Diese Arbeit wird von der American Heart Association 14FTF20370058 (DMA) und NIH T32 HL007101-35 (DMA) unterstützt.

1. Conductance-Katheter Vorbereitungen und Druckkalibrierung <ol><li> Verbinden Konduktanz Katheters zum hämodynamischen Katheter Moduls. Elektronisch kalibriert werden Druck und Volumenmessungen durch Aufnahme voreingestellten Druck und Volumen auf dem Katheter-Modul eingestellt. Nehmen Sie eine Rückverfolgung von 0 mm Hg und 25 mm Hg (Abbildung 1A) und weisen Spannungen auf beide Druck Kurven (Abbildung 1B und 1C). Ebenso nehmen Sie eine Volumenverfolgung von 5 RVU und 25 RVU (1D) und weisen Spannungen auf beide Volumendurchzeichnungen (1E und 1F). </li><li> Bestätigen Sie die elektronische Druckkalibrierung mit einer manuellen Druckkalibrierung, mit einer Quecksilbersäule Blutdruckmessgerät. Montieren Sie die Blutdruckmanschette Port mit einem 3-Wege-Hahn. Füllen Sie ein 3-Port-Hämostase-Ventil-System, die oft für Koronarangioplastie verwendet, mit RT Wasser unter Verwendung der Seitenöffnung. <ol><li> Setzen Sie die Spitze eines Leitwert Katheter in die Flüssigkeit gefüllt Hämostaseventil und sanft zu sichern without Knicken Katheter. Schließen Sie das Hämostase-Ventil, um dem Blutdruckmesser und pumpen bis 200 mmHg und verriegeln 3-Wegehahn. Prüfen, ob der gemessene Druck entspricht dem Druck auf das Blutdruckmessgerät aufgeblasen. </li></ol></li><li> Ort Katheter in Kochsalzlösung auf 37 ° C, die auf der Ebene des Operationsfeldes und messen Druck erhitzt. Passen Druckregelung, bis die aufgezeichneten Druck auf Null steht. </li></ol> 2. Anästhesie / Intubation <ol><li> Verwalten Ketamin / Xylazin (80-100 / 10 mg kg -1) als intraperitoneale Injektion. Hinweis: Alternative Anästhetika verwendet werden. Eine umfangreiche Liste von Anästhetika in vorherigen Bewertungen dieser Technik 11,12 vorgesehen. Proper Betäubung kann durch schonende Schwanz Prise bestätigt werden. </li><li> Einmal betäubt, rasieren den Hals und Brust mit Haarschneidemaschinen und auf ein Heizkissen. Pflegen Sie die Maus rektale Temperatur bei 36,5 bis 37,5 ° C. Niedrige Körpertemperaturenwird bei depressiven Herzfrequenz führen. Bewerben Salbe auf die Augen, um Trockenheit zu verhindern </li><li> Machen Sie einen Mittellinienschnitt in den Nacken und sezieren die tracheale Muskeln weg, um die Luftröhre freizulegen. Platzieren eines Endotrachealtubus durch den Mund, während die Visualisierung der Luftröhre zu Intubation zu gewährleisten, und eine Verbindung mit dem Beatmungsgerät. </li><li> Aufrechterhaltung der Maus an dem Beatmungsgerät während des Verfahrens. Set Beatmungseinstellungen basierend auf Tiergewicht, wie zuvor beschrieben 11. Atemzugvolumen (ml) = 6,2 x (Tiergewicht in Kilogramm) 1.01 und Atemfrequenz = 53,5 x (Tiergewicht in Kilogramm) -0,26. </li></ol> 3. Platzierung von Conductance-Katheter in LV Kammer <ol><li> Karotis-Ansatz <ol><li> Um die Sterilität zu gewährleisten, sind zwei Sätze von sterilen chirurgischen Instrumenten Verwendet man für die erste Hautschnitt und eine an der Thorakotomie arbeiten. Instrumente sollten während eines einzelnen chirurgischen Sitzung ein mit einem trockenen Sterilisator zwischen Tieren dekontaminiert werdennd am Ende jedes Tages chirurgischen autoklaviert. </li><li> Nachdem die Haut wurde mit drei Zyklen einer Chlorhexidin + Alkohol Hautpeeling (0,5% Chlorhexidin / 70% Alkohollösung) dekontaminiert worden ist, einen Einschnitt über die rechte Halsschlag vom Unterkiefer bis Brustbeins. Sezieren umgebende Gewebe, um die rechte Halsfreizulegen, und schneiden den Vagusnerv, die benachbart zu der Halsschlag verläuft. </li><li> Legen Sie eine sterile 6-0 Seidennaht um das distale Ende (weg von der Brust) der Halsschlagader, binden und sicher. Stellen zwei zusätzliche Nähte unterhalb der Arteria carotis proximalen (näher an die Brust) mit dem ersten Naht lose Kopplung der Mittelnaht. Ziehen Sie das proximale Naht und sichern Sie durch Klemmung auf die Haut. Sicherzustellen, dass der Halsschlagader wurde sowohl proximal als auch distal bevor geklemmt. </li><li> Einen kleinen Einschnitt in der R. A. carotis proximal zur ersten Naht und erstrecken sich in Längsrichtung der Brust. </li><li> Legen