Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopie Experimente danken. Gregory Blass ist für kritische Korrekturlesen des Manuskripts anerkannt. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschuss HL108880 und American Diabetes Association unterstützt gewähren 1-15-BS-172 (als), und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

Tierversuche und Tierschutz sollte auf die NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren folgende Protokolle überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt einzuhalten. 1. Kidney Flush <ol><li> Verwenden Sie 8 bis 12 Wochen alte männliche Ratten (empfohlen ist ein Stamm Sprague Dawley, aber andere Stämme von unterschiedlichen Alters und Geschlechts mit entsprechenden Änderungen verwendet werden). </li><li> Betäuben das Tier nach dem Verfahren von IACUC Protokoll erlaubt; Narkosetiefe zu überwachen und zu kontrollieren das Tier. Die detaillierte Beschreibung der Operation in 1.3 durchgeführt werden - 1.8 kann in Ilatovskaya et al 7. </li><li> Nach entsprechender Anästhesie, legen Sie das Tier auf einem temperaturgesteuerten Operationstisch, einen Mittellinienschnitt des Bauches (bis zu 3 cm in der Länge), und entdecken Sie die Hohlvene und die Aorta. </li><li> Legen Ligatur um die Zöliakie und mesenterica superior Arterien und der BauchAorta über denen; nicht zu ligieren. </li><li> Stumpf sezieren der abdominalen Aorta unterhalb der Nierenarterien, und legen Sie zwei Ligaturen um ihn herum, aber nicht unterbinden, dann klemmen die Aorta oberhalb der Ligaturen und binden Sie den Unterfaden. </li><li> Katheterisierung der Aorta mit einer Polyethylen PE50-Schlauch (mit einer Spritzenpumpe mit PBS gefüllt befestigt) unterhalb der Klemme und Fixierung des Katheters mit dem zweiten Ligatur; entfernen Sie die Klammer, schalten Sie die Pumpe und ligieren der Aorta und der Mesenteriallymphknoten mit abdominaler Arterien. Schnell zu machen Einschnitt in Nierenvene, um den Druck zu entlasten. </li><li> Infundieren die Aorta mit vorgekühltem PBS für 2 oder 3 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 6 ml / min. </li><li> Stoppen Perfusion, Verbrauchsteuern und decapsulate 7 die Nieren, und legte sie auf Eis in der PBS-Lösung. Euthanize das Tier nach Protokoll IACUC genehmigt. </li></ol> 2. Isolierung des Ratten-Glomeruli <ol><li> Vorbereitung 30 ml frische Lösung von 5% BSA in RPMI 1640. </li><li> Mit einer Rasierklinge und Scheren,isolieren die Rinde beider Nieren, und dann, bis sie homogen Blatt vor den Mund. Dieses Verfahren wurde zuvor 7 beschrieben. </li><li> Schieben Sie das Gewebe während der vorherigen Schritt Hackfleisch durch ein 100-Mesh-Sieb aus rostfreiem Stahl (in 5% BSA / RPMI-Lösung vorgeweicht) mit einem Spatel. Sammeln Sie die Durchfluss und durch Schwerkraft ermöglicht die Durchfluss um durch ein 140-Mesh-Sieb passieren. </li><li> Filtern Sie die Durchfluss von den 140 mesh Sieb gesammelt unter Verwendung eines vorher eingeweicht 200-Mesh-Sieb, Filtrat verwerfen und waschen Sie die Spitze des Sieb mit 10 bis 15 ml der vorbereiteten BSA / RPMI-Lösung, um den Glomeruli, die auf sedimentieren sammeln das Sieb. </li><li> Legen Sie die BSA / RPMI-Lösung, die Glomeruli auf Eis in einem 15-ml-Tube und lassen Sie die Glomeruli Sediment am Boden des Rohres für bis zu 20 min. Glomeruli Konzentrat auf der Unterseite des Rohres deutlich sichtbar. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, so dass etwa 2 ml in die Röhre. </li></ol> 3. Single-Channel-Patch-Clamp Electrophysiology <ol><li> Bereiten Sie 5 x 5 mm Deckglas-Chips durch Beschichtung mit MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-Lysin, und trocknen lassen. Verwenden Sie ca. 30 &amp; mgr; l 0,01% steril filtriert Lösung in Wasser pro Deckglas. </li><li> Warm up die experimentellen Lösungen für RT und füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer und Pipette. Für TRPC Kanäle Überwachung, verwenden Sie ein Bad-Lösung in mM: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 Glucose, pH 7,4; Pipette: 126 NaCl, 1,5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose; pH 7,4. <ol><li> In Inhibitoren auf die Pipettenlösung, um die Aktivität von endogenen Kanäle, die nicht für die Studien (empfohlen relevanten blockieren: 100 uM Nifluminsäure oder DIDS (auf Ca 2+ -aktivierte Cl blockieren - Kanäle), 10 mM TEA (um das zu verhindern mit großer Leitfähigkeit Ca 2 + - abhängigen K + Kanal), 10 nM Iberiotoxin (um die Ca 2+ -aktivierten K + Kanäle zu blockieren), 10 &amp; mgr; M Nicardipin (N-Typ-Ca blockieren2+ Kanäle)) unmittelbar vor der Patch-Clamp-Experiment. </li></ol></li><li> Vorsichtig mischen die Glomeruli haltigen Lösung, und dann etwa 50 &amp; mgr; l davon gelten für die poly-ʟ-Lysin beschichteten Deckglas-Chips. Lassen Sie die Glomeruli legen für ca. 5 min. </li><li> Verschieben Sie die Glas-Chips mit Glomeruli auf die Patch-Clamp-Kammer mit der Badlösung vorgefüllt; versorgen die Kammer bei einer Rate von 3 ml / min für 1 min, um die Entfernung der ungebundenen Glomeruli gewährleisten. </li><li> Durchführung einer konventionellen Patch-Clamp-Experiment in einem Cell-Attached-Modus 7. Mit einer Glaspipette (7-10 MOhm Pipette Widerstand) einen hochohmigen Dichtung zwischen einer Pipette und Podozyten Membran durch leichten Sog (einer Pipette, eine Podozyten auf der Oberfläche des isolierten Glomeruli angebracht zu bilden, wird in Abbildung 2 dargestellt, auf die linke). </li><li> Für die Cell-Attached-Messungen, Tiefpass die Ströme bei 300 Hz durch einen achtpoligen Bessel-Filter. </li><li> Use isoliert Glomeruli in Patch-Clamp-Experimente für bis zu 4 - 6 Std. Bewahren Sie die Lager Glomeruli Fraktion auf Eis. </li></ol> 4. Ratiometrisch konfokalen Fluoreszenzmessungen von intrazellulären Calciumkonzentration in den Podozyten <ol><li> Platzieren Sie 500 ul der Glomeruli Fraktion (bei 2.5 beschrieben) in 0,5 ml konischen Röhrchen und fügen Kalzium Farbstoffe Fura Red, AM und Fluo-4, AM. Verwenden Sie 2 mm und 1 mm Lager Konzentrationen von Fura Red, AM und Fluo-4, AM, bzw. (bei -20 ° C, gelöst in DMSO) und verwenden Sie 2,5 ul jeder Farbstoff für ein 500 ul Glomeruli Fraktion. Unmittelbar nach der Zugabe der Farbstoffe decken das Röhrchen mit Aluminiumfolie. </li><li> Die Röhrchen auf einem rotierenden Schüttler für mindestens 20 min bis zu 1 h bei RT. Anmerkung: Die pharmakologische Mittel können während dieses Schritts zugegeben werden. </li><li> Bereiten Sie Deckgläser, decken Sie sie mit poly-ʟ-Lysin und trocknen mit beheizten Plattensatz auf 70 ° C. </li><li> Sobald die Beladung des Calcium Farbstoffe completE gelten 100 ul der Glomeruli enthaltenden Lösung auf das Poly-ʟ-Lysin beschichtete Deckgläser und ließ sie an der Oberfläche für etwa 5 min zu haften. Halterung Glomeruli losen Deck in eine Abbildungskammer und Perfusion mit dem Bad-Lösung (enthaltend (in mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7,35) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml / min zu entfernen die ungebunden Glomeruli und die verbleibenden Farbstoffe. </li><li> Stellen Sie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 488 nm Anregungswellenlänge und Emissionsfiltern (525/25 und 650/25 nm für Fluo-4 und Fura Red, respectively). Legen Sie die Imaging-Software auf eine gewünschte Frequenz und Auflösung. </li><li> Finden Sie die Glomeruli in Hellfeld und dann auf der Detektion des Fluoreszenzsignals zu drehen. Einstellen der Intensität des Laserstrahls für jeden Farbstoff, um die Sättigung des Signals zu vermeiden. Wählen der Brennebene mit den podocytes die direkt auf das Glas angebracht sind. Dies minimiert den Effekt, der durch Kontraktion eines Glomerulus verursacht in Reaktion auf ArzneimittelAnwendung. Überprüfen Sie, dass die Glomeruli der Wahl ist gut an das Glas gebunden ist; </li><li> Starten Sie die Abbildung der Brennebene der Wahl (nehmen 512 x 512 Bilder mit der Frequenz bei 4 s eingestellt, um schnelle Ca 2+ vorübergehende Veränderungen sichtbar zu machen. Verwenden Sie einen 60X / NA 1.4 oder ähnliche Objektiv für hochauflösendes Bild) gelten Drogen von Interesse, und notieren Sie die Antwort. <ol><li> Wählen einer gewünschten Fokusebene (möglichst nahe an der Oberfläche des Glases als möglich zu Bildgebung podocytes auf der Oberfläche des Glomerulus zu gewährleisten). Überprüfen Sie die Intensität der Fluoreszenz auf der Fluo4 und FuraRed Kanäle und stellen Sie sicher, dass die Glomerulus ist eindeutig in Hellfeld gesehen. </li><li> Starten Bildgebung. Vor der Anwendung von Drogen, Rekord mindestens 1 min von Fluoreszenzbasis, um sicherzustellen, dass das Signal stabil ist (es gibt keine plötzlichen Spitzen oder Verblassen des Signals). </li><li> Gelten gewünschten Medikamente mit Hilfe einer Mikropipette; vorsichtig sein und sicherstellen, das Medikament in der Lage, gut diffundieren und erreichen die glomerUlus. Mischen Sie die Badlösung vorsichtig, wenn nötig, die Überwachung der ausgewählten Brennebene und überprüfen Sie, dass es nicht aus dem Fokus wegen der Medikamentenapplikation zu bewegen. </li><li> Aufzeichnung der Änderungen der Fluoreszenzintensität für die Fluo4 und FuraRed Signalen. Achten Sie darauf, die Aufnahme ist lang genug, um zu warten, bis das Signal den Plateauniveau erreicht oder einen Spitzenwert erreicht und kehrt zum Ausgangswert dann. Führen Lösung Änderung oder Ergänzung von irgendwelchen anderen Drogen, wenn nötig. </li><li> Beenden Sie die Aufnahme, und speichern Sie die Datei im nativen Format der Software. </li></ol></li></ol> 5. Bildanalyse für die Calcium-Messungen <ol><li> Führen Sie die Bildanalyse mit dem ImageJ offene Software mit dem ND-Dienstprogramm-Plugin, das Importieren von Bildern in der nativen ND2-Format ermöglicht. </li><li> Importieren Sie die Bildsequenz; stellen Sie sicher, um die Kanäle aufgeteilt und mit einem Hyperstack-Graustufen-Modus. </li><li> Folgen Sie dem Analysieren → Werkzeuge → ROI Manager Pfad im ImageJ Software oStift ein ROI-Manager-Fenster. Wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse (Podozyten) mit einem ovalen Auswahlwerkzeug und die &quot;hinzufügen (t)&quot; Funktion in der ROI-Manager. Als das letzte ROI, wählen Sie den Bereich, in den Hintergrund; speichern Sie die ausgewählten ROIs (Mehr → Speichern). </li><li> Markieren Sie das Fenster mit der für die Analyse ausgewählten Kanal. Verwenden