴퓨터 마우스를 사용하여, 방광의 경계를 묘사 할 낙서를 그린다. </li><li> F3을 눌러 빨간색 오버레이로 표시 임시 마스크 낙서로 둘러싸인 영역을 채우기 위해. 반복적으로 (모든 슬라이스 방향으로) 더 낙서를 추가하고 충분한 정확도가 달성 될 때까지 F3 키를 누르십시오. 일반적으로, 10 조각의 낙서는 충분하다. </li><li> F4를 눌러 &quot;방광&quot;로 임시 마스크를 저장합니다. </li><li> 세그먼트에 다음과 같이 진행같은 심장과 신장 등의 볼록 지역. 대부분의 영역은, 예를 들면., 위 또는 간은 약간 볼록 영역들에 의해 근사 될 수있다. </li></ol></li><li> 세그먼트 척추에, 먼저 &quot;뼈&quot;클래스를 만들 수 있습니다. <ol><li> 모든 밝은 복셀을 분류하는 임계 작업을 수행 ContextMenu-&gt; Thresholding-&gt; 위를 선택합니다 (예 :., 1,600 위) &quot;뼈&quot;로. </li><li> 이 골격의 많은 다른 부분, 예를 들면., 리브와 연결되어 있기 때문에 영역 충전 작업은 세그먼트 척추 실패. 반복적으로 낙서 그리기와 두개골, 갈비뼈, 그리고 성례의 뼈에서 척추를 분리 F2 키를 눌러 몇 절단 작업을 수행합니다. </li><li> 마지막으로, 클래스 &quot;척추&quot;를 만들고 척추를 얻을 수있는 지역 충전 작업을 수행 (척추에 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ContextMenu-을 선택&gt; 지역 - 채우기&gt; 제한 지역을 기입). </li></ol></li><li> 일 내부의 파일로 분할 저장μCT-FMT 스캔의 전자 하위 폴더. 일괄 처리를 사용하려면, organs.seg, 예를 들어, 일관성있는 이름을 사용합니다. </li><li> 평균 형광 강도, 부피와 각 클래스의 총 금액 (평균과 볼륨의 제품을)를 포함하는 스프레드 시트를 생성하기 위해,&gt; 클래스 통계 (오버레이) 메뉴 -&gt; 통계 %를 선택합니다. </li><li> 모든 μCT-FMT 스캔의 모든 지역에 대한 값을 포함하는 단일 스프레드 시트를 생성하려면&gt; 일괄 -&gt; 일괄 통계 메뉴 -&gt; 일괄 -&gt; 설정 일괄 설정을 클릭 한 다음 메뉴 -을 클릭합니다. 이것은 즉, 각 μCT-FMT 스캔 하나 생성하고 많은 스프레드 시트 파일을 병합의 노력을 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 8. 프로브 교정 <ol><li> 프로브의 다른 공지 된 양의 요구와 프로브에 대한 교정 계수를 계산하기 위해, 여러 μCT-FMT 팬텀 스캔은, 예를 들어 (단계 1.4 참조)., 100 pmol의 50 pmol의 25 pmol의 0 pmol의로. </li><li> 에 설명 된대로 팬텀를 스캔FMT에서 섹션 4 팬텀 스캔 또한 5. 상하 검사가 필요합니다. </li><li> 데이터를 내보내고 6 절에 기술 된 바와 같이 융합과 재구성을 수행합니다. </li><li> 세그먼트 (1,200 이상) 임계 화하여 각 스캔 μCT 데이터를 사용하여 포함 및 지역 충전. </li><li> 측정 된 형광 양의 스프레드 시트를 생성하고 확정 된 금액의 함수로 플롯. 선형 회귀 적합의 기울기를 계산합니다. 이 프로브에 대한 교정 인자이다. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+optical+properties+of+biological+tissues.">A review of the optical properties of biological tissues.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).</li><li>Doleschel, D., Mundigl, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+near-infrared+imaging+of+the+erythropoietin+receptor+in+human+lung+cancer+xenografts.">Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).</li><li>Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tomography+of+MMP-activity+allows+a+sensitive+non-invasive+characterization+of+the+invasiveness+and+angiogenesis+of+SCC-xenografts.">Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts.</a> Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).</li><li>Kunjachan, S., Pola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+versus+Active+Tumor+Targeting+Using+RGD-+and+NGR-Modified+Polymeric+Nanomedicines.">Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines.</a> Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).</li><li>Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-126-5p+promotes+endothelial+proliferation+and+limits+atherosclerosis+by+suppressing+Dlk1.">MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1.</a> Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).</li><li>Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+associates+with+inflammation+in+early-stage+atherosclerosis+evaluated+by+molecular+imaging+in+vivo.">Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo.</a> Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).</li><li>Gremse, F., H&#246;fter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPU-Accelerated+Sparse+Matrix-Matrix+Multiplication+by+Iterative+Row+Merging.">GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging.</a> SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).</li><li>Vasquez, K. 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A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).</li><li>Jacques, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+biological+tissues:+a+review.">Optical properties of biological tissues: a review.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).</li><li>Loening, A. M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMIDE:+a+free+software+tool+for+multimodality+medical+image+analysis.">AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis.</a> Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).</li><li>Gremse, F., Schulz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+Quantitative+Data+Analysis.">Qualitative and Quantitative Data Analysis.</a> Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).</li><li>Baiker, M., Milles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas-based+whole-body+segmentation+of+mice+from+low-contrast+Micro-CT+data.">Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data.</a> Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).</li><li>Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+with+optics:+primer+and+case+for+near-infrared+fluorescence+techniques+in+personalized+medicine.">Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).</li></ol>

