Mittel aus den US National Institutes of Health (gewährt R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 und F32 DK103500) Cimit Projekt Nr 12-1732 und die Shriners Hospitals for Children wird dankbar anerkannt. Wir möchten danken für die New England Organbank für die Unterstützung dieser Arbeit.

Die Verwendung von menschlichem Gewebe muss von einer Ethikkommission (IRB) oder gleichwertig geprüft. Die hier beschriebene Arbeit wurde genehmigt und vom Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (Nr 2011P001496) befreit erklärt. 1. Herstellung der Lösung <ol><li> Aseptisch Ergänzungsmittel in den roten freien Williams Medium E Phenol wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Lösung muss frisch vor Gebrauch hergestellt werden. Insulin sollte unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt werden. </li></ol> 2. Zurück Tabelle Vorbereitung der Leber <ol><li> Ein mit Eis gefüllte Organ Schüssel auf einem sterilen, drapiert Oberfläche. Entfernen Sie die Leber aus der Box, so dass es in der Tasche von Kaltkonservierungslösung. Halten Sie die Leber vor allem unter Wasser. </li><li> Identifizieren Sie die Leberarterie (HA), der mit dem Aorten-Patch distal angesiedelt werden soll. Präparieren Sie kostenlos die Arterie zu verschiedenen abgeschnittenen Zweigen entlang der Länge mit Metzenbaumschere offenbaren. Sorgfältig dissect die gesamte Länge der Arterie Abtrennen eines Schiffes, das die Leber versorgt verhindern. Schneiden Sie nicht oder binden Sie Zweige, die nicht über eine sichtbare Ende. </li><li> Binden Sie alle Arterienäste die Leber mit Seidenfaden von Größe 0 bis 4-0, abhängig von der Größe des Schiffes nicht liefern. Schließen Zweige, die zu kurz sind, zu binden oder Löcher in der Arterie mit einer Masche des 7-0 Prolene. Krawatte und schneiden Sie die Milz und linken Magen-Arterien in der Nähe von ihrem Ursprung auf der Truncus coeliacus. </li><li> Entfernen Sie die Aorten-Patch durch Schneiden des Truncus coeliacus direkt unter dem Pflaster. Kanülieren den Truncus coeliacus mit dem Aortenkanüle. </li><li> Identifizieren Sie die Pfortader (PV) und stumpf sezieren kostenlos. Binden Sie alle Filialen und kanülieren die PV mit dem vorbereiteten Segment der Größe 24 Schläuche. </li><li> Teile der Membran entfernen vom suprahepatischen Hohlvene, ohne Schneiden der Vene selbst. Mittelabfluss aus der Hohlvene Kanalisation direkt in die Organkammer. </li><li> Schneiden Sie 2 Vollumfang tiSSUE Proben (2-3 mm Länge) aus dem Ende des gemeinsamen Gallengang; Schnapp frieren ein in flüssigem Stickstoff (bei -80 ° C) und speichern Sie die anderen in 10% Formalin, für Gewebe und histologische Analyse auf. Kanülieren Choledochus mit der Gefäßkanüle und einem Ablaufrohr der Membranoxygenator Rohr. </li><li> Identifizieren und zu ligieren den Cysticus mit einem 0 Seidenkrawatte. Die Gallenblasengang zwischen dem Gallengang und der Gallenblase gefunden. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an bündig eiskalten Taschen von Ringer-Laktat (LR) Lösung und erstklassigen die Schläuche, die Beseitigung aller Luft gesetzt. </li><li> Stellen Sie den Durchflussregler auf der bündig Schlauch auf ein langsames Einblasen. Vor dem Anschließen des bündig Schlauch an der Pfortader Kanüle, verschließen die Pfortader mit den Fingern am Hilus und füllen Sie die Kanüle und Vene mit Flush, um die Luft aus der Pfortader zu entfernen. Während der kalten Spülung erhöhen Sie nicht die Tasche mehr als 20 cm über die Höhe der Leber, übermäßigen Druck auf das zu vermeidenVene. </li><li> Während der bündig kurz verschließen die PV an der tiefsten Stelle. Überprüfen Sie die PV auf Dichtheit prüfen. Vessel Äste ab, wie oben beschrieben geschlossen werden. Spülen Sie die Leber durch die PV mit insgesamt 2 l eiskaltem LR. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.10, 2.11 für den HA mit 1 l LR. </li></ol> 3. Grundierung der SNMP-System <ol><li> Prime das Perfusionsvorrichtung durch Zugabe von 2 l Perfusat (21 ° C), um das Organ Schüssel und der Inbetriebnahme des Gerätes, um prime den Schlauch. Befolgen Sie die Anweisungen des Geräts, um die Perfusion Vorbereitung Einstellen der Temperatur auf 21 ° C. Beginnen mit Drücken von 3 mmHg und 30 mmHg auf der PV und ha. Öffnen Sie den Gastank und einem Durchfluss von 3 l / min eingestellt. </li><li> Nehmen eines Blutgasprobe sowohl von dem HA und PV Einströmen durch Ziehen einer 0,3 ml Probe aus der Probenöffnungen läuft, ist sie in dem Blutgasanalysegerät nach den Anweisungen des Herstellers. Bestätigen angemessene Sauerstoffversorgung (pO 2&gt; 700 mmHg) und pH-Wert (7,35 bis 7,45). </li><li> Bevor die Leber verbunden einen 1,0 ml Probe des Perfusat als bei = 0 Messung in ein Eppendorf-Röhrchen und bei -80 ° C. Schneiden Sie zwei ± 250 mg Keil Biopsien aus der Leber mit Hilfe eines einseitig geschliffene Klinge aus Stahl; Schnapp frieren ein in flüssigem Stickstoff (bei -80 ° C) und speichern Sie die anderen in 10% gepuffertem Formalin. Wiegen Sie die Leber vor Perfusion. </li></ol> 4. Menschliche Leber Perfusion <ol><li> Übertragen Sie die Leber in das Gerät. Schließen Sie den PV Zulauf zur PV-Kanüle nach Entfernen von Luft aus dem PV, wie in Schritt 2.10. Schließen Sie das HA in ähnlicher Weise. Set PV und HA Druck bis 3 und 30 mmHg. Die Leber ist fast von Perfusat getaucht werden. Decken Sie trockenen Oberflächen, einschließlich der Zufluss Gefäße, mit nassen steriler Gaze, um eine Austrocknung zu verhindern </li><li> Lassen Sie die Gallenabflussschlauch in einen Auffangbehälter. Sicherstellen, dass die Öffnung des Gallen Drain ist auf dem Niveau der Leber oder niedriger, damit Gallen ausgeführt out frei. </li><li> Ziel Flußraten 275-325 ml / min.kg und 50-100 ml / min.kg für die PV und HA je einmal die Leber auf 21 ° C erwärmt. Da jeder Leber Perfusion reagiert anders, überwachen den Fluss eng in den ersten Minuten. Erhöhen oder Verringern des Drucks auf eine der beiden Schiffe, wenn die Zielfließgeschwindigkeiten nicht erreicht werden. 50 mmHg auf der HA und 5 mmHg auf der PV nicht überschreiten. </li><li> Die Proben können von der Lebergewebe, Perfusat und Galle an der Ermittler bevorzugt berücksichtigt werden. Wir empfehlen mindestens den folgenden Beispielsammlung Regime während der Perfusion. <ol><li> Gewebebiopsien, n = 2 x 250 mg, jede Stunde. Lagerung: Snap frieren ein in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C langfristig. Darüber hinaus nehmen Sie eine weitere Biopsie vor und nach der Perfusion und fixieren in 10% gepuffertem Formalin (n = 1) </li><li> Perfusatproben, n = 2x 1 ml, 15 min in der ersten Stunde und alle 30 Minuten danach. Zeichnen Proben aus dem PV-infgeringe Probenöffnung. Lagerung: -80 ° C langfristig. </li><li> Blutgasanalyse von PV und HA Zufluss und Hohlvenenabfluss. n = 3 x 0.3 ml, alle 30 min. Zeichnen Proben sowohl von der PV und HA Probe-Anschlüsse. Zeichnen Sie eine 0,3 ml Probe aus der Hohlvene durch Einsetzen einer Spritze in die Vene und direkt in die Blutgasanalysegerät ausgeführt werden. Verwenden Sie die Ausgabe, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung und pH-Wert zu gewährleisten. </li><li> Gallenflüssigkeit, n = 1 x 1 ml jeder hr. Visuell quantifizieren Galle Produktion stündlich eine Probe aus dem Sammelbehälter. Erneuern Sie den Behälter nach der Probenahme. Lagerung: Trockeneis und -80 ° C langfristig. </li></ol></li><li> Weiter Perfusion 3 Stunden. Die Überwachung der Druck, pH und die Sauerstoffversorgung und die Entnahme von Proben im gesamten. Stellen Sie die er pH durch Zugabe von Natriumbicarbonat zu dem Perfusat. </li><li> Am Ende der Perfusion die Abschluss Proben während die Leber ist perfundiert wird. Trennen Sie die Leber und entfernen Sie den Gallengang Kanüle. Nehmen Sie 2 Post-Perfusion Gewebeproben von derGallengang nach wie vor für die Lagerung bei -80 ° C und in 10% gepuffertem Formalin beschrieben. </li><li> Entsorgen Sie die menschliche Leber nach einer ordnungsgemäßen Biohazard Entsorgungsrichtlinien. </li></ol>