Sie die Optionen → Multi Funktion Messen in der ROI-Manager, markieren Sie die &quot;eine Zeile pro Scheibe&quot;-Box in der Dialog, der herausspringt, und klicken Sie dann auf OK. Die Ergebnisse werden in dem Format, das sich im Ergebnisfenster eingestellt werden kann gezeigt werden: in die Menüoption Ergebnisse → Set Maße geben, wählen Sie &quot;Mittlerer Grauwert&quot; und berechnen die Pixelintensitätswerte für jede ROI, die in der angezeigt wird, Ergebnisfenster in separaten Spalten für jede ROI. </li><li> Kopieren Sie die gemessenen ROI Intensitätswerte für jeden Kanal (Fluo-4 und Fura Red) in bevorzugten Datenanalyse-Software; subtract Hintergrund Intensitätswerte von jedem datein Punkt. </li><li> Für jeden Zeitpunkt wird das Verhältnis der Intensitäten des Fluo-4 zu Fura Red-Kanälen. Plot Scatter / Linienpunkt-Zeitänderungen von Ca 2+ Transienten für jede ROI. Berechnen Sie Mittelwert / SE Werte für ausgewählte Glomeruli. Hinweis: Zeitspalte sollte nach Bildgebungsfrequenz bei 4,5 ausgewählt eingestellt werden. </li></ol> 6. intrazellulären Calciumkonzentration Berechnungen mit Fluo-4 Fluoreszenz-Signal <ol><li> Nehmen Sie eine Probe der Glomeruli und führen Sie die experimentelle Protokoll bis zu Schritt 4.7. Nach der Aufnahme der Hintergrundfluoreszenz hinzufügen Ionomycin (Endkonzentration in der Badewanne Kammer sollte 10 &amp; mgr; M) zu der Badlösung und Rekordfluoreszenzintensität zu erhöhen. Sobald die Intensität erreicht sein Maximum und der Zerfall beginnt, fügen MnCl 2 (Endkonzentration sollte 5 mM), die Fluoreszenz 8 quenchen. </li><li> Analysieren Sie die in 6.1 erhaltenen Daten. Kopieren Sie die Fluo-4-Signal ROI Intensitätswerte erhalten nachzu der am 5.1 Protokoll - 5,5 von bevorzugten Analysesoftware. </li><li> Berechnen intrazellulären Calciumkonzentration (in nM) in der podocyte entsprechend dem ROI durch eine Formel: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> wobei K d ein vorbestimmter Dissoziationskonstante für Fluo-4 (345 nM) konstant ist F die Intensität an dem Zeitpunkt, dass man die Berechnung werden die Calciumkonzentration (Grundlinie) und F min und F max die Intensitätswerte bei der Punkt maximaler Calciumlast (nach Ionomycin Anwendung) und nach Löschung der Fluoreszenz (mit MnCl 2), bzw. (siehe Abbildung 3). </li></ol>

<ol>
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V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli.">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli.">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li><li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter.">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li><li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels:+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species.">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li><li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species.">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht die Analyse von Calcium Handhabung durch den Podozyten der Glomeruli Nagetier. Diese Technik ermöglicht die Anwendung der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Einzelkanal-Fluoreszenz ratiometrische konfokale Bildgebung. Jedoch beide Ansätze können einzeln, für sich allein verwendet werden. Das vorgeschlagene Protokoll hat mehrere relativ einfache Schritte, einschließlich 1) Nieren flush; 2) Isolierung der Glomeruli durch Differential Sieben; 3) Durchführen von Patch-Clamp-ele...

