The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.

Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der australischen Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken durchgeführt. Das Protokoll für diese Studie wurde von der Royal North Shore Hospital Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt. Weiblich Fischer 344 Ratten (F344, 150-200 g) wurden am Kearns Einrichtung gepflegt, Kölling Institute unter Standardbedingungen (12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklen und den freien Zugang zu Nahrung und Wasser). Hinweis: Ein Flussdiagramm für alle experimentellen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Herstellung von Zellen zur Implantation <ol><li> Kultur die Ratte Mesotheliom II-45-Zelllinie (auch als IL-45 bekannt, durch peritoneale Einführung von Krokydolith Asbest abgeleitet) in RPMI 1640 (RPMI) Medien mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt und wachsen in Standardbedingungen (37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2). Maintain von Passagieren und Sub-Kultur bei etwa 01.50 zweimal in der Woche in einem 75 cm 2-Kolben. </li><li> Vorbereitung Reagenzien für die Zellkultur und warme Aliquots bei 37 ° C. Erforderlichen Reagenzien umfassen serumfreiem RPMI-Medium (SFM), RPMI mit 10% FBS, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 0,5% Trypsin-EDTA. </li><li> Kulturzellen für die Implantation auf etwa 70-80% Konfluenz. Dies gewährleistet, die sie in der linearen Wachstumsphase befinden. </li><li> Ernten der Zellen durch Verwerfen der Medien, einmaliges Waschen mit 5 ml steriler PBS und dann Zugabe von 3 ml 0,5% Trypsin-EDTA. </li><li> Zurückzukehren Kolben in den Inkubator für ungefähr 5 min, bis alle Zellen sich nicht haft. </li><li> Sobald Zellen nicht adhärente, 3 ml RPMI mit 10% FBS, um das Trypsin zu inaktivieren. Sammeln und Zentrifuge Zellen bei 300 × g für 3 min. </li><li> Waschen Sie das Zellpellet in 10 ml SFM und Zentrifuge wieder bei 300 × g für 3 min. </li><li> Wash Zellpellet wieder mit 10 ml SFM und Zentrifuge wie oben. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml SFM und führen eine Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers oder ähnliche Instrumente. </li><li> Verdünnte Zellen, so dass 100 &amp; mgr; l der Menge an zu implantierenden Zellen enthält. Hinweis: Das Tumorwachstum wurde in einer Dosis von nur 100 Zellen in 100 &amp; mgr; l, aber eine Standarddosis beträgt 500.000 Zellen in 100 &amp; mgr; l nachgewiesen. </li><li> Eine ausreichende Zellen in Medien für die Anzahl der Ratten, implantiert werden (dh 100 ul / Ratte), plus mindestens 0,5 ml zusätzliches, um Verluste aus Grundierung und das Totvolumen der Nadel zu kompensieren. </li><li> Bereiten Sie ausreichend SFM (ohne Zellen), um in den Kontrollratten (dh 100 &amp; mgr; l / Ratte) implantiert werden, plus mindestens 0,5 ml Kosten. Hinweis: Die Zellen und SFM sind nun bereit für die Implantation. Sie sollten bei 37 ° C gelagert und innerhalb von 2 h nach der Ernte implantiert, um die Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten. </li></ol> 2. In-vivo-Implantation von Zellen<ol><li> Setzen Sie den F344-Ratte (&gt; 13 Wochen alt) in die Induktionskammer und betäuben mit 1,4% Isofluran Einatmen (oder das Verfahren im Einsatz in der Anlage). Sobald die Ratte scheint eingeschlafen verschieben Sie es von der Kammer auf einen Nasenkegel (mit 1,4% Isofluran fließt) zu sein, legen Sie es auf seiner Rückseite mit der Brust nach oben (ventral). Dies ermöglicht der inneren Organe von Brustkorb zu regeln. Überprüfen Reflexe nach institutionellen Protokolle, um die Ratte zu gewährleisten ist vollständig betäubt. </li><li> Rasieren sich das Recht regio costalis (Brust) Bereich, um den Pelz zu entfernen. </li><li> Reinigen Sie den rasierten Bereich mit 80% v / v Ethanol. </li><li> Identifizieren Sie die Injektionsstelle: auf der rechten Seite, finden Sie die 2. Drüse starting Schädel. Die Injektionsstelle ist 0,5 cm proximal dazu, zwischen der 3. und 4. Rippe vom kaudalen Ende des Brustkorbs. (2A). </li><li> Vorsichtig mischen die II-45-Zellen zu resuspendieren. Langsam ziehen die Zellsuspension (oder SFM für Kontrollratten) in ein 1 ml &amp;# 160; Spritze ohne Nadel auf. Wenn eine Nadel für die Erstellung von Zellen angebracht gibt es das Potenzial für die Zellen entlang des Nadeleinspritzleitung zu wachsen. Befestigen Sie eine 23G x 1¼ Nadel. Prime die Nadel, und entfernen Sie alle Luftblasen. </li><li> Sobald die Spritze und Nadel grundiert sind, legen Sie eine 20 mm lange und 5 mm Durchmesser Distanzstück über den Nadelschaft. Dies wird verwendet, um die Nadel zu tiefes Eindringen in die Pleurahöhle während der Injektion zu verhindern. Ca. 5 