Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopieexperimente bedanken. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health gewährt R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (nach OPO) und K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (nach OPO) und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

Die nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee am Medical College of Wisconsin und der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Figur 1 zeigt wesentliche Schritte des Gewebes Isolierung und Verarbeitungsverfahren. Kurz gesagt, werden Nieren von PCK oder SD-Ratten für die manuelle Isolierung von Epithelzellen Monoschichten von Sammelkanäle entweder von gesunden nicht-gewählten Tubuli oder Zysten verwendet. Hier untersuchten wir die Nieren 4-16 Wochen alt PCK Ratten 10,13. 1. Isolierung von Nierenzysten und Anschließen Röhrchen (CNT) / Sammelrohr (CD) Segmente <ol><li> Anesthetize Versuchstier mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) / Klasse O 2 medizinische oder einer anderen zugelassenen Methode. Die Tiere müssen ständig überwacht, um eine angemessene le zu gewährleistenvel der Anästhesie. Stabile Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen. </li><li> Zuführen Laparotomie und bündig die Nieren mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durch die abdominale Aorta 17. <ol><li> Bereiten Sie einen Polyethylenschlauch Katheter (PE50) und verbinden Sie es mit einer Spritzenpumpe mit PBS gefüllt. Schneiden Sie die Haut und Bauchwand entlang der Linea alba, dann machen Sie einen transversalen Bauchschnitt über den Bauch von Seite zu Seite und verschieben Sie die Bauchorgane mit Wattestäbchen, um Zugang zu der absteigenden Aorta mit Verzweigungen mesenterialen und Zöliakie Arterien zu erhalten. Befeuchten Sie die inneren Organe mit warmer Kochsalzlösung während der weiteren Verfahren auf ihre Trockenheit zu verhindern. </li><li> Legen Sie eine Ligatur (# 1) um die mesenterialen und Zöliakie Arterien und andere Blattschraube (# 2) um die Aorta unter der Membran (nicht binden). Vorsichtig trennen ein. abdominalis von stumpf sezieren Bindegewebe um ihn herum mit dünnen Pinzette und legen Sie zwei Ligaturen ~ 3mm unterhalb der linken Nierenarterie (# 3) und oberhalb der Darmbeinarterien Bifurkation (# 4). </li><li> Binden Sie Ligatur # 4 und fügen Sie eine Gefäßklemme um die Aorta zwischen dem linken Nierenarterie und Unterbindung # 3. Einen Einschnitt zwischen der Klemme und Unterbindung # 4, um die Aorta katheterisieren, verwenden Sie Unterbindung # 3 in die fest zu fixieren, den Katheter. </li><li> Lösen Sie die Klemme und stellen Sie sicher, dass das Blut Puls ist in dem Katheter sichtbar, um eine ordnungsgemäße Installation sicherzustellen. Starten Perfusion mit einer Rate von 6 ml / min, binden Ligaturen # 1 und # 2, und schneiden Sie die linke Nierenvene. Weiter spülen 1-2 Minuten, bis die Organe vollständig blanchiert. </li><li> Schneiden Sie renalen Blutgefäße, der Harnröhre und der umgebenden Binde- und Fettgewebe mit einer Schere, um die Nieren zu sammeln. Dann machen Sie eine kurze Riss in Nierenkapsel und ziehen die Nieren, um sie decapsulate. Legen Sie die Nieren in eiskaltem PBS. Sterbehilfe wird durch eine Thorakotomie