Sie die Leitfähigkeit Katheterspitze,zuvor in warmer Kochsalzlösung für 30 Minuten durch den Einschnitt eingeweicht, in den Behälter zu sichern, den Katheter mit der mittleren Naht. </li><li> Den Katheter vorsichtig voran in der linken Herzkammer durch die Halsschlagader, während Sie den Druck-Volumen-Schleife Tracing korrekte Platzierung zu gewährleisten. Anmerkung: Die optimale Platzierung des Katheters sollte Druck-Volumen-Schleifen, die rechteckig erscheinen zu ergeben (siehe Abbildung 2). Wenn ein Widerstand für den Durchgang des Katheters auftritt, ziehen Sie sich zurück und wieder voranzubringen mit sanftem Druck. Sanfte Drehung der Katheter kann mit der Platzierung in den linken Ventrikel zu helfen. Zwingt die Leitfähigkeit Katheters kann zu schweren kardiovaskulären Komplikationen oder zur Beschädigung des Katheters zu führen. </li><li> Record Basis Druck-Volumen-Schleifen ~ 10 min nach Platzierung des Katheters und der Erzielung eines stabilen Zustand (Figur 2). </li></ol></li><li> Apical Ansatz <ol><li> In einer narkotisierten und belüftet Maus, einen Einschnitt from den Schwertfortsatz und durch die Brustwand seitlich, bis die Membran sichtbar ist geschnitten. </li><li> Geschlitzt, aber der Membran und visualisieren die Herzspitze. </li><li> Legen Sie die Leitfähigkeit Katheter in die Spitze des linken Ventrikels durch ein Nadelstichverletzung (unter Verwendung eines 25-30 G-Nadel), bis die proximale Elektrode ist nur innerhalb der Herzkammer. </li><li> Nehmen Sie Grundlinie Druck-Volumen-Schleifen ~ 10 min nach Katheterplatzierung und der Erzielung eines steady state. </li></ol></li></ol> 4. Unterschiedlich Nachlast Mit Transient Aortenokklusionsvorrichtung <ol><li> Um transiente Aortenokklusionsvorrichtung durchführen, stellen einen kleinen horizontaler Schnitt in der oberen Brust und umgebendes Gewebe zu sezieren, um die Quer Aorta freizulegen. </li><li> Legen Sie eine 6-0 Seidenligatur unterhalb des Quer Aorta. Nach dem Druck-Volumen-Schleifen wurden auf die Grundlinie zurückkehrte, umklammern die beiden Enden des Nahtmaterials mit einem Nadelhalter, vorsichtig und langsam die Naht über 1-2 sec zu erhöhen, und die Spannung langsam freisetzen. </li&gt; <li> Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis drei separate optimale Aufnahmen sind aus dem gleichen Tier gemacht. Anmerkung: Optimale Aufnahmen sollte mindestens 5 Druckvolumen Schleifenzyklen und einen stetigen Anstieg der endsystolischen Drücke während der Anwendung der Spannung auf das Nahtmaterial (3A und 3C) haben. </li></ol> 5. Unterschiedlich Preload Mit Transient Untere Hohlvene Occlusion (IVC) <ol><li> Um transiente unteren Hohlvene Okklusion durchführen, stellen einen horizontalen Schnitt unterhalb des Schwertfortsatz unterhalb der Membran, um den IVC aussetzen. </li><li> Legen Sie eine 6-0 Seidenligatur unterhalb des IVC. Nach dem Druck-Volumen-Schleifen wurden auf die Grundlinie zurückkehrte, umklammern die beiden Enden des Nahtmaterials mit einer Nadelklemme; langsam und vorsichtig anheben Naht über 1-2 sec, und die Spannung langsam loslassen. IVC Okklusion kann auch durch die sanfte Anwendung von Druck mit einem Wattetupfer durchgeführt werden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis drei separate optimale Aufnahmen made von demselben Tier. Anmerkung: Optimale Aufnahmen sollte mindestens 5 Druckvolumen Schleifenzyklen und einen stetigen Rückgang der linksventrikulären enddiastolischen Druck während des Anlegens der Spannung auf das Nahtmaterial haben (4A und 4B). </li></ol> 6. Saline Kalibrierung <ol><li> Am Ende der Studie kann eine Parallelleitfähigkeit (V p) Wert erhalten durch Injektion von 10 &amp; mgr; l Bolus von hypertonen Salzlösung (15%) in das Tier über die Jugularvene (5A und 5B). Anmerkung: Diese Bolus eine scheinbare Volumenzunahme ohne Druckänderung zu bewirken. Diese scheinbare Volumenänderung die Folge einer Änderung in der Blutpool Leitfähigkeit statt aufgrund einer tatsächlichen Volumenzunahme. Ein vorübergehender Rückgang der dP / dt max kann beobachtet werden, wie hypertoner Saline hat eine negative inotrope Wirkung 13. Der errechnete V p entlang in Druck Volumen-Schleife-Analyse-Software