Name: functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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Mittel aus den US National Institutes of Health (gewährt R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 und F32 DK103500) Cimit Projekt Nr 12-1732 und die Shriners Hospitals for Children wird dankbar anerkannt. Wir möchten danken für die New England Organbank für die Unterstützung dieser Arbeit.

Die Verwendung von menschlichem Gewebe muss von einer Ethikkommission (IRB) oder gleichwertig geprüft. Die hier beschriebene Arbeit wurde genehmigt und vom Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (Nr 2011P001496) befreit erklärt. 1. Herstellung der Lösung <ol><li> Aseptisch Ergänzungsmittel in den roten freien Williams Medium E Phenol wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Lösung muss frisch vor Gebrauch hergestellt werden. Insulin sollte unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt werden. </li></ol> 2. Zurück Tabelle Vorbereitung der Leber <ol><li> Ein mit Eis gefüllte Organ Schüssel auf einem sterilen, drapiert Oberfläche. Entfernen Sie die Leber aus der Box, so dass es in der Tasche von Kaltkonservierungslösung. Halten Sie die Leber vor allem unter Wasser. </li><li> Identifizieren Sie die Leberarterie (HA), der mit dem Aorten-Patch distal angesiedelt werden soll. Präparieren Sie kostenlos die Arterie zu verschiedenen abgeschnittenen Zweigen entlang der Länge mit Metzenbaumschere offenbaren. Sorgfältig dissect die gesamte Länge der Arterie Abtrennen eines Schiffes, das die Leber versorgt verhindern. Schneiden Sie nicht oder binden Sie Zweige, die nicht über eine sichtbare Ende. </li><li> Binden Sie alle Arterienäste die Leber mit Seidenfaden von Größe 0 bis 4-0, abhängig von der Größe des Schiffes nicht liefern. Schließen Zweige, die zu kurz sind, zu binden oder Löcher in der Arterie mit einer Masche des 7-0 Prolene. Krawatte und schneiden Sie die Milz und linken Magen-Arterien in der Nähe von ihrem Ursprung auf der Truncus coeliacus. </li><li> Entfernen Sie die Aorten-Patch durch Schneiden des Truncus coeliacus direkt unter dem Pflaster. Kanülieren den Truncus coeliacus mit dem Aortenkanüle. </li><li> Identifizieren Sie die Pfortader (PV) und stumpf sezieren kostenlos. Binden Sie alle Filialen und kanülieren die PV mit dem vorbereiteten Segment der Größe 24 Schläuche. </li><li> Teile der Membran entfernen vom suprahepatischen Hohlvene, ohne Schneiden der Vene selbst. Mittelabfluss aus der Hohlvene Kanalisation direkt in die Organkammer. </li><li> Schneiden Sie 2 Vollumfang tiSSUE Proben (2-3 mm Länge) aus dem Ende des gemeinsamen Gallengang; Schnapp frieren ein in flüssigem Stickstoff (bei -80 ° C) und speichern Sie die anderen in 10% Formalin, für Gewebe und histologische Analyse auf. Kanülieren Choledochus mit der Gefäßkanüle und einem Ablaufrohr der Membranoxygenator Rohr. </li><li> Identifizieren und zu ligieren den Cysticus mit einem 0 Seidenkrawatte. Die Gallenblasengang zwischen dem Gallengang und der Gallenblase gefunden. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an bündig eiskalten Taschen von Ringer-Laktat (LR) Lösung und erstklassigen die Schläuche, die Beseitigung aller Luft gesetzt. </li><li> Stellen Sie den Durchflussregler auf der bündig Schlauch auf ein langsames Einblasen. Vor dem Anschließen des bündig Schlauch an der Pfortader Kanüle, verschließen die Pfortader mit den Fingern am Hilus und füllen Sie die Kanüle und Vene mit Flush, um die Luft aus der Pfortader zu entfernen. Während der kalten Spülung erhöhen Sie nicht die Tasche mehr als 20 cm über die Höhe der Leber, übermäßigen Druck auf das zu vermeidenVene. </li><li> Während der bündig kurz verschließen die PV an der tiefsten Stelle. Überprüfen Sie die PV auf Dichtheit prüfen. Vessel Äste ab, wie oben beschrieben geschlossen werden. Spülen Sie die Leber durch die PV mit insgesamt 2 l eiskaltem LR. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.10, 2.11 für den HA mit 1 l LR. </li></ol> 3. Grundierung der SNMP-System <ol><li> Prime das Perfusionsvorrichtung durch Zugabe von 2 l Perfusat (21 ° C), um das Organ Schüssel und der Inbetriebnahme des Gerätes, um prime den Schlauch. Befolgen Sie die Anweisungen des Geräts, um die Perfusion Vorbereitung Einstellen der Temperatur auf 21 ° C. Beginnen mit Drücken von 3 mmHg und 30 mmHg auf der PV und ha. Öffnen Sie den Gastank und einem Durchfluss von 3 l / min eingestellt. </li><li> Nehmen eines Blutgasprobe sowohl von dem HA und PV Einströmen durch Ziehen einer 0,3 ml Probe aus der Probenöffnungen läuft, ist sie in dem Blutgasanalysegerät nach den Anweisungen des Herstellers. Bestätigen angemessene Sauerstoffversorgung (pO 2&gt; 700 mmHg) und pH-Wert (7,35 bis 7,45). </li><li> Bevor die Leber verbunden einen 1,0 ml Probe des Perfusat als bei = 0 Messung in ein Eppendorf-Röhrchen und bei -80 ° C. Schneiden Sie zwei ± 250 mg Keil Biopsien aus der Leber mit Hilfe eines einseitig geschliffene Klinge aus Stahl; Schnapp frieren ein in flüssigem Stickstoff (bei -80 ° C) und speichern Sie die anderen in 10% gepuffertem Formalin. Wiegen Sie die Leber vor Perfusion. </li></ol> 4. Menschliche Leber Perfusion <ol><li> Übertragen Sie die Leber in das Gerät. Schließen Sie den PV Zulauf zur PV-Kanüle nach Entfernen von Luft aus dem PV, wie in Schritt 2.10. Schließen Sie das HA in ähnlicher Weise. Set PV und HA Druck bis 3 und 30 mmHg. Die Leber ist fast von Perfusat getaucht werden. Decken Sie trockenen Oberflächen, einschließlich der Zufluss Gefäße, mit nassen steriler Gaze, um eine Austrocknung zu verhindern </li><li> Lassen Sie die Gallenabflussschlauch in einen Auffangbehälter. Sicherstellen, dass die Öffnung des Gallen Drain ist auf dem Niveau der Leber oder niedriger, damit Gallen ausgeführt out frei. </li><li> Ziel Flußraten 275-325 ml / min.kg und 50-100 ml / min.kg für die PV und HA je einmal die Leber auf 21 ° C erwärmt. Da jeder Leber Perfusion reagiert anders, überwachen den Fluss eng in den ersten Minuten. Erhöhen oder Verringern des Drucks auf eine der beiden Schiffe, wenn die Zielfließgeschwindigkeiten nicht erreicht werden. 50 mmHg auf der HA und 5 mmHg auf der PV nicht überschreiten. </li><li> Die Proben können von der Lebergewebe, Perfusat und Galle an der Ermittler bevorzugt berücksichtigt werden. Wir empfehlen mindestens den folgenden Beispielsammlung Regime während der Perfusion. <ol><li> Gewebebiopsien, n = 2 x 250 mg, jede Stunde. Lagerung: Snap frieren ein in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C langfristig. Darüber hinaus nehmen Sie eine weitere Biopsie vor und nach der Perfusion und fixieren in 10% gepuffertem Formalin (n = 1) </li><li> Perfusatproben, n = 2x 1 ml, 15 min in der ersten Stunde und alle 30 Minuten danach. Zeichnen Proben aus dem PV-infgeringe Probenöffnung. Lagerung: -80 ° C langfristig. </li><li> Blutgasanalyse von PV und HA Zufluss und Hohlvenenabfluss. n = 3 x 0.3 ml, alle 30 min. Zeichnen Proben sowohl von der PV und HA Probe-Anschlüsse. Zeichnen Sie eine 0,3 ml Probe aus der Hohlvene durch Einsetzen einer Spritze in die Vene und direkt in die Blutgasanalysegerät ausgeführt werden. Verwenden Sie die Ausgabe, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung und pH-Wert zu gewährleisten. </li><li> Gallenflüssigkeit, n = 1 x 1 ml jeder hr. Visuell quantifizieren Galle Produktion stündlich eine Probe aus dem Sammelbehälter. Erneuern Sie den Behälter nach der Probenahme. Lagerung: Trockeneis und -80 ° C langfristig. </li></ol></li><li> Weiter Perfusion 3 Stunden. Die Überwachung der Druck, pH und die Sauerstoffversorgung und die Entnahme von Proben im gesamten. Stellen Sie die er pH durch Zugabe von Natriumbicarbonat zu dem Perfusat. </li><li> Am Ende der Perfusion die Abschluss Proben während die Leber ist perfundiert wird. Trennen Sie die Leber und entfernen Sie den Gallengang Kanüle. Nehmen Sie 2 Post-Perfusion Gewebeproben von derGallengang nach wie vor für die Lagerung bei -80 ° C und in 10% gepuffertem Formalin beschrieben. </li><li> Entsorgen Sie die menschliche Leber nach einer ordnungsgemäßen Biohazard Entsorgungsrichtlinien. </li></ol>