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Drs. WERDEN Uygun, K Uygun und Yarmush sind Erfinder auf einen anhängigen Patent, die für diese Studie (WO / 2011 / 002.926), und Drs ist. WERDEN Uygun, K Uygun und Yarmush sind Erfinder auf einen anhängigen Patent, die für diese Studie (WO / 2011/35223) ist. Drs. K Uygun und Bruinsma eine vorläufige Patentanmeldung zu dieser Arbeit. Dr. K Uygun und BE Uygun haben ein finanzielles Interesse an Organsysteme, ein Unternehmen auf die Entwicklung von Organkonservierungstechnik. Dr. K Uygun und BE Interessen Uygun werden von der MGH und Partners Healthcare entsprechend ihrer Interessenkonflikt Politik verwaltet.

In einem Versuch, Leber während der Ischämie verletzten erhalten wir eine SNMP-System, das nach einer Periode der kalten Lagerung verwendet werden können, entwickelt. Subnormothermic Maschine Perfusion bietet eine echte Alternative zu herkömmlichen Kühllager sowie Hypothermie und normothermen Maschine Perfusion Modalitäten. Verschiedene unterschiedliche Systeme existieren; alle bieten unterschiedliche Vor- und Nachteile 3,9,20. SNMP ermöglicht die Perfusion ohne Sauerstoffträger, wie Stoffwechselsauerstoffbedarf bei 21 ° C durch aktive Sauerstoffanreicherung des Perfusat erfüllt. Obwohl unter subnormothermic Bedingungen reduziert, ist Stoffwechsel erheblich und erfordert die Unterstützung eines nährstoffreichen Perfusionslösung. Traditionelle Perfusionslösungen wie die Belzer Maschine Perfusionslösung, sind im allgemeinen in der Zusammensetzung minimal und sind zum Kalt Perfusion gestaltet. Williams &#39;Medium E wurde als Hepatozyten-Kulturmedium für viele Jahre verwendet worden und enthält componenten, die universell für die Unterstützung Zellfunktion, insbesondere unter warmen ex vivo Bedingungen. Messungen während des Maschinen Perfusion hergestellt sind repräsentativ für die Funktion des Organs. Direkt beobachtbaren Parametern wie Gallenproduktion und Sauerstoffaufnahme sind Echtzeitmessungen, die verwendet werden kann, um die Leber vor der Transplantation zu beurteilen. Auf ähnliche Weise können Marker der Zellverletzung und Ischämie (K +, Laktat Mitteilung) direkt in der Perfusionslösung gemessen werden und kann ein Hinweis auf Organfunktion 20 sein. Als Maschine Perfusion Technik weiterentwickelt und erreicht weiter verbreitet klinische Anwendung kann eine genaue Korrelation zwischen Ex-vivo-Funktion und dem klinischen Ergebnis durchgeführt werden und Perfusionsparameter nützlich bei der Unterstützung von Entscheidungen zu verpflanzen oder ablehnen Randqualität Leber sein. Außerdem ist, wie Point-of Pflege Analyse-Tools voraus, anspruchsvollere Analyse wird direkt in der Maschine Perfu verfügbarsion 21. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Leber können in der SNMP-System mit minimaler Schädigung der Leber unterstützt werden, durch Histologie und Freigabe ALT wider. Funktionelle Erholung der Leber wird am besten durch ATP, die gezeigt wurde, dass die Leberfähigkeit korreliert und ist deutlich für Transplantation Erfolg im Tiermodell 22 reflektiert. Würde Ex vivo und vor der Transplantation Erholung der Lebertransplantate eine deutliche Ausweitung des Spenders erlauben Leberpool, Korrektur der Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage von Spenderlebern in der Transplantationsmedizin.