eingegeben werdenmit den Küvetten-Kalibrierungsparameter zu und konvertieren von RVUs in Mikroliter. </li></ol> 7. Küvetten-Kalibrierung <ol><li> Um eine Küvetten-Kalibrierung durchzuführen, setzen Sie eine Küvette mit Vertiefungen von bekannten Durchmesser des Herstellers auf einem Heizkissen oder ein Wasserbad gestellt auf 37 ºC. Füllen Sie die ersten 4-5 Löcher mit frischem warmem heparinisiertem Blut von Mäusen unterziehen hämodynamischen Einschätzungen. Hinweis: Eine Küvette Kalibrierung ermöglicht die genaue Beurteilung der linksventrikulären Blut-Pool mit der Maus Blut und ermöglicht die Umwandlung von Volumendaten aus RVUs auf Mikroliter. </li><li> Legen Sie die Leitfähigkeit Katheter in die erste Bohrung, bis alle Elektroden eingetaucht sind. Den Katheter zu bewegen vorsichtig in den Brunnen, die unterschiedlichen RVUs generieren. </li><li> Notieren Sie die Leitfähigkeit Änderungen im Volumen Kanal in RVUs. Wählen Sie die höchste RVU für die Kalibrierung. Hinweis: Das Volumen der Vertiefungen können entweder durch 1 unter Verwendung der Gleichung für das Volum berechnet)e eines Zylinders, wobei der Radius der des Küvettenvertiefung und die Länge ist von der Länge zwischen den inneren zwei Sensorelektroden oder 2) die Überprüfung in den Anweisungen des Herstellers berechnet. Der Leitwert Ausgang kann mit den bekannten Volumina korreliert werden, um eine Kalibrierungsgleichung, die die Daten in RVUs Mikroliter 11 wandelt entwickeln. </li></ol> 8. Euthanasie <ol><li> Beim Abschluß des Protokolls werden die Mäuse mit zervikale Dislokation während der Narkose eingeschläfert. </li><li> Um zu gewährleisten, Tod, Mäuse unterzogen wurden Genickbruch muss eine sekundäre Methode der Euthanasie unterzogen werden. Wir verwenden Ausbluten unter Narkose, mit Ernten von Herzgewebe für Experimente oder bilaterale Thorakotomie unter Narkose. </li></ol> 9. Datenanalyse unter Verwendung von Druck Volumen Loop-Analyse-Software <ol><li> Berechnen V p von Saline Kalibrierung <ol><li> Wählen Sie Druck und volume Schleifen während der Ausstoß von hypertonen Kochsalzlösung erhalten (5A und 5B) </li><li> Export-Schleifen, um Druckvolumen-Analyse-Software. Option für Saline-Kalibrierung wählen (5C) </li><li> Tragen Sie die berechnete V p-Wert (5D). Hinweis: Die V p-Wert wird durch die Ermittlung der Schnittpunkt der 1) enddiastolische Volumen vs. endsystolische Volumen aus der Kochsalzlösung Kalibrierung und 2) enddiastolische Volumen = End-systolischen Volumen Linie berechnet. Der Schnittpunkt dieser Linien stellt die V p, die durch die Druck-Volumen-Schleife Analysesoftware berechnet wird. </li></ol></li><li> Geben Leitfähigkeit, um die Lautstärke (RVU) Verhältnis des Volumens Kanaloptionen (1F) </li><li> Messen Sie Baseline-Druck-Volumen-Loop-Verhältnis <ol><li> Wählen 8-10 Herzzyklen aus Druck und Volumen-Kanäle einmal stabilen Zustand erreicht worden ist (2A) und der Ausfuhr nach Analyse weichenware. Identifizieren 5-6 endexspiratorischen Schleifen (2B) </li><li> Benutzen Sie die V p-Wert für die Parallelleitfähigkeit zu korrigieren. Wählen Sie die Option &quot;Steady State&quot; und erzeugen eine hämodynamische Übersichtstabelle (2C) </li></ol></li><li> Maßnahme Druck-Volumen-Schleife von Beziehungen während Aortakonstriktion <ol><li> Wählen 8-10 Herzzyklen aus Druck und Volumen Kanäle, die Aortakonstriktion vor der Erhöhung des enddiastolischen Druck (3A) und den Export an die Analysesoftware übereinstimmen. Identifizieren Sie 5-6 endexspiratorischen Schleifen (3C) </li><li> Wählen Sie &quot;Kontraktilität&quot; Analyse (3B), die die End-systolischen Druck Mengenverhältnis berechnet wird (ESPVR) </li></ol></li><li> Maßnahme Druck-Volumen-Schleife von Beziehungen während des IVC Verengung <ol><li> Wählen 8-10 Herzzyklen aus Druck und Volumen Kanäle, die IVC Verengung entsprechen (Figure 4A) und den Export in Analyse-Software. Identifizieren 5-6 endexspiratorischen Schlaufen (4B) </li><li> Wählen Sie &quot;Kontraktilität&quot; Analyse (3B), die Preload rekrutierbar Schlagarbeit berechnet werden (PRSW) (4C), Maximum dP / dt vs EDV (4D), sowie die ESPVR und End-diastolische Druck Volumen Beziehung (Abbildung 4E) </li></ol></li></ol>

