The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti in conformità alle raccomandazioni del Codice di condotta australiano per la cura e l&#39;uso di animali a scopi scientifici. Il protocollo per questo studio è stato approvato dal ospedale cura degli animali e Comitato Etico Royal North Shore. Femmina ratti Fischer 344 (F344, 150-200 g) sono stati mantenuti presso l&#39;impianto di Kearns, Kolling Istituto in condizioni standard (cicli giorno / notte 12 ore di luce e il libero accesso a cibo e acqua). Nota: Un diagramma di flusso per tutte le procedure sperimentali è presentato in Figura 1. 1. Preparazione di cellule per l&#39;impianto <ol><li> Culture mesotelioma rat II-45 linea cellulare (noto anche come IL-45; derivato dall&#39;introduzione peritoneale di amianto crocidolite) in RPMI 1640 (RPMI) supporto integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e crescere in condizioni standard (37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2). Maintain da passaging e sub-coltura di circa 01:50 due volte alla settimana in un pallone 75 cm 2. </li><li> Preparare i reagenti per la coltura cellulare e delle aliquote caldo a 37 ° C. Reagenti necessari sono i media siero libero RPMI (SFM), RPMI con 10% FBS, tampone fosfato salino (PBS) e 0,5% tripsina-EDTA. </li><li> Celle di coltura per l&#39;impianto a circa il 70-80% di confluenza. Questo assicura che siano in fase di crescita lineare. </li><li> Celle di raccolta scartando media, lavare una volta con 5 ml di PBS sterile e quindi aggiungendo 3 ml di 0,5% tripsina-EDTA. </li><li> Fiaschi Rientro in incubatrice per circa 5 minuti fino a quando tutte le cellule diventano non-aderenti. </li><li> Una volta che le cellule non sono aderenti, aggiungere 3 ml di RPMI con 10% FBS per inattivare la tripsina. Raccogliere e cellule centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li> Lavare il pellet cellulare in 10 ml di SFM e centrifugare di nuovo a 300 xg per 3 min. </li><li> Pellet Lavare nuovamente con 10 ml di gestione sostenibile delle foreste e centrifugare come sopra. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di SFM ed eseguire una conta di cellule utilizzando un emocitometro o strumentazione simile. </li><li> Diluire le cellule in modo che il 100 microlitri contiene la quantità di cellule da impiantare. Nota: La crescita tumorale è stata dimostrata alla dose partire da 100 cellule in 100 microlitri ma una dose standard è di 500.000 cellule in 100 microlitri. </li><li> Preparare cellule sufficiente in mezzi per il numero di ratti da impiantare (cioè, 100 microlitri / ratto), più almeno 0,5 ml extra per compensare le perdite di innesco e il volume morto dell&#39;ago. </li><li> Preparare sufficiente SFM (senza celle) da impiantare in ratti di controllo (ad esempio, 100 l / ratto), maggiorato di almeno 0,5 ml in più. Nota: Le celle e SFM sono ora pronti per l&#39;impianto. Essi dovrebbero essere tenuti a 37 ° C e impiantati in 2 ore di raccolta per mantenere la vitalità. </li></ol> 2. In vivo impianto di cellule<ol><li> Posizionare il ratto F344 (&gt; 13 settimane di età) nella camera di induzione e anestetizzare con l&#39;1,4% inalazione isoflurano (o il metodo in uso nella struttura). Una volta che il topo sembra essere mossa addormentato dalla camera di un cono (con 1,4% isoflurano scorre), posizionarlo sul dorso con petto rivolto verso l&#39;alto (vista ventrale). Ciò permette gli organi interni di stabilirsi lontano dalla cavità toracica. Controllare riflessi secondo protocolli istituzionali per garantire il ratto è completamente anestetizzato. </li><li> Shave il diritto regio costalis (petto) zona per rimuovere il pelo. </li><li> Pulire la zona rasata con l&#39;80% v / v di etanolo. </li><li> Identificare il sito di iniezione: a destra, trova il 2 ° ghiandola partire cranica. Il sito di iniezione è di 0,5 cm dalla presente, tra il 3 ° e 4 ° costola dalla fine caudale della gabbia toracica. (Figura 2A). </li><li> Mescolare delicatamente