펠릭스 Gremse는 Gremse-IT, 필립스와 RWTH 아헨 대학의 실험 분자 영상의 부서와 협력하여 의료 영상 분석 소프트웨어 및 서비스를 제공하는 스타트 업 회사의 설립자이자 소유자입니다.

우리는 기술과 복합 μCT-FMT 이미징을위한 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 17,21 - 우리는 상업적으로 이용 가능하고 널리 사용되는 FMT 및 μCT 장치 3,11,15를 사용합니다. 프로토콜이 특정 FMT를 요구하지만,이 μCT 예와 유사한 기능과 유사한 주사 파라미터와 다른 μCT 의해 대체 될 수 있고, 시야각은 마커를 포함 마우스 침대 커버 할만큼 커야한다. FMT는 μCT 또는 MRI (21)과 결합하지 않고 생체 분포 분석에 사용 된, 그러나, 해부학 적 데이터 세그먼트가 μCT 데이터 (10)에서 볼 수있는 장기 경계에 기초 할 수 있기 때문에, 재현성을 높이기 위해 유리하다. 집적 μCT-FMT 장치 2,7- 개발되었지만, 이것들은 아직 시판되지 않는다. 또한, 두 개의 분리 된 장치의 사용은 배관, 즉 허용한다. 그 다음, 마우스를 CA먼저 마우스가 처리량을 증가시키기 위해, FMT에있는 동안 N μCT에 이미징 될 수있다. 수동 작업 부하를 줄이기 위해, 우리는 자동화 된 마커 검출 및 융합을 수행합니다. 또한, 마우스의 형상은 자동 분할되고,이 정보는 크게 형광 재구성 11,13,22을 향상시킨다. 양적 형광 재건, 흡수 및 산란지도는 13, 23를 필요합니다. 우리는 μCT 데이터의 자동 분할 및 여러 가지 조직 유형의 알려진 산란 계수 할당 (폐, 뼈, 피부, 지방, 그리고 남아있는 부드러운 조직) (24)에 의해 산란지도를 유도. 다음으로, 우리는 심장 및 간 13, 20는 물론 관류 기관 특히 중요 광학 원시 데이터로부터 흡수 맵을 재구성. 여러 시점에서 여러 마우스 스캔하면 신속하게 데이터의 다수를 초래하여 분석 할 설정한다. biodis 들어기여도 연구는 여러 기관은 각각 μCT-FMT 스캔을 위해 분할 할 필요가있다. 마우스 새롭게 반복적 마우스 침대에 배치되어 있기 때문에 불행히도, 세그먼테이션이 재사용 될 수 없다. 우리는 우리 연구소에서 개발 한 대화 형 분할을위한 도구를 사용하지만, 다른 도구는 25 적절할 수 있습니다. 이 같은 타원과 큐브 (26)와 같은 간단한 모양보다 복잡한 기관에 더 적합하기 때문에 우리는 복셀 현명한 세분화를 생성합니다. 자동화 된 전체 동물 세그멘테이션 더 수동 부하 (27)를 감소하는 것이 유용 할 것이지만, 대화식 분할 도구 여전히 세그멘테이션 오류를 수정하기 위해 요구된다. 또한, 자동 분할 도구는 제대로 병리 등의 특별한 경우를 거의 예상 할 수 없습니다. 우리는 원시 μCT 스캔을 사용하기 때문에, 예컨대 비장 등의 기관 일부는 심지어 수동 세그먼트 매우 어렵다. 조영제는 도움이 될,하지만 내약성에 문제가있다 그것은 maintai 어렵다길이 영상을 통해 NA 정상 조영제의 분포. 우리 팬텀 연구 형광 재건 형상 정보를 사용할 때, 신호 위치 파악이 개선되어있는 것을 알 수있다. 생체가 유사한 개선 이른 시점에 대한 프로브의 다량 이미 (주입 후 15 분), 명백한 방광. 하이드 록시 아파타이트 결합 프로브는 뼈와 관절에 축적한다. 이것이 즉, 신호가 이미 주입 후 척추 15 분에서 명확하게 볼 수 있습니다 발생 얼마나 빨리 현저하다. 이것은 아마 대상 지역 패스트 넘쳐 확산을 가능 프로브의 낮은 분자량에 기인한다. 프로브는 대상 하이드 록시 아파타이트에 공유 결합과 결합되지 않은 프로브는 배설된다. 이후 시점의 경우, 6 시간 및 주입 후 24 시간 사이의 척추에서의 신호 강도는, 아마도 상대적으로 안정적으로 유지 거의 광 재 때문에형광 표백제 깊은 마우스로 아파. 우리의 연구를 위해, 우리는 주입 전에 취득한 스캔으로 분명 낮은 배경 형광 결과 750 nm의 채널을 사용했다. 보다 낮은 파장들에서, 더 많은 배경 신호 (28)를 기대할 수있다. 요약하면, 우리는 시중에서 판매하는 FMT 및 μCT 장치를위한 멀티 모달 이미징 프로토콜을 설명합니다. 우리는 조합이 형광 재건을위한 혜택을 제공 것으로 나타났다. 우리는 생체 분포 곡선 대화식 장기 분할 및 일괄 처리를 이용하여 화상 데이터의 대량 추출되는 방법을 예시한다. 우리는이 표준화 된 워크 플로우는 신약 개발과 형광 표지 된 프로브를 사용하여 다른 영상 연구에 도움이 될 수 있다고 생각합니다.