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	<li>Clark, J. E., Marber, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+pressure-volume+catheter+technology+-+stress+remodelling+after+infarction.">Advancements in pressure-volume catheter technology - stress remodelling after infarction.</a> Exp Physiol. 98 (3), 614-621 (2013).</li><li>Sunagawa, K., Maughan, W. L., Burkhoff, D., Sagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+interaction+with+arterial+load+studied+in+isolated+canine+ventricle.">Left ventricular interaction with arterial load studied in isolated canine ventricle.</a> Am J Physiol. 245 (Pt 1), H773-H780 (1983).</li><li>Suga, H., Sagawa, K., Demer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+instantaneous+pressure+in+canine+left+ventricle.+Time+and+volume+specification.">Determinants of instantaneous pressure in canine left ventricle. Time and volume specification.</a> Circ Res. 46 (2), 256-263 (1980).</li><li>Suga, H., Sagawa, K., Shoukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+independence+of+the+instantaneous+pressure-volume+ratio+of+the+canine+left+ventricle+and+effects+of+epinephrine+and+heart+rate+on+the+ratio.">Load independence of the instantaneous pressure-volume ratio of the canine left ventricle and effects of epinephrine and heart rate on the ratio.</a> Circ Res. 32 (3), 314-322 (1973).</li><li>Kass, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+left+ventricular+mechanics+from+acute+VDD+pacing+in+patients+with+dilated+cardiomyopathy+and+ventricular+conduction+delay.">Improved left ventricular mechanics from acute VDD pacing in patients with dilated cardiomyopathy and ventricular conduction delay.</a> Circulation. 99 (12), 1567-1573 (1999).</li><li>Kass, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diastolic+Compliance+of+Hypertrophied+Ventricle+Is+Not+Acutely+Altered+by+Pharmacological+Agents+Influencing+Active+Processes.">Diastolic Compliance of Hypertrophied Ventricle Is Not Acutely Altered by Pharmacological Agents Influencing Active Processes.</a> Annals of Internal Medicine. 119 (6), 466-473 (1993).</li><li>Georgakopoulos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+murine+left+ventricular+pressure-volume+relations+by+miniaturized+conductance+micromanometry.">In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry.</a> Am J Physiol. 274 (4 pt 2), H1416-H1422 (1998).</li><li>Cingolani, O. H., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-volume+relation+analysis+of+mouse+ventricular+function.">Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (6), H2198-H2206 (2011).</li><li>Baan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Measurement+of+Left-Ventricular+Volume+in+Animals+and+Humans+by+Conductance+Catheter.">Continuous Measurement of Left-Ventricular Volume in Animals and Humans by Conductance Catheter.</a> Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).</li><li>Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+considerations+in+catheter+based+estimation+of+left+ventricular+volume.">Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2010, 3556-3558 (2010).</li><li>Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cardiac+function+using+pressure-volume+conductance+catheter+technique+in+mice+and+rats.">Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (1038).</li><li>Hanusch, C., Hoeger, S., Beck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthesia+of+small+rodents+during+magnetic+resonance+imaging.">Anaesthesia of small rodents during magnetic resonance imaging.</a> Methods. 43 (1), 68-78 (2007).</li><li>Georgakopoulos, D., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+parallel+conductance+by+dual-frequency+conductance+catheter+in+mice.">Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279 (1), H443-H450 (2000).</li><li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+myocardial+contractility+and+enhanced+exercise+function+in+transgenic+mice+overexpressing+either+adenylyl+cyclase+5+or+8.">Increased myocardial contractility and enhanced exercise function in transgenic mice overexpressing either adenylyl cyclase 5 or 8.