bestätigt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 5 x 5 mm Deckglas-Chips mit Poly-L-Lysin beschichtet. Schneiden Sie ein Deckgläsernss mit einem Diamantstift und Ort etwa 20 &amp; mgr; l 0,01% steril filtriert Poly-L-Lysin-Lösung auf jedes Glas-Chip. Bereiten Kochsalzlösung und zwei Paare von Uhrmacher Zangen für die Präparation. </li><li> Schneiden die Nieren mit einer Rasierklinge entlang der Frontalebene in Scheiben von ~ 1-2 mm Dicke. Legen Sie eine der Scheiben unter einem Stereomikroskop. Isolierung von Gewebe sind in eiskalter Kochsalzlösung durchgeführt werden. </li><li> Finde Zysten unter einem Stereomikroskop als Rundform Hohlräume (2A); ihre Wände enthalten oft prominente Netzwerk von vermehrten Blutgefäße. Verwenden von spitzen Pinzette sezieren die interne Epithelschicht einer Zyste so dünn wie möglich, um eine Monoschicht-Bereich zu erhalten. Verbinden Sie es mit einem Glas-Chip mit Poly-L-Lysin bedeckt. Sticky Poly-L-Lysin-Oberfläche ermöglicht dem Forscher fest positionieren Sie den internen Zyste Schicht auf Glas. Setzen Sie die Zyste mit der apikalen Seite nach oben, um den Zugang für die Pipetten (2B) bereitzustellen. </li><li> Verwenden PCK oder SD-Ratten kidney zentralen Scheiben Papille zur Isolierung von nicht-dilatierten CNT / CCDsegments 18-21 enthalten. HINWEIS: Papillary Geweben sind haltbarer als Kortex und durch Halten papillären Rohrbänder mit einer Pinzette und Reißen entlang radialen Achse der Scheibe zu dünnen Bereichen abgespalten werden. Einzelne Tubuli sind sichtbar und können herausgezogen, um auf Deckglas-Chips platziert werden kann. </li><li> Identifizieren Sie die CNT / CCD-Segmente durch Gabelungen, höhere Transparenz als proximalen Tubuli und große deutlich sichtbare Zellen (2C). Legen Sie die Abdeckung Glas-Chip mit angeschlossenem Tubuli unter einem Mikroskop mit Mikromanipulatoren für den Antrieb von Mikropipetten ausgestattet. Mit scharfen Mikropipetten Split offenen Tubuli und befestigen ihre Ränder auf das Glas der apikalen Oberfläche zugänglich zu machen (2D). </li></ol> 2. Einzelkanal-Patch-Clamp-Elektrophysiologie <ol><li> Füllen Sie den Patch-Clamp-Kammer mit Bad-Lösung und übertragen Sie das Deckglas-Chipmit isolierten Geweben in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Patch-Clamp-Mikropipetten haben Widerstand von 7-10 MOhm für die zuverlässige On-Zelle (Cell-Attached) Messungen. </li><li> Für die Cell-Attached-Messungen, stellen Sie den Verstärkungsfaktor-Verhältnis auf 20-fach und Tiefpass die Ströme bei 300 Hz durch einen achtpoligen Bessel-Filter. ENaC-Kanäle für die Überwachung, mit einem Badlösung in mM: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); Pipette 140 LiCl, MgCl 2 2 und 10 HEPES (pH 7,4). </li><li> Durchführung einer konventionellen Patch-Clamp-Experiment in einem Cell-Attached-Modus 10. Eine Zelle in der Monoschicht epithelialer und nähern sich der Pipette in der apikalen Membran. Bilden einen hochohmigen Abdichtung zwischen einer Pipette und Zellmembran durch leichten Sog. Sobald eine high resistant Gigaohm Dichtung gebildet wird, sollte eine lückenlose Protokoll bei einem Haltepotential für die Überwachung der Aktivität des interessierenden Kanal gestartet werden. </li><li> Shop spaltfreie Einzelkanal aktuellen Daten von gigaOhm-Dichtungen für die