형광 매개 단층 촬영라고도 형광 분자 단층 (FMT)는 정량적 같은 마취 된 쥐 또는 인간의 신체 조직, 예를 들면, 유방이나 손가락 관절 등 미만성 조직에서 형광 분포를 평가하기위한 유망한 기술이다. 세포 내 해상도 1 표면의 촬상 대상을 허용 비 침습적 현미경 기술에 대조적으로, FMT는 저해상도이 낮아지기 수 ㎝, 깊이 형광 소스 삼차원 재구성을 허용한다. 5 - 많은 대상으로 형광 프로브는 이미지 혈관 신생, 세포 사멸, 염증 등 2 사용할 수 있습니다. 일부 프로브는, 기동 있습니다 예를 들어., 형광 색소의 unquenching로 이어지는 특정 효소 절단에 의해. 또한, 형광 단백질을 발현하는 리포터 유전자는 종양 세포의 이동을 추적하기 위해 6, 예를 들면, 묘화 될 수있다. FMT는 강하게 예를 들어, 2,7 또는 자기 공명 영상 (8) μCT, 해부학 적 양상과 조합의 혜택. 독립형 FMT 장치 상업적 9 사용할 수 있지만, 형광 이미지는 해부학 적 기준 정보없이 해석하기가 어렵다. 최근 우리는 융합 해부학 화상 데이터보다 강력한 분석을 가능하게한다는 10, 표시 할 수 있었다. 해부학 적 데이터는 또한 정확한 광학 모델링 및 형광 재 (11)에 대한 중요한 마우스의 외형으로 사전 지식을 제공하기 위해 사용될 수있다. 또한, 광 산란 및 흡수 맵 조직 유형의 분할을 사용하여 추정 된 계수 12,13 특정 클래스를 할당하여 할 수있다. 근적외선 들어 헤모글로빈 멜라닌 모피 14 게다가 마우스에서 주요 흡수이다. 상대 혈액량은 크기 순서에 의해 지역적으로 변화하기 때문에, 흡수지도 콴 특히 중요titative 형광 재 (13). 비 침습적 촬상 장치를 사용하는 하나의 장점은 생쥐 여러 시점에서, 즉, 종 방향으로 묘화 될 수 있다는 것이다. 이는 프로브의 동적 거동, 즉, 타겟 축적, 배설물 및 생체 분포를 평가하기 위해 10, 15, 또는 질병의 진행 (16)을 평가하는 것이 중요하다. 여러 시점에서 여러 생쥐 촬상하면, 이미지 데이터 집합의 다량 발생한다. 비교를 활성화하려면 다음은 잘 정의되고 문서화 된 프로토콜로, 체계적으로, IE에서 취득해야한다. 스캔의 다수의 이미지 데이터로부터 양적 측정 값을 추출하는 데 필요한 화상 분석을위한 도전을 제기. 본 연구의 목적은 여러 연구에 걸쳐 10,13,15,17,18 우리가 사용하는 최적화 μCT-FMT 촬상 프로토콜의 상세한 설명을 제공하는 것이다. 우리는 기술데이터 세트가 생성되는 방법, 시각 처리하고 분석 하였다. 이것은 19 수산화 인회석에 결합 설립 분자 프로브, OsteoSense를 사용 입증되고, 화상 골 질환에 사용될 수 있으며,이 개조. 동물과 관련된 모든 절차는 동물 보호에 대한 정부 심의위원회에 의해 승인되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>FMT2000</td>
			<td>Device for fluorescence molecular tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;CT (micro computed tomography) Tomoscope Duo</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Tomoscope Duo</td>
			<td>Device for micro computed tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimodal Mouse Bed</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td>Partially transparent animal holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflurane, USP)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>Isoflurane Inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia system</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>726419</td>
			<td>Complete Isoflurane Table-Top System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyll-free mouse food</td>
			<td>Ssniff</td>
			<td>E15051</td>
			<td>low chlorophyll / low fluorescence food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 750EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10053EX</td>
			<td>Animal FMT contrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex Fine Bore Polythene Tubing</td>
			<td>Smith medical</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>Tube for injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican 30g</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4656300</td>
			<td>Hypodermic needle for catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imeron</td>
			<td>Altana pharma</td>
			<td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td>
			<td>CT contrast agent for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90-12-36-6</td>
			<td>Agarose for phantom production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1900,1000</td>
			<td>Titanium oxyde as phantom scattering agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93595</td>
			<td>Trypan blue to adjust phantom light propagation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy7</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>15020</td>
			<td>Fluorochrome for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipovenoes 20%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>3094740</td>
			<td>Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Definiens Developer XD Server</td>
			<td>Definiens AG</td>
			<td>Server XD</td>
			<td>Software platform for automated segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalytics Preclinical</td>
			<td>ExMI/Gremse-IT</td>
			<td>Version 2.0.1</td>
			<td>Software for image fusion, reconstruction and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVIDIA Geforce Titan</td>
			<td>Asus</td>
			<td>GTXTITAN6GD5</td>
			<td>High end computer graphics card, 6GB Memory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid &#181;ct-fmt imaging and image analysis