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Drs. WERDEN Uygun, K Uygun und Yarmush sind Erfinder auf einen anhängigen Patent, die für diese Studie (WO / 2011 / 002.926), und Drs ist. WERDEN Uygun, K Uygun und Yarmush sind Erfinder auf einen anhängigen Patent, die für diese Studie (WO / 2011/35223) ist. Drs. K Uygun und Bruinsma eine vorläufige Patentanmeldung zu dieser Arbeit. Dr. K Uygun und BE Uygun haben ein finanzielles Interesse an Organsysteme, ein Unternehmen auf die Entwicklung von Organkonservierungstechnik. Dr. K Uygun und BE Interessen Uygun werden von der MGH und Partners Healthcare entsprechend ihrer Interessenkonflikt Politik verwaltet.

In einem Versuch, Leber während der Ischämie verletzten erhalten wir eine SNMP-System, das nach einer Periode der kalten Lagerung verwendet werden können, entwickelt. Subnormothermic Maschine Perfusion bietet eine echte Alternative zu herkömmlichen Kühllager sowie Hypothermie und normothermen Maschine Perfusion Modalitäten. Verschiedene unterschiedliche Systeme existieren; alle bieten unterschiedliche Vor- und Nachteile 3,9,20. SNMP ermöglicht die Perfusion ohne Sauerstoffträger, wie Stoffwechselsauerstoffbedarf bei 21 ° C durch aktive Sauerstoffanreicherung des Perfusat erfüllt. Obwohl unter subnormothermic Bedingungen reduziert, ist Stoffwechsel erheblich und erfordert die Unterstützung eines nährstoffreichen Perfusionslösung. Traditionelle Perfusionslösungen wie die Belzer Maschine Perfusionslösung, sind im allgemeinen in der Zusammensetzung minimal und sind zum Kalt Perfusion gestaltet. Williams &#39;Medium E wurde als Hepatozyten-Kulturmedium für viele Jahre verwendet worden und enthält componenten, die universell für die Unterstützung Zellfunktion, insbesondere unter warmen ex vivo Bedingungen. Messungen während des Maschinen Perfusion hergestellt sind repräsentativ für die Funktion des Organs. Direkt beobachtbaren Parametern wie Gallenproduktion und Sauerstoffaufnahme sind Echtzeitmessungen, die verwendet werden kann, um die Leber vor der Transplantation zu beurteilen. Auf ähnliche Weise können Marker der Zellverletzung und Ischämie (K +, Laktat Mitteilung) direkt in der Perfusionslösung gemessen werden und kann ein Hinweis auf Organfunktion 20 sein. Als Maschine Perfusion Technik weiterentwickelt und erreicht weiter verbreitet klinische Anwendung kann eine genaue Korrelation zwischen Ex-vivo-Funktion und dem klinischen Ergebnis durchgeführt werden und Perfusionsparameter nützlich bei der Unterstützung von Entscheidungen zu verpflanzen oder ablehnen Randqualität Leber sein. Außerdem ist, wie Point-of Pflege Analyse-Tools voraus, anspruchsvollere Analyse wird direkt in der Maschine Perfu verfügbarsion 21. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Leber können in der SNMP-System mit minimaler Schädigung der Leber unterstützt werden, durch Histologie und Freigabe ALT wider. Funktionelle Erholung der Leber wird am besten durch ATP, die gezeigt wurde, dass die Leberfähigkeit korreliert und ist deutlich für Transplantation Erfolg im Tiermodell 22 reflektiert. Würde Ex vivo und vor der Transplantation Erholung der Lebertransplantate eine deutliche Ausweitung des Spenders erlauben Leberpool, Korrektur der Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage von Spenderlebern in der Transplantationsmedizin.