mm-12 mm der freiliegende Nadel ist ausreichend für Penetration durch die Rippen ohne Beschädigung keine Organe. </li><li> Langsam die Nadel zwischen den Rippen, zurückziehen auf der Spritze, um sicherzustellen, ein Blutgefäß gestochen haben (kein Blut sollte in der Spritze angezeigt) dann spritzen 100 ul Zellen oder SFM. (2B). </li><li> Entfernen Sie die Nadel und sanft rollen die Ratte von Seite zu Seite, um Zellen in der Brusthöhle zu verbreiten. </li><li> Legen Sie die Ratten in einen Käfig und überprüfen Sie für die Wiederherstellung. The rat sollte wach innerhalb von 1 min und Starten zu bewegen sein. </li><li> Wiederholen Sie für jede Ratte mit einer neuen Nadel. Wiederverwendung der gleichen Nadel wird in das Zellwachstum entlang der Einspritzleitung der Nadel führen. </li><li> Überwachen Sie das Wohlbefinden der Tiere täglich. </li><li> Euthanize Tiere auf ethisch definierten Endpunkten, wie durch die institutionelle Tierethikkommission geregelt. Die ethischen Endpunkte für die Ratten in diesen Experimenten waren Gewichtsverlust von mehr als 10% oder Atemnot. </li></ol> 3. Schwanzvene Blutentnahme <ol><li> Wenn Blut sofort nach der Zellimplantation gesammelt werden, halten Sie die Ratten betäubt. Wenn Blutentnahme zu einem anderen Zeitpunkt, zu betäuben die Ratten mit 1,4% Isofluran Einatmen. Überprüfen Reflexe nach institutionellen Protokolle, um die Ratte zu gewährleisten ist vollständig betäubt. </li><li> Legen Sie die Ratte auf die Seite und suchen Sie eine laterale Schwanzvene. </li><li> Sterilisieren Sie den Schwanz mit 80% Ethanol und kennzeichnen einen 0,5 ml EDTA collection Rohr. </li><li> Um Blut zu sammeln, immer an der kaudalen Ende des Schwanzes zu starten (etwa ein Drittel des Weges entlang). Hierdurch lassen sich weitere Versuche näher an dem kranialen Ende des Schwanzes, falls der erste Versuch fehlgeschlagen ist. Resample nie kaudal, da dies ein Blutgerinnsel verursachen. </li><li> Positionieren Sie eine 23G x 1¼ Nadel parallel zur Seiten Vene und schieben Sie sie in die Vene in einem flachen Winkel, damit es etwa dringt 10 mm (3A). </li><li> Hinweis: Wenn die Vene wurde erfolgreich punktiert Blut wird in der Anlage Ende der Nadel (3B) zu sehen sein. </li><li> Ein Tropfen Blut wird auf dem Schwanz an der Stelle der Punktion zu bilden. Sammeln Sie diese Blut mit einer Pipette und Transfer in den markierten 0,5 ml (oder kleiner) EDTA Sammelröhrchen. Für die Immunzelltest 25 ul ausreichend. Bewerben Gaze mit Druck, um vor Ort, bis die Blutung aufhört zu punktieren. </li><li> Flick das Blutröhrchen, um das Blut und EDTA zu mischen, um prVeranstaltung Blutgerinnung. Halten die Zeit zwischen Blutentnahme und Mischen mit dem EDTA so kurz wie möglich, um ein Gerinnen zu verhindern. </li><li> Beim Sammeln von Blut von mehreren Ratten store EDTA-Blutproben in einem Rack bei RT bis zur Analyse. Prozess Blut innerhalb von 2 h der Sammlung. </li></ol> 4. Probenvorbereitung für die Immunzell-Profiling Mit dem Bead-basierte Verfahren Anmerkung: Diese Plattform Verfahren beruht auf der Verwendung von kommerziell erhältlichen absoluten Zählrohre, die eine bekannte Anzahl von Kügelchen für jede Probe zu haben. Diese Röhren enthalten lyophilisierte Pellets, die während der Probenvorbereitung zu lösen, die Freigabe der Perlen. Die Perlen werden fluoreszenzmarkierte und durch Gating auf dem Beadpopulation können absolute Zählungen berechnet werden. <ol><li> Stellen Sie sicher, das EDTA Vollblut-Probe ist, indem sie auf eine langsame Rotationsmischer für mehrere min gut gemischt. Beschriften Sie eine absolute Zählrohr für jede Probe. Ein Pellet, das die Kügelchen sollten unter t sichtbar seiner Metallwulst Halter an der Unterseite des Rohres. </li><li> Übertragen Sie 25 ul EDTA-Vollblut in ein beschriftetes absolute Zählrohr. Der Wulst Pellet wird nach Zugabe des Blutes zu lösen. </li><li> Zu jedem Röhrchen werden 20 ul Anti-Ratten-T / B / Natural Killer (NK) Cocktail wurden 10 ul Anti-Ratten-CD8a PE, 10 ul anti-Ratten-CD4 (Domäne 1) FITC und 10 ul Anti-Ratten CD45 PE / Cy7 (4A). Fluorophore sind in Tabelle 1 definiert. </li><li> Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz (300 × g), um sicherzustellen, dass die Antikörper und Zellen in der Unterseite des Rohres und nicht auf die Seite der Röhre stecken. Vortex mischen und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Lyse der roten Blutzellen werden 400 ul 10 mM Tris, 0,15 M Ammoniumchloridpuffer (pH 7,5) und Vortex gemischt. Lyse abgeschlossen ist, wenn die Probe wird durchlässig und nicht trübe (4B und C). Nichtbeachtung Lyse die Probe vollständig führen wird zunehmend Hintergrund und falsch erhöhten zählt bei der Analyse mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> 