Die Lebertransplantation ist die einzige kurative Behandlung für Zehntausende von Patienten, die im Endstadium einer Lebererkrankung leiden. Zur Erleichterung erfolgreiche Transplantation, optimale Konservierung der Leber von der Zeit ist es aus dem Spender bis zu der Zeit wird in dem Empfänger implantiert ist notwendig, um eine schnelle Verschlechterung des Transplantats zu verhindern, beschafft. Der aktuelle Standard für Leberkonservierung wird &quot;statische Kühllagerung&quot; bezeichnet: die Leber in eine eiskalte Konservierungslösung abgekühlt, wodurch der Stoffwechsel der Leber reduziert und verlangsamt die schädlichen Auswirkungen von Ischämie. Obwohl diese Kühllager Technik wurde für die erfolgreiche Transplantation erlaubt, Organe der Randqualität wie DCD Organe durch warme Ischämie oder Steatose Show unterlegen Patienten beschädigt Ziele 1. Es gibt einen schnell wachsenden Körper des Beweises, dass ex vivo Perfusion Maschine von Lebertransplantationen als Alternative Erhaltung Modalität kann möglicherweise imbeweisen Ergebnisse für diese Grenzorgane 2,3. Lebertransplantation hat sich zu einem Opfer seines eigenen Erfolgs. Weit mehr Patienten für eine Transplantation bezeichnet, als es Leber vorhanden und von tausenden sterben auf der Warteliste in den Vereinigten Staaten jedes Jahr. Angesichts der Realität der Spenderleber Knappheit und die zunehmende Nutzung von Lebertransplantationen suboptimaler Qualität für bedürftige Empfänger ist es weit verbreitet, dass ex vivo Perfusion Maschine von Lebertransplantationen vor der Implantation verspricht einen Paradigmenwechsel in Lebertransplantation. Es hat eine deutliche Steigerung in der Forschung Interesse an diesem Thema in den letzten Jahren 4-8. In verschiedenen europäischen und nordamerikanischen Zentren hypothermen Perfusion Maschine gemacht hat eine klinische Einführung 8 und normothermen Maschine Perfusion bei physiologischen Temperaturen hat kürzlich verworfen menschlichen Leber angewendet worden und wird für die klinische Anwendung und 9 umgerechnet.Intensive Entwicklungen für die Entwicklung der verschiedenen Protokolle geführt, während die kontinuierliche Optimierung identifiziert die optimale Durchblutung Parameter 10-12. Nutzung marginaler Qualität Transplantate wurde um mehr als 10-mal im letzten Jahrzehnt 13. Wenn der aktuelle Standard für Leberkonservierungs (statisch oder einfriert) verglichen wird, bietet ex vivo Maschine Perfusion zahlreiche potentielle Vorteile, von denen alle zu dringend benötigte Ausdehnung des Organs Pool und eine möglicherweise in der Inzidenz des postoperativen Komplikationen zu verringern. Insbesondere die biliäre Komplikationen, die derzeit nach der Transplantation plagen suboptimale Qualität Lebertransplantate bleibt eine wesentliche Frage 14-18. Maschine Perfusion bei subnormothermic Bedingungen bietet ein Zeitfenster, um Transplantatfunktion objektiv hinsichtlich Eignung für die Transplantation 19 zu bewerten. Während die Leber wird in einem ex vivo-Schaltung perfundiert sowohl das Perfusat einend die während der Perfusion produziert Galle für die Messung der Marker der Organfunktion zu beproben. Auf diese Weise &quot;stark beeinträchtigt&quot; Leber, die für die Transplantation unter den derzeitigen Kriterien verworfen werden objektiv auf ihre Eignung für die Transplantation zu bewerten. Lebensfähigkeit Abschätzung erlaubt möglicherweise für viele dieser Organe für die Transplantation verwendet werden. Ein ebenso leistungsfähigen Vorteil der Maschine Perfusion ist die Reparatur und Verbesserung der Leber, die durch warme / kalte Ischämie geschädigt wurden. ATP sehr schnell während der warmen und anschließende Kaltischämiezeit abgereichert und kann während eines Zeitraums von Maschinen Perfusion vor der Implantation der Leber 20 repleted werden. Die Leber, mit seinen Energiespeicher und Stoffwechsellage aufgefüllt wird vorbehandelt und besser für den schädigenden Auswirkungen der Reperfusionsschaden nach der Implantation in den Empfänger bereit. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Leber grafts im Labor, was nützlich für Forscher, die sowohl die Technik und die wohltuende Wirkung der Ex-vivo-Perfusion Maschine studieren möchten sein wird. Wir nutzen die menschliche Spenderlebern, die für die Transplantation abgelehnt wurden und dann für Forschungszwecke bereitgestellt. Standard Leber Beschaffung Technik beinhaltet in situ arteriellen bündig der Leber nach Aorten Querspann in hirntoten Spendern (DBD) oder nach dem Kreislaufstillstand in Kreis Tod Spender (DCD), an anderer Stelle 20 beschrieben. Zusätzlich wird die Leber während des Vergabe indem Bauchhöhle des Spenders mit Eis gekühlt. Spüllösung Vorlieben variieren zwischen den Regionen, wobei die Mehrzahl der Beschaffungen mit dem University of Wisconsin oder Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat (HTK) Lösung. Ein zusätzlicher Back-Tisch bündig der Pfortader verbessert das Auswaschen der Restblut. Livers oft beschafft Verlassen einer Aortensegment surRundung des Truncus coeliacus. Die Gallenblase wird eingeschnitten, Gallen wird abgesaugt, und der Gallengang gespült. Die Lebern werden in sterilen Beutel mit eiskaltem Konservierungslösung verpackt und in dafür vorgesehenen Boxen oder Kühler transportiert. Für repräsentative Ergebnisse sollten warme und kalte Ischämiezeit bis 60 min und 12 h zuge begrenzt. Trotz Routine serologische für übertragbare Krankheitserreger, müssen Standard Vorkehrungen bei der Abgabe menschlichen Organen werden Proben von menschlichen Organen gewonnen und keine Abfallprodukte. Das Protokoll hier beschrieben subnormothermic Maschine Perfusion mit einem handelsüblichen Leberperfusion Gerät. Die Verwendung einer solchen Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Umsetzung zu den klinischen und Kreuzvalidierung von unterschiedlichen Protokollen und Geräteeinstellungen zwischen Forschungsgruppen und Transplantationszentren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Assist perfusion device</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Assist disposable set</td>
			<td>Organ Assist B.V.</td>
			<td>Liver Assist disposable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1878&#8211;6x500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co</td>
			<td>Humulin R U-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>MGH pharmacy</td>
			<td>7750500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>ZO2OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty gas regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y11244D580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B2324X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>316-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Adson forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debakey tissue forceps, 7.75&#8221;, 2.25 mm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors 7&#34; Curved SureCut Tungsten</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6965SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle holder 5.5&#8211;7&#8221;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 blackbraided silk sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA66G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>C554D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood gas analysis machine</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidPoint 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance scale</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-10000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure display box</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pressure display sets</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td colspan="2">EW-91500-04 and EW-08516-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>30005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irrigation set flush tubing</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>06543-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing bowl, 4L</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07300-40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