Die Lebertransplantation ist die einzige kurative Behandlung für Zehntausende von Patienten, die im Endstadium einer Lebererkrankung leiden. Zur Erleichterung erfolgreiche Transplantation, optimale Konservierung der Leber von der Zeit ist es aus dem Spender bis zu der Zeit wird in dem Empfänger implantiert ist notwendig, um eine schnelle Verschlechterung des Transplantats zu verhindern, beschafft. Der aktuelle Standard für Leberkonservierung wird &quot;statische Kühllagerung&quot; bezeichnet: die Leber in eine eiskalte Konservierungslösung abgekühlt, wodurch der Stoffwechsel der Leber reduziert und verlangsamt die schädlichen Auswirkungen von Ischämie. Obwohl diese Kühllager Technik wurde für die erfolgreiche Transplantation erlaubt, Organe der Randqualität wie DCD Organe durch warme Ischämie oder Steatose Show unterlegen Patienten beschädigt Ziele 1. Es gibt einen schnell wachsenden Körper des Beweises, dass ex vivo Perfusion Maschine von Lebertransplantationen als Alternative Erhaltung Modalität kann möglicherweise imbeweisen Ergebnisse für diese Grenzorgane 2,3. Lebertransplantation hat sich zu einem Opfer seines eigenen Erfolgs. Weit mehr Patienten für eine Transplantation bezeichnet, als es Leber vorhanden und von tausenden sterben auf der Warteliste in den Vereinigten Staaten jedes Jahr. Angesichts der Realität der Spenderleber Knappheit und die zunehmende Nutzung von Lebertransplantationen suboptimaler Qualität für bedürftige Empfänger ist es weit verbreitet, dass ex vivo Perfusion Maschine von Lebertransplantationen vor der Implantation verspricht einen Paradigmenwechsel in Lebertransplantation. Es hat eine deutliche Steigerung in der Forschung Interesse an diesem Thema in den letzten Jahren 4-8. In verschiedenen europäischen und nordamerikanischen Zentren hypothermen Perfusion Maschine gemacht hat eine klinische Einführung 8 und normothermen Maschine Perfusion bei physiologischen Temperaturen hat kürzlich verworfen menschlichen Leber angewendet worden und wird für die klinische Anwendung und 9 umgerechnet.Intensive Entwicklungen für die Entwicklung der verschiedenen Protokolle geführt, während die kontinuierliche Optimierung identifiziert die optimale Durchblutung Parameter 10-12. Nutzung marginaler Qualität Transplantate wurde um mehr als 10-mal im letzten Jahrzehnt 13. Wenn der aktuelle Standard für Leberkonservierungs (statisch oder einfriert) verglichen wird, bietet ex vivo Maschine Perfusion zahlreiche potentielle Vorteile, von denen alle zu dringend benötigte Ausdehnung des Organs Pool und eine möglicherweise in der Inzidenz des postoperativen Komplikationen zu verringern. Insbesondere die biliäre Komplikationen, die derzeit nach der Transplantation plagen suboptimale Qualität Lebertransplantate bleibt eine wesentliche Frage 14-18. Maschine Perfusion bei subnormothermic Bedingungen bietet ein Zeitfenster, um Transplantatfunktion objektiv hinsichtlich Eignung für die Transplantation 19 zu bewerten. Während die Leber wird in einem ex vivo-Schaltung perfundiert sowohl das Perfusat einend die während der Perfusion produziert Galle für die Messung der Marker der Organfunktion zu beproben. Auf diese Weise &quot;stark beeinträchtigt&quot; Leber, die für die Transplantation unter den derzeitigen Kriterien verworfen werden objektiv auf ihre Eignung für die Transplantation zu bewerten. Lebensfähigkeit Abschätzung erlaubt möglicherweise für viele dieser Organe für die Transplantation verwendet werden. Ein ebenso leistungsfähigen Vorteil der Maschine Perfusion ist die Reparatur und Verbesserung der Leber, die durch warme / kalte Ischämie geschädigt wurden. ATP sehr schnell während der warmen und anschließende Kaltischämiezeit abgereichert und kann während eines Zeitraums von Maschinen Perfusion vor der Implantation der Leber 20 repleted werden. Die Leber, mit seinen Energiespeicher und Stoffwechsellage aufgefüllt wird vorbehandelt und besser für den schädigenden Auswirkungen der Reperfusionsschaden nach der Implantation in den Empfänger bereit. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Leber grafts im Labor, was nützlich für Forscher, die sowohl die Technik und die wohltuende Wirkung der Ex-vivo-Perfusion Maschine studieren möchten sein wird. Wir nutzen die menschliche Spenderlebern, die für die Transplantation abgelehnt wurden und dann für Forschungszwecke bereitgestellt. Standard Leber Beschaffung Technik beinhaltet in situ arteriellen bündig der Leber nach Aorten Querspann in hirntoten Spendern (DBD) oder nach dem Kreislaufstillstand in Kreis Tod Spender (DCD), an anderer Stelle 20 beschrieben. Zusätzlich wird die Leber während des Vergabe indem Bauchhöhle des Spenders mit Eis gekühlt. Spüllösung Vorlieben variieren zwischen den Regionen, wobei die Mehrzahl der Beschaffungen mit dem University of Wisconsin oder Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat (HTK) Lösung. Ein zusätzlicher Back-Tisch bündig der Pfortader verbessert das Auswaschen der Restblut. Livers oft beschafft Verlassen einer Aortensegment surRundung des Truncus coeliacus. Die Gallenblase wird eingeschnitten, Gallen wird abgesaugt, und der Gallengang gespült. Die Lebern werden in sterilen Beutel mit eiskaltem Konservierungslösung verpackt und in dafür vorgesehenen Boxen oder Kühler transportiert. Für repräsentative Ergebnisse sollten warme und kalte Ischämiezeit bis 60 min und 12 h zuge begrenzt. Trotz Routine serologische für übertragbare Krankheitserreger, müssen Standard Vorkehrungen bei der Abgabe menschlichen Organen werden Proben von menschlichen Organen gewonnen und keine Abfallprodukte. Das Protokoll hier beschrieben subnormothermic Maschine Perfusion mit einem handelsüblichen Leberperfusion Gerät. Die Verwendung einer solchen Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Umsetzung zu den klinischen und Kreuzvalidierung von unterschiedlichen Protokollen und Geräteeinstellungen zwischen Forschungsgruppen und Transplantationszentren.