le cellule II-45 per sospendere di nuovo. Disegnare lentamente la sospensione cellulare (o SFM per ratti di controllo) in un 1 ml &amp;# 160; siringa senza ago inserito. Se l&#39;ago è fissato per l&#39;elaborazione di cellule vi è la possibilità per le cellule di crescere lungo la linea di iniezione ago. Collegare un 23G x 1¼ ago. Prime l&#39;ago e rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Una volta che la siringa e l&#39;ago sono pronti, inserire lungo a 20 mm e 5 mm di diametro distanziale sull&#39;albero ago. Questo è utilizzato per evitare che l&#39;ago penetri troppo in profondità nella cavità pleurica durante l&#39;iniezione. Circa 5 mm-12 mm dell&#39;ago esposto è sufficiente per la penetrazione attraverso le nervature senza ledere organi. </li><li> Lentamente inserire l&#39;ago tra le costole, disegnare di nuovo sulla siringa per assicurare un vaso sanguigno non è stato perforato (sangue dovrebbe apparire nella siringa) iniettare 100 cellule microlitri o SFM. (Figura 2B). </li><li> Rimuovere l&#39;ago e rotolare delicatamente il topo da un lato all&#39;altro per diffondere le cellule nella cavità toracica. </li><li> Posizionare il topo in una gabbia e verificare la presenza di recupero. The ratto dovrebbe essere sveglio entro 1 min e iniziando a muoversi. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per ogni ratto con un nuovo ago. Riutilizzo lo stesso ago si tradurrà in crescita cellulare lungo la linea di iniezione dell&#39;ago. </li><li> Monitorare il benessere degli animali quotidiana. </li><li> Eutanasia animali a endpoint eticamente definiti come disciplinato dalla commissione etica animale istituzionale. Gli endpoint etiche per i ratti in questi esperimenti sono stati la perdita di peso superiore al 10% o respiro affannoso. </li></ol> 3. Coda Vena Raccolta di sangue <ol><li> Se il sangue deve essere raccolto subito l&#39;impianto post-cellule, mantenere il topo anestetizzato. Se il campionamento del sangue in un altro punto del tempo, anestetizzare il topo con l&#39;1,4% inalazione isoflurano. Controllare riflessi secondo protocolli istituzionali per garantire il ratto è completamente anestetizzato. </li><li> Posizionare il ratto su un lato e individuare una vena della coda laterale. </li><li> Sterilizzare la coda con l&#39;80% di etanolo e l&#39;etichetta di un 0,5 ml di EDTA ctubo ollection. </li><li> Per raccogliere il sangue, avviare sempre alla fine caudale coda (circa un terzo del cammino lungo). Questo permette ulteriori tentativi più vicino alla fine craniale della coda nel caso il primo tentativo non è riuscito. Mai ricampionamento caudalmente come questo può causare un coagulo di sangue. </li><li> Posizionare un 23G x 1 ¼ ago parallelamente alla vena laterale e farlo scorrere in vena con un angolo basso in modo che penetra circa 10 mm (figura 3A). </li><li> Nota: Se la vena è stato perforato con successo sangue sarà visibile alla fine fissaggio dell&#39;ago (Figura 3B). </li><li> Una goccia di sangue si forma sulla coda al sito della puntura. Raccogliere questo sangue con una pipetta e trasferimento nelle etichettati 0,5 ml (o più piccolo) tubo di raccolta EDTA. Per i test delle cellule immunitarie di 25 ml è sufficiente. Applicare una garza con la pressione di perforare sito fino a quando si arresta l&#39;emorragia. </li><li> Flick il tubo di sangue per mescolare il sangue e EDTA a prcoagulazione evento. Mantenere il tempo tra la raccolta del sangue e la miscelazione con l&#39;EDTA più breve possibile per prevenire la coagulazione. </li><li> Quando raccolta di sangue da più ratti negozio campioni EDTA di sangue in un rack a temperatura ambiente fino al momento dell&#39;analisi. Sangue processo in 2 ore di raccolta. </li></ol> 4. Preparazione del campione per immunitario Profiling cellulare applicando il metodo di-Bead Nota: Questo metodo piattaforma singola si basa sull&#39;utilizzo in commercio tubi di conteggio assoluti che hanno un numero noto di perline per ogni campione. Questi