Eine Reihe von Beobachtungen und Analysen auf die Leber während der Perfusion durchgeführt werden, einschließlich direkter aktuellen Messwerte, wie zB Durchflussraten und Galle Produktion; Echtzeitmessungen, wie zB Gasanalyse des Perfusat und Post-hoc-Messungen, die nach der Probenahme vorgenommen werden, einschließlich biochemische Analyse des Perfusat und Gewebe und histologische Analyse. Hier genannten Ergebnisse sind von 22 perfundierten menschlichen Leber. Lebern wurden zur Transplantation aus verschiedenen Gründen, einschließlich Alter des Spenders, übermäßige warmen ischämischen Zeit Biopsieergebnisse (Steatose, Entzündung, Fibrose) und logistischen Gründen abgelehnt. 18 Lebern wurden folgende Herztod nach Hirntod beschafft, und 4. In beiden Fällen wurden Spender mit 30.000 Einheiten Heparin vorbehandelt und in situ und auf der Rückseite Tisch mit UW-Lösung gespült. Mittlere kalten Ischämiezeit betrug 531 ± 237 (SD) min und die mittlere warme Ischämiezeit betrug 27 ± 10 (SD) min, vom Rückzug des Lebens gemessenUnterstützung für kalte Flush. Echtzeit-Beobachtungen und Messungen können verwendet werden, um die Leber während der Perfusion zu bewerten, während die Post-hoc-Messungen werden nach der Perfusion offenbart werden. Echtzeit-Beobachtungen Fluss durch die Leber beginnt niedriger als der Solldurchflussraten als ein Ergebnis einer höheren Widerstand im kalten Leber. Mit einem Druck von 3 mmHg für PV und 30 mmHg auf der HA die Sollströme können in der Regel einmal die Leber erreicht hat, bis zu 21 erwärmt &#160; ° C nach 60 min Perfusion (1A). Gallenfluss kann im Allgemeinen innerhalb von 10 min Perfusion festgestellt und während der Perfusion (1B) kontinuierlich hergestellt. Gallen Menge hängt von der Qualität der Leber und im Bereich von 0,3 ml / h / kg Leber bis 18 ml / min / kg. In Lebern mit längeren warmen ischämischen Zeit werden Gallenfluss neigen dazu, auslaufen, während kürzere warme Ischämiezeit führt zu einer stabilen oder sogar steigendenGalleproduktion. Echtzeit-Messungen Direkte und häufige Messung der Perfusat durch Blutgasanalyse im wesentlichen für beide Versuchszwecken sowie die Aufrechterhaltung eines angemessenen Perfusionsbedingungen, wichtiger ist die Sauerstoffversorgung und pH-Wert. Gelöster Sauerstoff-Partialdruck sollte größer als 700 mmHg auf dem Zufluss von sowohl der PV und HA ist. Abfluss Sauerstoffdruck in der Vena cava gemessen, im allgemeinen nimmt mit längeren Perfusion, was einer Erhöhung der Sauerstoffaufnahme. Sauerstoff-Aufnahmeraten kann wie zuvor 13 bis 2,4-9,7 ml O 2 / min / kg bei t = 3 h (1C) beschrieben, und reichten von 0,5 bis 2,2 ml O 2 / min / kg bei Beginn der Perfusion berechnet. Ein pH-Abfall wird in den ersten 30 min (1D) in erster Linie als ein Ergebnis von Lactat Freisetzung im Perfusat beobachtet. Dies kann durch Ergänzung mit 8,4% Natrium bicarbo unterstütztnate und nach ca. 90 min der pH-Wert fällt wieder in den normalen Bereich. Üblicherweise wird 30-50 ml 8,4% Natriumbicarbonat erforderlich. Laktatkonzentration steigt schnell in der ersten 15-30 Minuten, aber beginnt, sich nach der ersten Stunde (1E) versterben. Post-hoc-Messungen Lebertransami wie ALT kann im Perfusat gemessen werden. In den ersten 30 Minuten eine starke Zunahme von ALT wird allgemein beobachtet, die das Auswaschen von ALT, die während der Ischämie (1F) veröffentlicht wurde widerspiegelt. ALT wurde gezeigt, dass auch mit warmer Ischämiezeit 13 korrelieren. Maschine Perfusion erhöhte ATP-Gehalt 2,8-fache, was auf eine Erholung der Energiestatus (1G). H &amp; E histologische Analyse zeigt keine zusätzlichen Verletzungen während des Maschinendurchblutung (Abbildung 1 H, I) aufrechterhalten. Es sei darauf hingewiesen, dass die in diesem Protokoll vorgeschlagen Biopsieschema für RESuche und sind nicht anwendbar für klinische Zwecke sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Abb. 1: Bewertung der menschlichen Leber während des Maschinendurchblutung durch die PV und HA bei SNMP (A), Galle Produktion, quantifiziert pro Stunde Perfusion (B), Sauerstoff uprate Rate (OUR), aus der Differenz der Zufluss berechnet (PV Fluss + HA) und Abfluss (Hohlvene), unterbrochen Linien zeigen Sauerstoffpartialdrücken im Zu- und Ablauf während der Perfusion (C), pH und Laktat während der Perfusion (D, E), die Freisetzung von ALT in das Perfusat (F), ATP Gehalt im Gewebe von Stunden Biopsien (G) und H &amp; E-Flecken der Leber (54 Jahre alt DCD, 19 min warme Ischämie, 559 min kalte Ischämie) vor dem (H) und nach (I) Perfusion gemessen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Lebertransplantate in subnormothermic Temperatur (21 ° C).