<table><tbody><tr><td>Liver Assist perfusion device</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>Liver Assist disposable set</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist disposable</td><td></td></tr><tr><td>Williams&amp;rsquo; Medium E</td><td>Sigma</td><td>W1878&amp;ndash;6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Eli Lilly &amp;amp; Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>MGH pharmacy</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen gas tank 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Specialty gas regulator</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&amp;rsquo;s solution</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral buffered formalin</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Toothed Adson forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Debakey tissue forceps, 7.75&amp;rdquo;, 2.25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors 7&quot; Curved SureCut Tungsten</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Needle holder 5.5&amp;ndash;7&amp;rdquo;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 blackbraided silk sutures</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 nylon suture, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>Blood gas analysis machine</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Balance scale</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pressure display box</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pressure display sets</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Handheld thermocouple thermometer and probe</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 and EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Irrigation set flush tubing</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Mixing bowl, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

functional human liver preservation and recovery by means of subnormothermic machine perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 &#176;C.

Eine Reihe von Beobachtungen und Analysen auf die Leber während der Perfusion durchgeführt werden, einschließlich direkter aktuellen Messwerte, wie zB Durchflussraten und Galle Produktion; Echtzeitmessungen, wie zB Gasanalyse des Perfusat und Post-hoc-Messungen, die nach der Probenahme vorgenommen werden, einschließlich biochemische Analyse des Perfusat und Gewebe und histologische Analyse. Hier genannten Ergebnisse sind von 22 perfundierten menschlichen Leber. Lebern wurden zur Transplantation aus verschiedenen Gründen, einschließlich Alter des Spenders, übermäßige warmen ischämischen Zeit Biopsieergebnisse (Steatose, Entzündung, Fibrose) und logistischen Gründen abgelehnt. 18 Lebern wurden folgende Herztod nach Hirntod beschafft, und 4. In beiden Fällen wurden Spender mit 30.000 Einheiten Heparin vorbehandelt und in situ und auf der Rückseite Tisch mit UW-Lösung gespült. Mittlere kalten Ischämiezeit betrug 531 ± 237 (SD) min und die mittlere warme Ischämiezeit betrug 27 ± 10 (SD) min, vom Rückzug des Lebens gemessenUnterstützung für kalte Flush. Echtzeit-Beobachtungen und Messungen können verwendet werden, um die Leber während der Perfusion zu bewerten, während die Post-hoc-Messungen werden nach der Perfusion offenbart werden. Echtzeit-Beobachtungen Fluss durch die Leber beginnt