</a> Basic Res Cardiol. 103 (1), 22-30 (2008).</li><li>Kohout, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+cardiac+contractility+mediated+by+the+human+beta(3)-adrenergic+receptor+overexpressed+in+the+hearts+of+transgenic+mice.">Augmentation of cardiac contractility mediated by the human beta(3)-adrenergic receptor overexpressed in the hearts of transgenic mice.</a> Circulation. 104 (20), 2485-2491 (2001).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin-biased+AT1R+stimulation+promotes+cell+survival+during+acute+cardiac+injury.">beta-Arrestin-biased AT1R stimulation promotes cell survival during acute cardiac injury.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (8), H1001-H1010 (2012).</li><li>Suga, H., Sagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+Interrelationship+between+Instantaneous+Ventricular+Pressure-Volume+Ratio+and+Myocardial+Force-Velocity+Relation.">Mathematical Interrelationship between Instantaneous Ventricular Pressure-Volume Ratio and Myocardial Force-Velocity Relation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 1 (2), 160-181 (1972).</li><li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+energetics.">Ventricular energetics.</a> Physiol Rev. 70 (2), 247-277 (1990).</li><li>Kass, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+contractile+state+on+curvilinearity+of+in+situ+end-systolic+pressure-volume+relations.">Influence of contractile state on curvilinearity of in situ end-systolic pressure-volume relations.</a> Circulation. 79 (1), 167-178 (1989).</li><li>Little, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+left+ventricular+dP/dtmax-end-diastolic+volume+relation+in+closed-chest+dogs.">The left ventricular dP/dtmax-end-diastolic volume relation in closed-chest dogs.</a> Circ Res. 56 (6), 808-815 (1985).</li><li>Glower, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearity+of+the+Frank-Starling+relationship+in+the+intact+heart:+the+concept+of+preload+recruitable+stroke+work.">Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work.</a> Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).</li><li>Sharir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+systolic+assessment+in+patients+with+dilated+cardiomyopathy+by+preload-adjusted+maximal+power.+Validation+and+noninvasive+application.">Ventricular systolic assessment in patients with dilated cardiomyopathy by preload-adjusted maximal power. Validation and noninvasive application.</a> Circulation. 89 (5), 2045-2053 (1994).</li><li>Baan, J., Van der Velde, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+left+ventricular+end-systolic+pressure-volume+relation+to+type+of+loading+intervention+in+dogs.">Sensitivity of left ventricular end-systolic pressure-volume relation to type of loading intervention in dogs.</a> Circ Res. 62 (6), 1247-1258 (1988).</li><li>Wei, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+catheter+parallel+conductance+varies+between+end-systole+and+end-diastole.">Volume catheter parallel conductance varies between end-systole and end-diastole.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 54 (8), 1480-1489 (2007).</li><li>Porterfield, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+correction+for+parallel+conductance,+GP,+and+gain+factor,+alpha,+in+invasive+murine+left+ventricular+volume+measurements.">Dynamic correction for parallel conductance, GP, and gain factor, alpha, in invasive murine left ventricular volume measurements.</a> J Appl Physiol (1985). 107 (6), 1693-1703 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein Verfahren zur perfoming Druck-Volumen-Schleife Analyse unter Verwendung einer Leitfähigkeits Katheter in Mäusen, umfassende Analysen sowohl kardialen Kontraktilität und Relaxation abzuleiten. Suga, Sagawa und Kollegen verwendete Druck-Volumen-Schleifen, um Maßnahmen der kardialen Kontraktilität, insbesondere die Steigung der ESPVR oder das endsystolische Elastanz (E n) und E max definieren. Elastanz, die durch das Verhältnis von Druck zu Volumen (P / V) definiert ist, vari...