Funktionale Menschliche Leber Erhaltung und Rückgewinnung mittels Subnormothermic Maschine Perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

functional-human-liver-preservation-recovery-means-subnormothermic

Research

JoVE Journal

Medicine

16.6K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School.  Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Lebertransplantate in subnormothermic Temperatur (21 ° C). 

Serie: Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for liver transplantation die without receiving an organ transplant or are delisted for disease progression. One strategy to increase the donor pool is the utilization of marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or donation after cardiac death (DCD). The current preservation technique of cold static storage is only poorly tolerated by marginal livers resulting in significant organ damage. In addition, cold static organ storage does not allow graft assessment or repair prior to transplantation.
These shortcomings of cold static preservation have triggered an interest in warm perfused organ preservation to reduce cold ischemic injury, assess liver grafts during preservation, and explore the opportunity to repair marginal livers prior to transplantation. The optimal pressure and flow conditions, perfusion temperature, composition of the perfusion solution and the need for an oxygen carrier has been controversial in the past.
In spite of promising results in several animal studies, the complexity and the costs have prevented a broader clinical application so far. Recently, with enhanced technology and a better understanding of liver physiology during ex vivo perfusion the outcome of warm liver perfusion has improved and consistently good results can be achieved.
This paper will provide information about liver retrieval, storage techniques, and isolated liver perfusion in pigs. We will illustrate a) the requirements to ensure sufficient oxygen supply to the organ, b) technical considerations about the perfusion machine and the perfusion solution, and c) biochemical aspects of isolated organs.