niedriger als der Solldurchflussraten als ein Ergebnis einer höheren Widerstand im kalten Leber. Mit einem Druck von 3 mmHg für PV und 30 mmHg auf der HA die Sollströme können in der Regel einmal die Leber erreicht hat, bis zu 21 erwärmt &#160; ° C nach 60 min Perfusion (1A). Gallenfluss kann im Allgemeinen innerhalb von 10 min Perfusion festgestellt und während der Perfusion (1B) kontinuierlich hergestellt. Gallen Menge hängt von der Qualität der Leber und im Bereich von 0,3 ml / h / kg Leber bis 18 ml / min / kg. In Lebern mit längeren warmen ischämischen Zeit werden Gallenfluss neigen dazu, auslaufen, während kürzere warme Ischämiezeit führt zu einer stabilen oder sogar steigendenGalleproduktion. Echtzeit-Messungen Direkte und häufige Messung der Perfusat durch Blutgasanalyse im wesentlichen für beide Versuchszwecken sowie die Aufrechterhaltung eines angemessenen Perfusionsbedingungen, wichtiger ist die Sauerstoffversorgung und pH-Wert. Gelöster Sauerstoff-Partialdruck sollte größer als 700 mmHg auf dem Zufluss von sowohl der PV und HA ist. Abfluss Sauerstoffdruck in der Vena cava gemessen, im allgemeinen nimmt mit längeren Perfusion, was einer Erhöhung der Sauerstoffaufnahme. Sauerstoff-Aufnahmeraten kann wie zuvor 13 bis 2,4-9,7 ml O 2 / min / kg bei t = 3 h (1C) beschrieben, und reichten von 0,5 bis 2,2 ml O 2 / min / kg bei Beginn der Perfusion berechnet. Ein pH-Abfall wird in den ersten 30 min (1D) in erster Linie als ein Ergebnis von Lactat Freisetzung im Perfusat beobachtet. Dies kann durch Ergänzung mit 8,4% Natrium bicarbo unterstütztnate und nach ca. 90 min der pH-Wert fällt wieder in den normalen Bereich. Üblicherweise wird 30-50 ml 8,4% Natriumbicarbonat erforderlich. Laktatkonzentration steigt schnell in der ersten 15-30 Minuten, aber beginnt, sich nach der ersten Stunde (1E) versterben. Post-hoc-Messungen Lebertransami wie ALT kann im Perfusat gemessen werden. In den ersten 30 Minuten eine starke Zunahme von ALT wird allgemein beobachtet, die das Auswaschen von ALT, die während der Ischämie (1F) veröffentlicht wurde widerspiegelt. ALT wurde gezeigt, dass auch mit warmer Ischämiezeit 13 korrelieren. Maschine Perfusion erhöhte ATP-Gehalt 2,8-fache, was auf eine Erholung der Energiestatus (1G). H &amp; E histologische Analyse zeigt keine zusätzlichen Verletzungen während des Maschinendurchblutung (Abbildung 1 H, I) aufrechterhalten. Es sei darauf hingewiesen, dass die in diesem Protokoll vorgeschlagen Biopsieschema für RESuche und sind nicht anwendbar für klinische Zwecke sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Abb. 1: Bewertung der menschlichen Leber während des Maschinendurchblutung durch die PV und HA bei SNMP (A), Galle Produktion, quantifiziert pro Stunde Perfusion (B), Sauerstoff uprate Rate (OUR), aus der Differenz der Zufluss berechnet (PV Fluss + HA) und Abfluss (Hohlvene), unterbrochen Linien zeigen Sauerstoffpartialdrücken im Zu- und Ablauf während der Perfusion (C), pH und Laktat während der Perfusion (D, E), die Freisetzung von ALT in das Perfusat (F), ATP Gehalt im Gewebe von Stunden Biopsien (G) und H &amp; E-Flecken der Leber (54 Jahre alt DCD, 19 min warme Ischämie, 559 min kalte Ischämie) vor dem (H) und nach (I) Perfusion gemessen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Lebertransplantate in subnormothermic Temperatur (21 ° C).