5. Durchflusszytometrische Verarbeitung von Proben Hinweis: Führen Sie auf einem Farb 4 Durchflusszytometer. <ol><li> Öffnen Sie die Software im Erfassungsmodus und eine neue Vorlage mit 8 Parzellen, wie in Abbildung 5 dargestellt. </li><li> Anpassen von Geräteeinstellungen mit den in Tabelle 1 aufgelistet sind und bis Gate R1 gesetzt (FITC [FL-1] gegenüber APC [FL-4]), Abbildung 5Ai), um die fluoreszierende Kügelchen zählen. Die anderen Tore sind nicht so wichtig in dieser Erfassungsstufe wird aber für die Analyse erforderlich. Die absolute Zählung mit Beads in diesem Protokoll verwendet werden, enthalten fluoreszierende Farbstoffe und kann in jedem Kanal erkannt werden, obwohl schwächsten im Blaukanal sind. </li><li> Mit Hilfe eines vorbereiteten Steuer Blutprobe, Wirbel und dann auf das Zytometer laden und bei niedriger Geschwindigkeit (12 &amp; mgr; l / min) auf Setup-Modus laufen, so dass die Datenerfassung Gates eingestellt werden kann. </li><li> Stellen Sie die Übernahme zusammeln 10.000 Veranstaltungen in der R1-Wulst Tor. </li><li> Einen Ordner, um Daten aufzuzeichnen und setzen Dateinummer und Label Beispieldatei in Nahme-Menü eingestellt. </li><li> Legen Sie die Probe auf die Durchflusszytometer analysiert werden und stellen Sie die Durchflussrate bis mittel (35 &amp; mgr; l / min). Ausführung jeder Probe bei der gleichen Fließgeschwindigkeit. Die Durchflussmenge muss möglicherweise zu niedrig (12 &amp; mgr; l / min) oder hohe (60 &amp; mgr; l / min) variiert werden, aber im allgemeinen Medium geeignet ist. Bei diesem Tempo etwa 90 bis 120 Sekunden dauert es bis zu 10.000 Wulst Ereignisse für jede Probe zu erwerben. </li><li> Sobald die Probe geladen beobachten Sie die Streudiagramme, um sicherzustellen, Ereignisse werden in der R1-Wulst-Gate erscheinen. Ursprünglich es kann einige Instabilität in der Probendruck verursachen Drift der Streudiagramme können. Warten auf diese zu stabilisieren. </li><li> Einmal stabilisiert, klicken Sie erwerben und ermöglichen Probe zu laufen. Sobald das Zytometer Erwerb 10.000 Wulst Veranstaltungen in R1 beendet das Zytometer stoppt den Erwerb und speichern Sie alle Daten. </li><li> Entfernen Sie die Probe und entsorgen fließen tusein. Das Durchflusszytometer ist nun bereit für die nächste Probe. Führen Sie alle Proben und dann den Analysemodus gehen. </li></ol> 6. Immune Cell Analysis Hinweis: Gating Strategien und Boolesche Algebra werden verwendet, um jede Zellpopulation zu definieren. Boolesche Algebra ist ein Logik-Analyseverfahren, die für mehrere Operationen in einer einzigen Definition erlaubt. Die Analysesoftware des Durchflusszytometers (zB BD Cellquest) ermöglicht die Verwendung der Booleschen Algebra. Die Gleichungen werden verwendet, um aktiv für die erheblichen negativen Reaktivität, die bei der Definition der Zelle, um genauer zu identifizieren jede Zellpopulation unterstützt Konto. &quot;Regionen&quot; werden verwendet, um ein &quot;Tor&quot; zu definieren. Regionen definieren einen 2-dimensionalen Raum in der Erwägung, Tore können aus zahlreichen Regionen, die von algebraischen Operatoren verbunden zusammengesetzt sein (+, *, -, die in Tabelle 2 definiert ist). <ol><li> Schalten Sie die Software den Analysemodus. Eine Analyse Vorlage sollte erzeugt werden, um zu entsprechen <strong&gt; Abbildung 5 mit den gezeigten Grundstücke und Tore. </li><li> Analyse jede einzelne Datei (dh jeder einzelnen Probe) getrennt. Richten Toren R1 bis R9 und dann die Algorithmen für jeden Zelltyp festgelegt, wie in Tabelle 2 definiert ist (auch in 5 gezeigt). </li><li> Verwenden Sie den Zellstatistikzähler, um einzelne Zellpopulationen durch Tore und Algorithmen (Tabelle 2 und Abbildung 5) definiert berechnen. Die Algorithmen werden Zellzahlen automatisch in der Zelle Statistikzähler einzustellen. </li><li> Berechnen Zell-Untergruppen unter Verwendung der folgenden Gleichung: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53019/53019eq1.jpg" /> Hinweis: Die Anzahl der Zellereignisse gezählt wird (zB CD4 T-Zell-Ereignisse) wird unter Verwendung der obigen Gleichung auf die Zellzahl pro Mikroliter Blut zu geben zählt. Beispiele sind in Abbildung 5 dargestellt. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Dieses Papier Details eines Verfahrens zur Erzeugung eines Ratten syngenen orthotopische Modell Pleuramesothelioms und ein einfaches Verfahren zur Überwachung der Krankheitsfortschritt durch Längs Blutentnahme. Der II-45-Modell wurde durch Aussetzen Fischer 344 Ratten, die Asbestfasern 13 entwickelt. Obwohl diese Exposition stellt die wahre Dynamik der Host-asbest Immunsystem Wechselwirkungen für Mesotheliom Pathogenese, hat es eine lange Verzögerungszeit (unter Jahre zur Erze...