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or livers retrieved after cardiac death (DCD) tolerate conventional, cold static storage only poorly. We developed a novel model of subnormothermic ex vivo liver perfusion for preservation, assessment, and repair of marginal liver grafts prior to transplantation.

Technik der Subnormothermic<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Leberperfusion für die Lagerung, Bewertung, Reparatur von Marginal Lebertransplantate

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Forschung

Medizin

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

Ex-situ-normothermen Maschine Perfusion von Spenderlebern

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a serious problem. Therefore, the acceptance criteria for organ donors have been extended leading to the usage of marginal kidney grafts. These marginal organs tolerate cold storage poorly resulting in increased preservation injury and higher rates of delayed graft function. To overcome the limitations of cold storage, extensive research is focused on alternative normothermic preservation methods.
Ex vivo normothermic organ perfusion is an innovative preservation technique. The first experimental and clinical trials for ex vivo lung, liver, and kidney perfusions demonstrated favorable outcomes.
In addition to the reduction of cold ischemic injury, the method of normothermic kidney storage offers the opportunity for organ assessment and repair. This manuscript provides information about kidney retrieval, organ preservation techniques, and isolated ex vivo normothermic kidney perfusion (NEVKP) in a porcine model. Surgical techniques, set up for the perfusion solution and the circuit, potential assessment options, and representative results are demonstrated.

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

The severe organ shortage has resulted in increased use of marginal kidney grafts for transplantation. This has triggered interest in alternative storage methods, since marginal grafts especially tolerate cold storage poorly. The technique of normothermic ex vivo kidney perfusion (NEVKP) represents a novel preservation method for kidney grafts prior to &#160;transplantation.

Normothermen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kidney Perfusion für die Erhaltung der Nierentransplantate vor der Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

Methode der direkten segmentale Intra-Leber-Lieferung Mit einer Rattenleber Hilar Clamp Modell

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Dynamic Navigation in Endodontics: Guided Access Cavity Preparation by Means of a Miniaturized Navigation System

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common sequelae of dental trauma but can also occur with stimuli such as caries, bruxism, or after placing a restoration. In order to access the root canal as minimally invasive as possible in case of a necessary root canal treatment, dynamic navigation has recently been introduced in endodontics in addition to static navigation. The use of a dynamic navigation system (DNS) requires pre-operative cone-beam computed tomography (CBCT) imaging and a digital surface scan. If necessary, reference markers must be placed on the teeth before the CBCT scan; with some systems, these can also be planned and created digitally afterward. By means of a stereo camera connected to the planning software, the drill can now be coordinated with the help of reference markers and virtual planning. As a result, the position of the drill can be displayed on the monitor in real-time during preparation in different planes. In addition, the spatial displacement, the angular deviation, and the depth position are also displayed separately. The few commercially available DNS mostly consist of relatively large camera-marker-systems. Here, the DNS contains miniaturized components: a low-weight camera (97 g) mounted on the micromotor of the electric handpiece utilizing a manufacturer-specific connecting mechanism and a small marker (10 mm x 15 mm), which can be easily attached to an individually manufactured intraoral tray. For research purposes, a post-operative CBCT scan can be matched with the pre-operative one, and the volume of tooth structure removed can be calculated by the software. This work aims to present the technique of guided access cavity preparation by means of a miniaturized navigation system from imaging to clinical implementation.

Dynamic navigation systems (DNS) provide real-time visualization and guidance to the operator during endodontic access cavities preparation. The planning of the procedure requires three-dimensional imaging utilizing cone beam computed tomography and surface scans. After the export of the planning data to the DNS, access cavities can be prepared with minimal invasion.

Dynamische Navigation in der Endodontie: Geführte Zugangshohlraumvorbereitung mittels miniaturisiertem Navigationssystem

In the case of teeth with pulp canal calcification (PCC) and apical pathology or pulpitis, root canal treatment can be very challenging. PCC are common ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ shortages and increasing numbers of patients being listed for PTx, new strategies are needed to increase the number of available grafts for transplantation. 
Static cold storage (SCS) is considered the gold standard for standard criteria organs. However, standard criteria donors (SCD) are becoming scarce and new strategies that can increase the rate of organ acceptance from extended criteria donors (ECD) are urgently needed. 
Normothermic ex vivo perfusion (NEVP) is one of the strategies that has become increasingly popular over the past couple of decades. This preservation method has already been used successfully in other organs (liver, kidneys, and lungs) but has been minimally explored in pancreas transplantation. The few papers that describe the method for pancreas show little success, edema being one of the major issues. The following manuscript describes the successful NEVP method and setup developed by our group to perfuse swine pancreas.