Herzdruckvolumen Schleife Analyse liefert detaillierte Informationen über die Herzfunktion und sind der Goldstandard für die funktionelle Beurteilung 1. Während bildgebende Verfahren wie Echokardiographie oder Kardio-MRT liefern funktionelle Maßnahmen Diese Maßnahmen sind in hohem Maße von Lastbedingungen. Lastunabhängige Maßnahmen der kardialen Kontraktilität und Entspannung erfordern dynamische Messungen des ventrikulären Druck und Volumen Verhältnis über einen Bereich von Vor- und Nachlast. Das Verständnis für die Druck-Volumen-Verhältnis ergibt sich aus der bahnbrechenden Arbeiten von Sagawa und Kollegen 2,3. Sie zeigten in ex vivo perfundierten Hundeherzen, dass die Druck-Volumen-Schleife abgeleitet Kontraktilität Maßnahmen waren unabhängig von Belastungsbedingungen 4. In vivo Anwendung dieser Analysen wurde mit der Entwicklung der Leitfähigkeit Katheter in den 1980er Jahren möglich. Dieser technische Fortschritt erlaubt Kass und Kollegen, um Druck-Volumen-Schleife Analyse beim Menschen 5,6 durchzuführen. Miniaturisierung Konduktanz Katheter und Verbesserungen der chirurgischen Techniken in den späten 1990er Jahren 7 hergestellt Analyse Nagetier Herzfunktion durchführbar ist, so dass für genetische und pharmakologische Studien durchgeführt werden. Dieser Fortschritt hat seitdem führen zu dem weit verbreiteten Einsatz von Druck-Volumen-Loop-Analyse und hat ein hohes Maß an Einblick in Säugerherzphysiologie generiert. Ein Schlüsselkonzept bei der Verwendung der Leitfähigkeit Katheter und der Interpretation der Daten daraus zu erhalten ist das Verhältnis zwischen Volumen und Leitfähigkeit besitzen. Leitfähigkeit umgekehrt proportional zur Spannung, die mit einem Katheter mit Elektroden proximal angeordnet, in der Regel unterhalb der Aortenklappe angeordnet und distal im LV-Apex 8 gemessen wird, verwandt. Änderungen in der Spannung oder Konduktanz durch Stromänderungen von proximal nach distal Elektrode fließt, gemessen. Obwohl die Blut-Pool beitragens wesentlich zur Leitfähigkeit der Beitrag der Ventrikelwand, bezeichnet als Parallelleitfähigkeit (V p), gemessen Leitfähigkeit muss abgezogen werden, um absolute LV Volumenmessungen zu erhalten. Die Verfahren, um diese Korrektur durchzuführen, eine sogenannte Salz Kalibrierung sind in der nachstehenden Protokolls erörtert. Die mathematische Beziehung zwischen der Leitfähigkeit und des Volumens durch Baan und Mitarbeitern beschrieben ist, dass Volumen = 1 / α; (ρ L 2) (GG p), wobei α = einheitliches Feld Korrekturfaktors, ρ = Blutwiderstand, L = Abstand zwischen den Elektroden, G = Leitfähigkeit und G p = Nichtblutleitfähigkeit 9. Zu beachten ist, das gleichmäßige Feldkorrekturfaktor bei Mäusen 1,0 nähert aufgrund kleiner Kammervolumen 10. Mit Druckwandler gekoppelt ist, stellt die Leitfähigkeit Katheter in Echtzeit gleichzeitige Druck- und Volumendaten. Cardiac pressure-Volumenanalyse zeigt besondere Vorteile gegenüber anderen Maßnahmen der Herzfunktion, da sie die für die Messung der Herzfunktion unabhängig von Belastungsbedingungen und der Herzfrequenz. Spezifische lastunabhängigen Herzindizes Kontraktilität sind: End-systolischen Druck Volumen Beziehung (ESPVR), d P / d t max -Ende-diastolische Volumen bezogen, maximal Elastance (E max) und Vorspannung rekrutierbar Schlagarbeit (PRSW). Eine Last-unabhängiges Maß für diastolischen Funktion ist die enddiastolischen Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR) 11. Das folgende Protokoll beschreibt das Verhalten der Herzdruckvolumen Schleifenanalyse, unter Verwendung sowohl einer Karotis und eine apikale Ansatz. Während die Methodik, diese Studien durchzuführen sind im Detail zuvor 8,11 beschrieben worden ist, werden wir wichtige Schritte zu überprüfen, um genaue Druck-Volumen-Messung, einschließlich Kochsalzlösung und Küvetten-Kalibrierungskorrektur zu erhalten, und eine visuelle Demonstration von these Verfahren. Forschung mit Tieren aus für diese Studie durchgeführt wurde nach anerkannten Protokollen und Tierschutzvorschriften der Duke University Medical Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee behandelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AnaSed (xylazine)&#160;</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>NADA no. 139-236</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset (ketamine)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>440842</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIP3000</td>