Funktionale Menschliche Leber Erhaltung und Rückgewinnung mittels Subnormothermic Maschine Perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

functional-human-liver-preservation-recovery-means-subnormothermic

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School.  Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Lebertransplantate in subnormothermic Temperatur (21 ° C). 

Serie: Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for liver transplantation die without receiving an organ transplant or are delisted for disease progression. One strategy to increase the donor pool is the utilization of marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or donation after cardiac death (DCD). The current preservation technique of cold static storage is only poorly tolerated by marginal livers resulting in significant organ damage. In addition, cold static organ storage does not allow graft assessment or repair prior to transplantation.
These shortcomings of cold static preservation have triggered an interest in warm perfused organ preservation to reduce cold ischemic injury, assess liver grafts during preservation, and explore the opportunity to repair marginal livers prior to transplantation. The optimal pressure and flow conditions, perfusion temperature, composition of the perfusion solution and the need for an oxygen carrier has been controversial in the past.
In spite of promising results in several animal studies, the complexity and the costs have prevented a broader clinical application so far. Recently, with enhanced technology and a better understanding of liver physiology during ex vivo perfusion the outcome of warm liver perfusion has improved and consistently good results can be achieved.
This paper will provide information about liver retrieval, storage techniques, and isolated liver perfusion in pigs. We will illustrate a) the requirements to ensure sufficient oxygen supply to the organ, b) technical considerations about the perfusion machine and the perfusion solution, and c) biochemical aspects of isolated organs.

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or livers retrieved after cardiac death (DCD) tolerate conventional, cold static storage only poorly. We developed a novel model of subnormothermic ex vivo liver perfusion for preservation, assessment, and repair of marginal liver grafts prior to transplantation.

Technik der Subnormothermic<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Leberperfusion für die Lagerung, Bewertung, Reparatur von Marginal Lebertransplantate

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Forschung

Medizin

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Verfahren für Menschen V. saphena<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Perfusion und Außen Verstärkung

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic agent melphalan. Briefly, the procedure starts with the setup of a percutaneous veno-venous bypass from the femoral vein to the external jugular vein. Via a laparotomy, catheters are then inserted into the proper hepatic artery and the caval vein. The portal vein and the caval vein, both supra- and infrahepatically, are then clamped. The arterial and venous catheters are connected to a heart lung machine and the liver is perfused with melphalan (1 mg/kg body weight) for 60 min. This way it is possible to locally perfuse the liver with a high dose of a chemotherapeutic agent, without leakage to the systemic circulation.
In previous studies including patients with isolated liver metastases of uveal melanoma, an overall response rate of 33-100% and a median survival between 9 and 13 months, have been reported. The aim of this protocol is to give a clear description of how to perform the procedure and to discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Here, we present a protocol how to perform an isolated liver perfusion (IHP) with melphalan and we also discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Isolierte Leberperfusion als Behandlung für Lebermetastasen von Aderhautmelanom