spätere Analyse. Analysieren Sie die Kanal-Ereignisse mit Hilfe eines Software-Paket in der Regel mit Patch-Clamp-Setups 18 zugeführt. Berechnung der Kanalaktivität als NPO, wo N die Anzahl der aktiven Kanäle in der Patch und P o ist durchschnittlich Öffnungswahrscheinlichkeit der Kanäle. HINWEIS: Verwenden Sie isolierte Zysten oder Tubuli in Patch-Clamp-Experimenten für nicht mehr als 30 Minuten. </li></ol> 3. Ratiometrisch Epifluoreszenz Messungen der intrazellulären Calciumkonzentration in den Epithelzellen <ol><li> Verwenden 5 mM Fura-2AM in DMSO gelöst. Aliquot Stammlösung in einzelne 500 ul konische Röhrchen (etwa 10 &amp; mgr; l). Vor Licht und lagern in der Tiefkühltruhe bei -20 ° C für bis zu sechs Monate. </li><li> Inkubieren isolierten Zysten und Split-offenen Tubuli 30-40 min in PSS (in mM: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 und 10 HEPES bei pH 7,35), das 5 uM Fura-2 AM Farbstoff und 0,05% Pluronsäure um die Dispersion der Acetoxymethylester. Dafür Ort Gewebe in der 3,5 cm Schale mit Ladecocktail, vor Licht schützen und Inkubation auf einem langsamen Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Ändern Fura-2 AM haltigen Medien, um nach der Inkubation reinigen PSS und legen Sie das Gewebe unter dem Mikroskop zu Epifluoreszenz-Bildgebung weiter durchzuführen. </li><li> Schalten Sie CCD-Kamera und stabile Lichtquelle (Monochromator-System) mit Filterscheibe ausgestattet (jede Filterposition kann mit einer eigenen Dämpfungspegel, jedes Mal, wenn der Filter aufgerufen wird ausgewählt in Verbindung gebracht werden). </li><li> Finden Sie das Gewebe im Hellfeld. Wechseln Sie zur Detektion des Fluoreszenzsignals und stellen Sie die Intensität der Lichtquelle mit Neutralfilter und Lampenleistung, um die Sättigung des Signals zu vermeiden. </li><li> Überwachen Fura-2 AM-Fluoreszenz in der Gewebeprobe mit ratiometrische Anregung bei 340/380 nm mit einer Frequenz von 0.125 Hz oder höher. Verwenden Sie eine 40 × / NA 1.3 oder ähnliche Objektivlinse zum richtigen Resolution Bild. </li><li> Für die Bildverarbeitung und Berechnungen importieren Sie die Bildfolge. Stellen Sie sicher, um die Kanäle aufgeteilt und mit einem Hyperstack-Graustufen-Modus. Wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse (Einzelzystenzellen oder ausgewählte Bereiche der zystischen Gewebe) und berechnen Sie Intensitätswerte für jeden Kanal (340 und 380 nm) in die bevorzugten Datenanalyse-Software; subtrahieren Hintergrund Intensitätswerte von jedem Datenpunkt. </li><li> Für jeden Zeitpunkt wird das Verhältnis der Intensitäten der Fura-2 AM 340-380 Kanälen. Plot Scatter / Linienpunkt-Zeitänderungen von Ca 2+ Transienten für jede Region und berechnen Mittelwert / SE-Werte. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir hier beschriebenen Anwendungen von herkömmlichen Patch-Clamp-Technik und Epifluoreszenz Calcium Imaging, um zystische Epithelzellen-Monoschichten aus einem Maus-Modell der genetischen ARPKD abgeleitet. Das Protokoll besteht aus drei Schritten, von denen die meisten Aufmerksamkeit ist auf die Isolierung der Zysten (Schritt 1.5 der Protokolle Abschnitt) und an die elektrophysiologische Studien bezahlt werden. Diese Schlüssel Verfahren erfordern umfangreiche Schulungen und Geduld, und der Leser sollte nicht enttäusc...

Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, einschließlich Zellwachstum und Differenzierung. Autosomal dominante und rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD und ARPKD bezeichnet) sind genetische Störungen, die durch die Entwicklung von Nierenflüssigkeitsgefüllten Zysten des Rohr Epithelzelltumoren. ADPKD Mutationen von PKD1 oder PKD2 Gene Polyzystinen 1 und 2, Membranproteine ​​in der Regulation der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt kodiert verursacht. PKD2 allein oder als Komplex mit PKD1 fungieren auch als Ca 2+ durchlässige Kationenkanals 1. Mutationen des PKHD1 kodierende Gen Fibrocystin (a Zilien-assoziierten Rezeptor-ähnlichen Proteins in der Tubulogenese und / oder Wartung Polarität Epithel beteiligt sind) sind die genetischen Anstoß ARPKD 2. Zystenwachstum ist ein komplexes Phänomen mit gestörter Proliferation 3,4, Angiogenese 5, Dedifferenzierung und Verlust der polaren begleitetkeit von röhrenförmigen Zellen 6-8. Defekten Reabsorption und Sekretion in Augmented Zystenepithel tragen zu einer Flüssigkeitsansammlung in dem Lumen und Zystenexpansions 9,10. Impaired strömungsabhängige [Ca 2+] i-Signalisierung wurde auch cystogenesis während PKD 11-15 verbunden. Hier beschreiben wir eine für Patch-Clamp-Messungen von Einzelkanal-Aktivität und der intrazellulären Ca 2+ -Spiegel bei zystischer epithelialen Monoschichten von PCK Ratten isoliert Methode. Dieses Verfahren wurde von uns erfolgreich angewendet, um der Aktivität des epithelialen Na + -Kanal (ENaC) 10 charakterisieren und [Ca 2+] i -abhängigen Prozesse durch Ca 2+ durchlässige TRPV4 und purinergen Signalkaskade 13 induziert. In diesen Studien verwendeten wir PCK Ratten ein Modell ARPKD durch eine spontane Mutation in dem PKHD1 Gen verursacht. Die PCK-Stamm war originally von Sprague-Dawley (SD) Ratten 16 dadurch SD-Ratten werden als eine geeignete Kontrolle zum Vergleich mit dem PCK verwendete Stamm abgeleitet ist. Als Ergebnis können beide SD-Ratte nephron Segmenten und nicht-erweiterten Sammelkanäle vom selben PCK Ratten isoliert, wie zwei unterschiedliche Vergleichsgruppen für Versuche zur Zystenepithel dienen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Zysten Initiierung und Ausdehnung während polyzystische Nierenerkrankung ist ein komplexer Prozess, gekennzeichnet durch Abnormalitäten in Rohrzellproliferation, luminale Flüssigkeitsansammlung und die extrazelluläre Matrixbildung. Aktivität von Ionenkanälen und der intrazellulären Calcium-Signalgebung sind wichtige physiologische Parameter die Funktionen der Tubulusepithel bestimmen. Wir entwickelten ein für Echtzeit-Beobachtung von Ionenkanälen Aktivität mit Patch-Clamp-Technik, und die Registrierung der intrazellulären Ca 2+ Pegel in epithelialen Mono frisch aus Nierenzysten isoliert Methode. PCK-Ratten, ein genetisches Modell der autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD), wurden für die ex vivo Analyse der Ionenkanäle und Calciumfluss verwendet. Beschrieben wird hier eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren entwickelt, um zystische Monoschichten und nicht-dilatierten Tubuli von PCK oder normaler Sprague Dawley (SD) Ratten, zu isolieren und zu überwachen Einzelkanalaktivität und intrazelluläre Ca 2+ Dynamik.Dieses Verfahren erfordert keine enzymatische Verarbeitung und ermöglicht die Analyse in einer nativen Einstellung der frisch isolierten Epithelzellen-Monoschicht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calciumänderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen. Schließlich kann isoliert Zystenepithel weiter zum Anfärben mit Antikörpern oder Farbstoffe, wurden primäre Kulturen und Reinigung für verschiedene biochemische Assays verwendet werden.

Potential ENaC Beteiligung cystogenesis durch mehrere Studien, die gestört epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) beobachtet Signalisierung in PKD Progression 22-25 und abnorme Natriumreabsorption in ARPKD Mausmodellen und Gewebekulturen 26-28 nachgewiesen. B. Veizis et al. Zeigten, dass Amilorid-sensitive Na + -Absorption in CD-Zellen aus dem nicht-ortho BPK Mausmodell ARPKD 29 verringert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass beeinträchtigte Natrium und Wasser Rückresorpt...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Ionenkanäle in renale tubuläre Epithel ausgedrückt spielen eine bedeutende Rolle in der Pathologie der polyzystischen Nierenerkrankung. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle verwendet, um Patch-Clamp-Analyse und intrazellulären Calcium-Pegelmessungen in Zystenepithel frisch aus Nagetier Nieren getrennt durchzuführen.

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin.  Ionenkanäle in renale tubuläre Epithel ausgedrückt spielen eine bedeutende Rolle in der Pathologie der polyzystischen Nierenerkrankung. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle verwendet, um Patch-Clamp-Analyse und intrazellulären Calcium-Pegelmessungen in Zystenepithel frisch aus Nagetier Nieren getrennt durchzuführen. 

Serie: Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...