형광 매개 단층 촬영 (FMT)는 생체 내에서 형광 분포의 종 방향 및 정량이 가능하고 신규 한 프로브의 생체 분포를 평가하고 수립 분자 프로브 또는 리포터 유전자를 이용하여 질병의 진행을 평가하기 위해 사용될 수있다. 예를 들면 해부학 적 양상과 조합은, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT), 이미지 분석 및 형광 재건 유리하다. 우리는 정량적 측정을 추출하는 데 필요한 화상 처리 단계를 포함한 멀티 모달 μCT-FMT 이미징을위한 프로토콜을 기술한다. 마우스를 준비하고, 촬상을 수행 한 후, 복합 데이터 세트가 등록된다. 이어서, 개선 된 형광 재구성 고려 마우스의 형상을 취하는, 수행된다. 정량 분석​​을 위해, 기관 세그먼테이션은 대화 형 분할 도구를 사용하여 해부학 적 데이터에 기초하여 생성된다. 마지막으로, 생체 분포 CUrves 일괄 처리 기능을 사용하여 생성됩니다. 우리는 뼈와 관절 결합 공지 프로브의 생체 분포를 평가함으로써 상기 방법의 적용을 나타낸다.

우리는 하이드 록시 아파타이트에 결합하여 표적 프로브 OsteoSense의 생체 분포를 평가하기 위해 설명한 프로토콜을 적용 하였다. 3 마우스 (C57BL / 6 APOE - / - AHSG - / - 더블 녹아웃 마우스, 10 주)는 몇 군데 있었다 전과 15 분, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 2 nmol의의 OsteoSense의 정맥 주사 후 24 시간. 우리의 소프트웨어가 자동으로 복합 마우스 베드에 내장 마커 검출 (도 1,도 2A, B) FMT (도 2C, D)에 의해 수행되는 형광 재건 해부학 μCT 데이터의 융합을 활성화. OsteoSense은 방광의 저 분자량, 빠른 신장 배설 따라서 높은 신호 프로브 때문에 예상된다. FMT의 형광 재건의 융합은 방광 (그림 2C, D) 외부 잘못 신호 등의 문제를 한 것으로 밝혀졌습니다. FMT는 마우스의 실제 형상을 알고있는 블록 형상을 가정하지 않기 때문에 이러한 문제가 발생한다. 오우R 재건 μCT 데이터로부터 정확한 형상을 결정하고, 산란을 발생 및 흡수는 방광 (도 2E, F)에서 특히 분명하다 나은 신호 위치 파악과 더 정확한 형광 재구성을 가능하게하기 위해 (13)을 매핑한다. 해당 지역에 복원 된 형광을 지정하려면, 우리는 대화 형으로 우리의 소프트웨어 (그림 3)를 사용하여 여러 장기를 분할. (18) 검사 각각에 대해 7 영역은 μCT 데이터, 즉., 심장, 폐, 간, 신장, 척추, 방광과 대장에 기초 분단 하였다. 이어서, 소프트웨어 (126)의 각 영역에 대한 평균 형광 농도를 계산하는데 사용 하였다. 다행히도, 소프트웨어는 모든 값을 계산하고 하나의 스프레드 시트들을 저장 배치 모드를 제공한다. 형광의 분포를 가시화하기 위해, 3D 렌더링은 각 시점에 대해 생성 된,비교 윈도우 설정 (도 4a-F)를 사용. 장기 정량 값을 사용하여, 생체 내 분포는 세 마우스 (도 4G) 위에 장기 평균값에 의해 계산 하였다. 주입 전에 취득한 사전 검사는 무시할 배경 신호를 보여 주었다. 15 분 주사 후, 가장 강한 신호 때문에 빠른 신장 배설, 방광에 출연했다. 