tubi contengono pastiglie liofilizzate che si sciolgono durante la preparazione dei campioni, rilasciando le perline. Le perle sono fluorescente e gating sulla popolazione di sfere, conte assolute può essere calcolato. <ol><li> Assicurarsi che il campione di sangue intero EDTA è ben mescolato ponendolo su un miscelatore rotante lento per diversi minuti. Etichettare una provetta di conteggio assoluto per ogni campione. Un pellet contenente le perline dovrebbe essere visibile sotto tegli titolare tallone metallico sul fondo della provetta. </li><li> Trasferire 25 ml di EDTA sangue intero in una provetta di conteggio assoluto etichettati. Il pellet tallone si dissolverà dopo l&#39;aggiunta del sangue. </li><li> Per ogni tubo aggiungere 20 ml di anti-ratto cocktail T / B / Natural Killer (NK), 10 ml di anti-ratto CD8a PE, 10 ml di anti-topo CD4 (dominio 1) FITC e 10 ml di anti-ratto CD45 PE / Cy7 (Figura 4A). Fluorofori sono definiti in Tabella 1. </li><li> Centrifugare brevemente tubo (300 xg) per assicurare gli anticorpi e le cellule sono nella parte inferiore del tubo e non attaccato al lato del tubo. Vortex per miscelare e incubare per 15 minuti a RT. </li><li> Per lisare i globuli rossi aggiungono 400 ml di 10 mM Tris, 0,15 M tampone cloruro di ammonio (pH 7.5) e agitare per mescolare. Lysis è completa quando il campione appare traslucido e non nuvoloso (figure 4B e C). La mancata lisare il campione completamente porterà ad aumentared fondo e falsamente elevati conteggi durante l&#39;analisi mediante citometria a flusso. </li></ol> 5. citometria a flusso Trattamento dei campioni Nota: eseguire su un colore 4 citofluorimetro. <ol><li> Aprire il software in modalità di acquisizione e un nuovo modello con 8 lotti come illustrato nella Figura 5. </li><li> Regolare le impostazioni dello strumento a quelli elencati nella Tabella 1 e impostare cancello R1 (FITC [FL-1] contro APC [FL-4]), figura 5Ai) per contare le perline fluorescenti. Le altre porte non sono importanti in questa fase di acquisizione ma saranno necessari per l&#39;analisi. Il conteggio assoluto sfere utilizzate in questo protocollo contengono coloranti fluorescenti e possono essere rilevati in qualsiasi canale, anche se sono più deboli nel canale blu. </li><li> Utilizzando un campione di sangue di controllo preparato, vortice e poi caricare sul citometro e correre a bassa velocità (12 ml / min) su modalità di configurazione in modo da porte di acquisizione dati può essere regolata. </li><li> Impostare l&#39;acquisizione diraccogliere 10.000 eventi nella porta tallone R1. </li><li> Impostare una cartella per registrare i dati e impostare il numero di file e file di esempio etichetta nel menu di acquisizione. </li><li> Caricare il campione da analizzare sul citometro e impostare la velocità di flusso medio (35 microlitri / min). Eseguire ogni campione alla stessa portata. La portata può essere necessario variare a bassa (12 ml / min) o alto (60 microlitri / min), ma è generalmente appropriata medio. A questo ritmo ci vogliono circa 90 a 120 secondi per acquisire 10.000 eventi tallone per ciascun campione. </li><li> Una volta che il campione è stato caricato guardare i grafici a dispersione per assicurarsi che gli eventi appaiono nella porta tallone R1. Inizialmente ci può essere una certa instabilità nella pressione del campione provocando deriva nelle trame dispersione. Attendere che questo si stabilizzi. </li><li> Una volta stabilizzato, clicca su acquisire e consentire campione per l&#39;esecuzione. Una volta che il citometro ha terminato l&#39;acquisizione di 10.000 eventi tallone nella R1 citometro si fermerà l&#39;acquisizione e salvare tutti i dati. </li><li> Rimuovere il campione e gettare flusso tuessere. Il citometro è ora pronto per il campione successivo. Eseguire tutti i campioni e poi procedere alla modalità di analisi. </li></ol> 6. immunitario Analisi cellulare Nota: le strategie di gating e algebra booleana vengono utilizzate per definire