			<td>Matrx Medical Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Model 683</td>
			<td>Surgical Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1049</td>
			<td>Surgical Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket&#160;</td>
			<td>Kaz Inc.</td>
			<td>5628</td>
			<td>Surgical Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Optical Inc.</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Surgical Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Cole&#8211;Parmer</td>
			<td>41720</td>
			<td>Surgical Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont no. 55 Dumostar Forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps, curved&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11052-10</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC31 forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14512-15</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>14041-10</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>12501-13</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen&#8211;Hegar needle holder&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>15610-08</td>
			<td>Surgical Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable underpads</td>
			<td>Kendall/Tyco Healthcare</td>
			<td>1038</td>
			<td>Surgical Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze sponges, sterile&#160;</td>
			<td>Dukal</td>
			<td>62208</td>
			<td>Surgical Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped applicators, sterile&#160;</td>
			<td>Solon</td>
			<td>368</td>
			<td>Surgical Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture,&#160; silk, 6-0&#160;</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>FT-639-1</td>
			<td>Surgical Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cc Insulin syringes&#160;</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>329412</td>
			<td>Surgical Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Access-9&#8482; Hemostasis Valve</td>
			<td>Merit Medical&#160;</td>
			<td>MAP111</td>
			<td>Hemodynamic equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphygmomanometer</td>
			<td>Baumanometer</td>
			<td>320</td>
			<td>Hemodynamic equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millar PV system MPVS-300/400 or MPVS Ultra (includes calibration cuvette)</td>
			<td>ADInstruments Inc</td>
			<td></td>
			<td>Hemodynamic equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4F conductance catheter&#160;</td>
			<td>ADInstruments Inc</td>
			<td>SPR-839</td>
			<td>Hemodynamic equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 4/30 with Chart Pro</td>
			<td>ADInstruments Inc.</td>
			<td>ML866/P</td>
			<td>Hemodynamic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>animal clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intradermic tubing PE-10 (Becton Dickinson, cat. no. )</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>427401</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intradermic tubing PE-50 (Becton Dickinson, cat. no.)</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>427411</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle assortment (18, 25 and 30 gauge; Thomas Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% (wt/vol) sodium chloride injection, USP , cat. no. )</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC no. 0409-4888-50</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox (Alconox Inc.) for catheter cleaning</td>
			<td>ADInstruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cardiac pressure-volume loop analysis using conductance catheters in mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Druck-Volumen-Loop-Analyse kann verwendet werden, um die Herzfunktion in gentechnisch veränderten Mäusen, 14,15 oder Mäusen unterziehen Arzneimittelstudien 16 zu messen. Repräsentative Druckvolumen Schlaufen sind aus früher veröffentlichten Arbeit 16 Untersuchung der Wirkung von ß-Arrestin voreingenommen AT1R Liganden, TRV120023. Um zu testen, ob TRV120023 wirkt sich die Herzfunktion in vivo, wurde Druck-Volumen-Loop-Analysen zu Wildtyp-Mäusen, die herkömmliche und neua...