Nieren halten homöostatischen Gleichgewicht für verschiedene Stoffe und Regulierung des Blutvolumens in einer Weise, die Gesamtblutdruck bestimmt. Störungen der Nierenfiltration, Resorption oder Sekretion führen zu begleiten oder pathologische Zustände, die von Hyper- oder Hypotonie, um Nierenerkrankungen im Endstadium, die schließlich erfordert Nierentransplantation beenden. Die Nieren-Filtereinheit (Glomerulus) besteht aus drei Schichten - die Kapillarendothel, Basalmembran und eine Einzelzellschicht von Epithelzellen - Podozyten, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Spaltmembran Integrität und Funktion 1 zu spielen. Dysfunktion bei permselektiven glomerulären Filter verursacht Urinverlust von Makromolekülen, wie Proteinurie. Verschiedene Mittel können die Struktur der podocytes und deren Fuß Verfahren, die die Integrität der Glomeruli Filtrationsbarriere bestimmen beeinflussen. Die podocytes in der Aufrechterhaltung der glom beteiligtenEruli Filterfunktion. Es wurde festgestellt, dass Fehlcalcium Handhabung durch den podocyte führt zu Zellschäden und spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der verschiedenen Formen von Nephropathien 2,3. Daher ist die Entwicklung eines Modells, das für die direkte Messung der intrazellulären Calciumkonzentration Veränderungen ermöglicht wird entscheidend für die Untersuchung der Podozyten Funktion sein. Isolated Glomeruli waren zuvor in einer Vielzahl von Studien, einschließlich Messung der Albuminreflexionskoeffizient ändert 4 und Beurteilung des integralen Zellströme in den Ganzzellelektrophysiologische Patch-Clamp-Messungen 5,6 verwendet. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir das Protokoll, das die Forscher ermöglicht, intrazelluläre Calcium-Konzentration sich in Abhängigkeit von Anwendungen von pharmakologischen Mitteln zu messen, abzuschätzen Basalniveaus von Calcium in den Zellen und zu beurteilen einzelnen Calciumkanäle Aktivität. Ratometric Calciumkonzentration Messungen und Patch-Clamp-electrophysiology wurden verwendet, um Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration innerhalb des podocyte und Kanalaktivität zu bestimmen sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluo4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F14217</td>
			<td>500&#181;l in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuraRed AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F-3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-68&#160;</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3909-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon confocal microscope (inverted)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td>&#160;Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6661B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Silicone Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording/perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Pass Filter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>LPF-8</td>
			<td>8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvibration isolation table</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel valve perfusion system</td>
			<td>AutoMake Scientific</td>
			<td>Valve Bank II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording/perfusion chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp 10 . 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5904-5UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niflumic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3514-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>T2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835030</td>
			<td>without antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8327</td>
			<td>30% albumin solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td>MCW core</td>
			<td></td>
			<td>for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel sieves:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>#100 (150 &#956;m), 140 (106 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson, Inc&#160; SIEVE 3 SS FH NO200</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>50-871-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson, Inc&#160; SIEVE 3 SS FH NO270</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>50-871-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson, Inc&#160; SIEVE 3 SS FH NO400</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>50-871-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mesh 200&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4145</td>
			<td>screen for CD-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PE50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
			<td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other basic reagents</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Hier haben wir uns mit dem Problem der Messung der akuten Veränderungen der Calciumspiegel in den podocytes. 1 zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Protokolls, um eine hohe Auflösung Live Fluoreszenz konfokale Bildgebung und Einzelionenkanalaktivität in den Aufnahmen podocytes des frisch zuführen entworfen isoliert Nagetier Glomeruli. Kurz nachdem die Ratte betäubt, die Nieren sollten mit PBS gespült werden, um sie von Blut zu löschen. Dann werden die Nieren herausgeschnitten u...

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Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. 

Serie: Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...