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) has scarcely been explored for the preservation of pancreas allografts. We present an innovative preservation technique for pancreas allografts before transplantation.

Normotherme ex vivo Pankreasperfusion zur Konservierung von Pankreas-Allotransplantaten vor der Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

Schnelle Genesung der Lunge in Kombination mit abdominaler normothermer regionaler Perfusion bei kontrollierter Spende nach Kreislauftod

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

In Situ Mouse Liver Perfusion Model to Study Metabolic Responses to Substrates

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused liver allows the study of liver biology and metabolism in the whole liver with an intact hepatic architecture, separated from the influence of extra-hepatic factors. Liver perfusions were originally developed for rats, but the method has been adapted to mice as well. Here we describe a protocol for in situ perfusion of the mouse liver. The liver is perfused antegradely through the portal vein with oxygenated Krebs-Henseleit bicarbonate buffer, and the output is collected from the suprahepatic inferior vena cava with clamping of the infrahepatic inferior vena cava to close the circuit. Using this method, the direct hepatic effects of a test compound can be evaluated with a detailed time resolution. Liver function and viability are stable for at least 3 h, allowing the inclusion of internal controls in the same experiment. The experimental possibilities using this model are numerous and may infer insight into liver physiology and liver diseases.

Author Spotlight: Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases 

Here, we present a robust method for in situ perfusion of the mouse liver to study the acute and direct regulation of liver metabolism without disturbing the hepatic architecture but in the absence of extra-hepatic factors.

Glukoseproduktion, Harnstoffgenese und Lipolyse in der Leber quantifiziert mit dem perfundierten Mauslebermodell

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...

Mouse Liver Operation and Perfusion for Studying Hepatic Metabolism 

To begin, place the anesthetized C57 Black/6 JRj mouse. Supine on a heated operation table. Confirm the absence of reflex responses to toe pinching.Spray the mouse with 70%ethanol to prevent hair from sticking to the scissors. Using scissors, make an abdominal incision at the base, cutting upwards on both sides to the rib cage to expose the abdominal cavity. Use a cotton swab to move the intestines to the right, exposing the portal vein.Using curved forceps, place two ligatures under the portal vein and loosely tie each ligature. Next, insert a 0.7-millimeter catheter into the portal vein. When perforated, remove the needle from the catheter and guide the catheter through the vein until the tip of the catheter is close to the liver.Then, tighten the ligatures. Observe the liver. Set the flow rate from the roller pump and attach the profusion tube.Initiate the profusion of the liver at 37 degrees Celsius. Once the liver turns pale, use scissors to cut the rib cage and diaphragm. Then, using fine point forceps, place ligature under the suprahepatic inferior vena cava.Next, insert a catheter into the suprahepatic inferior vena cava through the right atrium of the heart. When perforated, remove the needle and guide the catheter through the vein closer to the liver. Then, tighten the ligature.Attach a tube for the collection of perfusion effluent and secure all tubes with waterproof tape. Using a vessel clamp adapter, place a vessel clamp across the infrahepatic vena cava immediately above the right renal vein to prevent dead mixture. Next, increase the perfusion flow rate to 3.5 milliliters per minute.Start the timer and pressure recording. Cover the liver with a sterile drape moistened with saline, equilibrate for 30 minutes, and measure the volume of effluent. After 30 minutes of equilibration, initiate the experiment for the first baseline sample collection in the fraction collector.Monitor the bubble trap regularly and refill with perfusion buffer when close to empty. Collect a buffer sample via a three-way stopcock immediately before it enters the organ and from the collecting catheter inserted in the inferior vena cava. Using a blood gas analyzer, measure the collected sample to confirm that the organ is metabolically active.After 15 minutes of baseline perfusion, using a syringe pump, start the first stimulation by infusing a test substance through a three-way stopcock at desired flow rate. After the simulation, collect baseline samples for 20 to 30 minutes before starting the second stimulation. The production of urea in the perfused liver with steady baseline periods preceding each of two stimulation periods suggested that the response of urea to two consecutive stimulations with mixed amino acids is consistent.A steady basal release of glucose and non-esterified fatty acids was observed. Before a robust increase in glucose and non-ED fatty acids during the glucagon infusion. The mean value at the basal state and during the glucagon infusion suggests that glucagon rapidly stimulates hepatic glycogenolysis and lipolysis.However, without steady basal periods, it becomes impossible to distinguish one urea response from the next.