이후의 시점에서, 나머지 프로브는 뼈와 관절에 축적되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" /> 그림 1. 모드의 마우스 침대. (A) 복합 마우스 침대 단단히 마우스를 잡고 두 아크릴 유리판이 포함되어 있습니다. 긴축은 두 개의 나사를 사용하여 조정됩니다. 마우스 침대 이미지 융합에 대한 마커 (빈 구멍)가 포함되어 있습니다. 마취 가스는 t에 집착하는 유연한 튜브를 사용하여 공급원숭이. (B) 마우스 베드는 금속 홀더에 부착되고, 회전 갠트리 μCT의 중심에 유지된다. 그렇지 않으면 표식 잘못 잘못된 융합 선도 할당 될 수 있기 때문에 (C)는, 마우스 침대 및 금속 홀더 사이의 갭을 피한다. 마취 가스 튜브는 튜브 커넥터에 연결해야합니다. (D)는 마우스 침대는 올바른 자동화 융합을 활성화하려면 전면 처음으로 FMT에 삽입해야합니다. (E) 마커가 자동 마커 검출 및 융합에 사용되는 FMT 카메라에 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" /> 그림 2. 이미지 퓨전 및 재건. (A, B) 마커와 양해 각서 (MOU)의 외형SE는 자동 분할 알고리즘에 의해 결정된다. (C, D) OsteoSense의 주사 후 15 분은, 프로브의 상당량이 이미 방광으로 배설되고있다. μCT 데이터와 공급 업체가 제공하는 재건을 융합 한 후, 문제가 표시됩니다. 신호의 대부분은 방광 주위 아니지만 방광 안에 표시 어떤 신호도 공중에 나타난다. FMT는 블록 모양의 마우스를 가정하기 때문에이 문제가 발생합니다. μCT 데이터에서 파생 된 마우스의 모양을 사용하여 (E, F) 우리의 개선 된 형광 재건, 방광 내부의 형광의 더 나은 현지화의 결과는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" /> 그림 3. 대화 형 장기 Segmentat. 이온 (A)의 형광 분포를 정량화하기 위해, 여러 가지 장기 분할된다 : 심장 (적색), 폐 (분홍색), 간 (브라운), 위장 (베이지 색), 척추 (보라색), 신장 (황색), 소장 (녹색) 그리고 방광 (금). (B)를 강력하게 주변 조직에 비해 대조되는 폐는, 임계 값 및 지역 충전을 사용하여 분할된다. 이러한 방광, 신장, 심장 등 (C) 라운드 기관, &quot;낙서&quot;를 사용하여 분할된다. 더 복잡한 모양, 예를 들면, 간, 위장 (D) 기관은 점진적으로 낙서를 사용하여 분할된다. 척추 세그먼트에, 높은 임계 값은 세그먼트에 모든 뼈를 적용됩니다. 그런 다음 몇 가지 뼈, 예를 들면. 척추가 남을 때까지, 리브, 절단한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 4. 생체 분포. 생체 분포를 평가하기 위해, 마우스는 여러 시점 (AF)에서 검색됩니다. (가) 사전 검사는, 주입하기 전에, 750 nm의 채널에서 약간의 배경 신호를 보여줍니다. (B) 15 분 주사 후, 프로브의 상당량 방광 이미. 마우스 밖에서 형광 결과 (C)을 2 시간 시점에서, 마우스 배뇨했다. 이후의 시점 (DF)에서, 신호는 척추와 무릎, 뼈 및 관절, 즉.에서 우세하게 나타난다. (사) 정량화 형광 농도는 선택된 기관에 대해 표시됩니다.