Malignes Mesotheliom (MM) ist eine aggressive Krebserkrankung, die aus transformierten Zellen in der Membran (Mesothel) entsteht, die Linien der Lunge und der Bauchhöhle, des Herzens und inneren Geschlechtsorgane, und ist die häufigste primäre Tumor der Lunge Hohlraum oder Pleura 1,2 . Die Exposition gegenüber Asbestfasern einen Anteil von 80% der MM, und während Verbote Asbest Verwendung wurden vor Jahrzehnten in den meisten westlichen Ländern eingeführt wurde, hat seine weit verbreitete Verwendung in der Gemeinschaft ein tödliches Erbe hinterlassen. Die Weltgesundheitsorganisation schätzt, dass 107.000 Menschen weltweit sterben jedes Jahr an asbestbedingten Krankheiten, mit Sterblichkeit weiter zu. Eine neue Nichtberufseinfallswelle wird auch Schwellen- und gibt es wenig Verständnis bei, und auf welcher Ebene dies 3 Höhepunkt erreichen. Die Mehrheit der Menschen mit MM spät diagnostiziert, wenn eine systemische Chemotherapie ist eine der einzige praktikable Möglichkeiten 4. Die effective Chemotherapie und aktuelle &quot;Standardtherapie&quot; (zusammen mit Cisplatin 5 Pemetrexed) wurde vor über 10 Jahren identifiziert. Allerdings Scheitern dieser Behandlung ist unvermeidlich, und es gibt keine bewährten zweiten Zeilenoptionen, so dass Patienten mit einem grimmigen Prognose und mediane Überlebenszeit von nur 12 Monate 2. Daher besteht ein dringender ungedeckten Bedarf nach effektiveren Behandlungen. Trotz der Untersuchung einer Reihe von neuartigen Therapien in klinischen Versuchen keine entsprechen Veränderungen in der Praxis geführt. Dies ist zum Teil auf den niedrigen (5%) Übertragung der vorklinischen Ergebnissen, im allgemeinen in Xenotransplantat-Mausmodellen durchgeführt, um die klinische Einstellung 6-8. Solche Modelle nicht getreu rekapitulieren die komplexen Aspekte der Tumor-Mikroumgebung in unphysiologischen Orten auftreten, häufig in Abwesenheit eines funktionierenden Immunsystems 9. Syngenen orthotopen Modelle schaffen eine deutlich realistischere Tumorumgebung als die commonly verwendet subkutane Xenograft-Modellen als die Tumoren in der korrekten physiologischen Ort mit einem intakten Immunsystem 10,11 erfolgen. Der größere Umfang der Ratte erhöht seine Verwendung als Nagetierkrankheitsmodell, vor allem in der Arzneimittelstudien, in denen serielle Blutabnahmen erforderlich sind, um die Behandlung angesprochen und Toxizität 12 zu bewerten. Ferner ist in Modellen, in dem Verlaufskontrolle schwierig ist aufgrund der Lage der Tumoren (wie zum Beispiel in der Pleurahöhle), die Fähigkeit zur Überwachung Krankheitsprogression über Faktoren im Blutkreislauf gefunden ist äußerst attraktiv. Die Erzeugung eines syngenen orthotopen Modell des Pleuramesotheliom mit immunkompetenten Ratten beschrieben. Darüber hinaus ist eine einfache und relativ nicht-invasive Verfahren zur Überwachung pleuralen Fortschreiten der Krankheit durch Messen zirkulierenden Immunzellen beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA Collection tube (0.5ml)</td>
			<td>Greiner Bio One GmbH</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat T/B/NK Cell cocktail</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558509</td>
			<td>anti-Rat CD3&#160; APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RAT CD8a PE&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200608</td>
			<td>(IgG1vClone G28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>203406</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD45 PE/Cy7&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202214</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruCount&#8482; Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340334</td>
			<td>Box of 50 absolute counting tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Scientifix</td>
			<td>FBS500-S (lot# 010101-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago AB</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23Gx1&#188; Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fischer 344 Rat</td>
			<td>Animal Resources Centre, Perth Australia</td>
			<td>F344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.S.O (Isoflurane USP)</td>
			<td>Veterinary Companys Australia (VCA)&#160;</td>
			<td>B7058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II-45 Rat Mesothelioma line</td>
			<td>Zurich University</td>
			<td></td>
			<td>Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur&#8482; 4 colour</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>342975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Machine (The stinger)</td>
			<td>Advanced Anaesthesia specialists</td>
			<td>#00449</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model