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Ingenieurwesen

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

Ex-situ-normothermen Maschine Perfusion von Spenderlebern

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a serious problem. Therefore, the acceptance criteria for organ donors have been extended leading to the usage of marginal kidney grafts. These marginal organs tolerate cold storage poorly resulting in increased preservation injury and higher rates of delayed graft function. To overcome the limitations of cold storage, extensive research is focused on alternative normothermic preservation methods.
Ex vivo normothermic organ perfusion is an innovative preservation technique. The first experimental and clinical trials for ex vivo lung, liver, and kidney perfusions demonstrated favorable outcomes.
In addition to the reduction of cold ischemic injury, the method of normothermic kidney storage offers the opportunity for organ assessment and repair. This manuscript provides information about kidney retrieval, organ preservation techniques, and isolated ex vivo normothermic kidney perfusion (NEVKP) in a porcine model. Surgical techniques, set up for the perfusion solution and the circuit, potential assessment options, and representative results are demonstrated.

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

The severe organ shortage has resulted in increased use of marginal kidney grafts for transplantation. This has triggered interest in alternative storage methods, since marginal grafts especially tolerate cold storage poorly. The technique of normothermic ex vivo kidney perfusion (NEVKP) represents a novel preservation method for kidney grafts prior to &#160;transplantation.

Normothermen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kidney Perfusion für die Erhaltung der Nierentransplantate vor der Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Konservierung von orthotopen Schweinelebertransplantaten mittels maschineller Perfusion

Preservation of Porcine Donation after Circulatory Death (DCD) Liver by Perfusion and Orthotopic Liver Transplantation

Conventional static cold storage (SCS) exacerbates ischemic injury in the DCD liver, leading to severe complications for transplant recipients. To address this issue, clinical application of MP technology for donor liver preservation is underway. Simultaneously, efforts are focused on the development of various MP instruments, validated through relevant animal model experiments. Effective large animal trials play a pivotal role in clinical applications. However, challenges persist in the ex vivo preservation of DCD livers and the transplantation procedure in pigs. These hurdles encompass addressing the prolonged preservation of donor livers, conducting viability tests, alleviating ischemic injuries, and shortening the anhepatic phase. The use of a variable temperature-controlled MP device facilitates the prolonged preservation of DCD livers through sequential Dual Hypothermic Oxygenated Machine Perfusion (DHOPE) and Normothermic Machine Perfusion (NMP) modes. This protocol enhances the porcine OLTx model by improving the quality of DCD livers, optimizing the anastomosis technique, and reducing the duration of the anhepatic phase.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Fortschritte und Herausforderungen bei der maschinellen Perfusion für die Lebertransplantation

This protocol outlines the methodology of establishing a porcine model utilizing variable temperature-controlled Machine Perfusion (MP) for the preservation of the donor liver, followed by orthotopic liver transplantation (OLTx). It aims to promote the success rate of OLTx using donor donation after circulatory death (DCD) liver and establish a stable model.

Erhalt der Schweinespendeleber nach zirkulatorischem Tod (DCD) durch Perfusion und orthotope Lebertransplantation

Conventional static cold storage (SCS) exacerbates ischemic injury in the DCD liver, leading to severe complications for transplant recipients. To address ...

Funktionale Menschliche Leber Erhaltung und Rückgewinnung mittels Subnormothermic Maschine Perfusion

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Technik der Subnormothermic

Verfahren für Menschen V. saphena

Isolierte Leberperfusion als Behandlung für Lebermetastasen von Aderhautmelanom

Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen

Ex-situ-normothermen Maschine Perfusion von Spenderlebern

Normothermen

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

Erhalt der Schweinespendeleber nach zirkulatorischem Tod (DCD) durch Perfusion und orthotope Lebertransplantation

Erhalt der Schweinespendeleber nach zirkulatorischem Tod (DCD) durch Perfusion und orthotope Lebertransplantation

Erhalt der Schweinespendeleber nach zirkulatorischem Tod (DCD) durch Perfusion und orthotope Lebertransplantation