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Hybrid  &amp;#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

하이브리드 μCT-FMT 및 촬상 화상 해석

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

13.0K 조회수.  RWTH Aachen University. We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

비디오: Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

연구

생체공학

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

의 광 주파수 도메인 영상<em&gt; 예 생체</em&gt; 폐 절제술의 표본 : 조직 병리학 간 상관 관계에 하나에 하나의 이미지를 얻기

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

질병 진단을위한 휴대용 이미징 및 분석과 결합 자기 부상

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

직렬 이미지 Dilations Intermembrane 거리 측정

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

고속 카메라 및 이미지 분석을 사용하여 빠르게 움직이는 마이크로 버블 영역의 이미징 및 정량화

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) hold promise to serve as a human-relevant model in preclinical phases of drug discovery and safety pharmacology, their maturity is still controversial in the scientific community and under constant development. We present a hybrid contractility and impedance/extracellular field potential (EFP) technology, adding significant pro-maturation features to an industry-standard 96-well platform.
The impedance/EFP system monitors cellular functionality in real-time. Besides the beat rate of contractile cells, the electrical impedance spectroscopy readouts detect compound-induced morphological changes like cell density and integrity of the cellular monolayer. In the other component of the hybrid cell analysis system, the cells are cultured on bio-compliant membranes that mimic the mechanical environment of real heart tissue. This physiological environment supports the maturation of hiPSC-CMs in vitro, leading to more adult-like contractile responses including positive inotropic effects after treatment with isoproterenol, S-Bay K8644, or omecamtiv mecarbil. Parameters such as the amplitude of contraction force (mN/mm2) and beat duration also reveal downstream effects of compounds with influence on electrophysiological properties and calcium handling.
The hybrid system provides the ideal tool for holistic cell analysis, allowing preclinical cardiac risk assessment beyond the current perspectives of human-relevant cell-based assays.

The analysis of changes in contractile function and cellular integrity of human iPSC-derived cardiomyocytes is of immense importance for nonclinical drug development. A hybrid 96-well cell analysis system addresses both parameters in a real-time and physiological manner for reliable, human-relevant results, necessary for a safe transition into clinical stages.

전임상 심장 위험 평가를 위해 인간 iPSC 유래 심근 세포의 구조적 및 수축성 변화를 평가하기위한 하이브리드 세포 분석 시스템

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...