Die enorme Zunahme des Interesses an immun-basierte Behandlungsmethoden für Krebs wie Impfstoffe und Immun Checkpoint-Inhibitoren und einem besseren Verständnis der Rolle der Tumor-Mikroumgebung in Ansprechen auf die Behandlung, die gemeinsam auf den Bedarf an immunkompetenten orthotopen Modelle zur präklinischen Versuchsreihen zeigen dieser neuen Therapien. Dieses Papier zeigt, wie Sie eine orthotope immunkompetenten Ratten-Modell von Pleura malignen Mesotheliom zu etablieren. Verlaufskontrolle in orthotopische Modell wird durch die interne Anordnung der Tumoren confounded. In Längsfortschreiten der Krankheit und ihre Wirkung auf zirkulierende Immunzellen in dieser und anderen Rattenmodellen von Krebs zu überwachen, ein einziges Rohr Durchflusscytometrieassay erfordert nur 25 ul Vollblut beschrieben. Dies stellt eine genaue Quantifizierung von sieben Immunparameter: Gesamt Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile, sowie die T-Zell-Untergruppen CD4- und CD8, B-Zellen und natürliche Killerzellen. Verschiedene U-Booteets dieser Parameter sind nützlich bei verschiedenen Umständen und Modelle mit Neutrophilen Lymphozytenverhältnis mit dem größten Nutzen für die Überwachung der Progression der Erkrankung in der Mesotheliom Modell. Analysieren zirkulierenden Immunzellen Ebenen mit diesem einzigen Röhre Verfahren kann auch bei der Überwachung der Reaktion auf immunbasierten Behandlungen und das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen, die den Erfolg oder Misserfolg der Behandlung zu unterstützen.