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Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac Druck-Volumen-Loop-Analyse mit Conductance-Katheter bei Mäusen

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

cardiac-pressure-volume-loop-analysis-using-conductance-catheters

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Aufrufe.  Duke University Medical Center. Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters. 

Serie: Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Forschung

Biologie

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Measurement of Leaf hydraulische Leitfähigkeit und stomatäre Leitfähigkeit und ihre Antworten auf Bestrahlungsstärke und Dehydration Mit dem Evaporative Flux-Methode (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, morphological leaf traits have the potential to summarize plants strategies in terms of water use efficiency, growth pattern and nutrient use. The leaf economics spectrum (LES) is a recognized framework in functional plant ecology and reflects a gradient of increasing specific leaf area (SLA), leaf nitrogen, phosphorus and cation content, and decreasing leaf dry matter content (LDMC) and carbon nitrogen ratio (CN). The LES describes different strategies ranging from that of short-lived leaves with high photosynthetic capacity per leaf mass to long-lived leaves with low mass-based carbon assimilation rates. However, traits that are not included in the LES might provide additional information on the species&#39; physiology, such as those related to stomatal control. Protocols are presented for a wide range of leaf functional traits, including traits of the LES, but also traits that are independent of the LES. In particular, a new method is introduced that relates the plants&#8217; regulatory behavior in stomatal conductance to vapor pressure deficit. The resulting parameters of stomatal regulation can then be compared to the LES and other plant functional traits. The results show that functional leaf traits of the LES were also valid predictors for the parameters of stomatal regulation. For example, leaf carbon concentration was positively related to the vapor pressure deficit (vpd) at the point of inflection and the maximum of the conductance-vpd curve. However, traits that are not included in the LES added information in explaining parameters of stomatal control: the vpd at the point of inflection of the conductance-vpd curve was lower for species with higher stomatal density and higher stomatal index. Overall, stomata and vein traits were more powerful predictors for explaining stomatal regulation than traits used in the LES.

Unraveling how physiology and morphology are linked allows a deeper understanding of mechanistic functioning of plant leaves. We present both a procedure to derive parameters of stomatal regulation from stomatal conductance measurements and correlations with traditional functional leaf traits.

Bezug stomatäre Leitfähigkeit zu Blatt Funktionale Merkmale

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the mouse provides great potential to explore cardiac function at the molecular level. The mouse&#39;s small size does present some challenges in regards to performing detailed cardiac phenotyping. Miniaturization and other advancements in technology have made many methods of cardiac assessment possible in the mouse. Of these, the simultaneous collection of pressure and volume data provides a detailed picture of cardiac function that is not available through any other modality. Here a detailed procedure for the collection of pressure-volume loop data is described. Included is a discussion of the principles underlying the measurements and the potential sources of error. Anesthetic management and surgical approaches are discussed in great detail as they are both critical to obtaining high quality hemodynamic measurements. The principles of hemodynamic protocol development and relevant aspects of data analysis are also addressed.

This manuscript describes a detailed protocol for the collection of pressure-volume data from the mouse.

Mess Druck Volumen Loops in der Maus

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the ...