Die in dieser Studie für die Erzeugung eines orthotopische Modell Pleuramesothelioms mit II-45-Zellen verwendete Verfahren resultierte in Tieren erliegen Mesotheliom auf reproduzierbare und schnelle Zeitrahmen, wobei keine Ratten sterben aufgrund der Implantationsverfahren. Titration der Anzahl der Zellen bestimmt, dass implantierte 1x 10 3 Zellen war die Mindestanzahl für eine vollständige Penetranz Modell (100% Verpflanzung) nötig. Die unterschiedliche Anzahl von Zellen in den Ratten implantiert veränd...

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Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model | Medicine | Video

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Die Erzeugung eines orthotopischen Rattenmodell der pleuralen malignes Mesotheliom durch Implantation von II-45 Mesotheliomzellen in die Pleurahöhle von immunkompetenten Ratten dargestellt. Eine durchflusszytometrische Verfahren zu sieben Immunzelluntergruppen in diesen Tieren aus einem 25 &amp; mgr; l Blutprobe zu analysieren, wird ebenfalls beschrieben.

Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

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9.1K Aufrufe.  Royal North Shore Hospital, University of Sydney.  Die Erzeugung eines orthotopischen Rattenmodell der pleuralen malignes Mesotheliom durch Implantation von II-45 Mesotheliomzellen in die Pleurahöhle von immunkompetenten Ratten dargestellt. Eine durchflusszytometrische Verfahren zu sieben Immunzelluntergruppen in diesen Tieren aus einem 25 & mgr; l Blutprobe zu analysieren, wird ebenfalls beschrieben. 

Serie: Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Orthotopen Aorten-Transplantation: Ein Rattenmodell die Entwicklung von chronischen Vaskulopathie Study

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Forschung

Medizin

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

Orthotopen Xenografting of Human Luciferase-Tagged malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen für In vivo Prüfung von Kandidaten Therapeutika

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

Die Polyvinylalkoholschwamm Modell Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Chirurgische Verfahren für eine Ratte Modell Teilweise Lebertransplantation mit arteriellen Rekonstruktion

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Optimierte System for Cerebral Perfusion Überwachung im Rat Stroke Modell Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

Reduzierte Komplikationen nach arterieller Wiederverbindung in einem Rattenmodell der orthotopischen Lebertransplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...