ogni popolazione cellulare. Booleana è un metodo di analisi logica based che consente più operazioni in un&#39;unica definizione. Il software di analisi del citometro di flusso (ad esempio, BD CellQuest) consente l&#39;utilizzo di booleana. Le equazioni sono usati per rappresentare attivamente per il notevole reattività negativa che assiste nella definizione della cella per identificare più specificamente ciascuna popolazione cellulare. &#39;Regioni&#39; sono usati per definire una &#39;porta&#39;. Regioni definiscono uno spazio bidimensionale 2 mentre porte possono essere composti di numerose regioni collegate da operatori algebrici (+, *, -, definito nella tabella 2). <ol><li> Passare il software di modalità di analisi. Un modello di analisi dovrebbe essere generato in modo che corrisponda <strong&gt; Figura 5 con le trame e cancelli riportati. </li><li> Analizzare ogni singolo file (ad esempio, ogni singolo campione) separatamente. Impostare cancelli R1 fino alla R9 e quindi impostare gli algoritmi per ogni tipo di cellula, come definito nella tabella 2 (mostrato anche in figura 5). </li><li> Utilizzare il contatore statistiche cella per calcolare popolazioni di cellule individuali definiti da cancelli e algoritmi (Tabella 2 e Figura 5). Gli algoritmi regoleranno automaticamente i numeri di cellulari nel contatore statistiche cellulari. </li><li> Calcola sottopopolazioni cellulari utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53019/53019eq1.jpg" /> Nota: Numero di eventi cellulari contati (ad esempio, gli eventi di cellule T CD4) viene enumerato utilizzando l&#39;equazione di cui sopra per indicare il numero di cellule per ml di sangue. Esempi sono mostrati in Figura 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Kao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+mesothelioma.">Malignant mesothelioma.</a> Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).</li><li>Zucali, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+biology+of+malignant+pleural+mesothelioma.">Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma.</a> Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).</li><li>Olsen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+malignant+mesothelioma+after+exposure+to+asbestos+during+home+maintenance+and+renovation.">Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation.</a> Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).</li><li>Zucali, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidylate+synthase+and+excision+repair+cross-complementing+group-1+as+predictors+of+responsiveness+in+mesothelioma+patients+treated+with+pemetrexed/carboplatin.">Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin.</a> Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).</li><li>Vogelzang, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+study+of+pemetrexed+in+combination+with+cisplatin+versus+cisplatin+alone+in+patients+with+malignant+pleural+mesothelioma.">Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma.</a> J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).</li><li>Lowenstein, P. R., Castro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncertainty+in+the+translation+of+preclinical+experiments+to+clinical+trials.+Why+do+most+phase+III+clinical+trials+fail?.">Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail?.</a> Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).</li><li>Kamb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+wrong+with+our+cancer+models.">What's wrong with our cancer models.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).</li><li>Yakisich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Algorithm+for+the+Preclinical+Screening+of+Anticancer+Drugs+Effective+against+Brain+Tumors.">An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors.</a> ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).</li><li>Basu, D., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+microenvironments+within+mouse+models+that+enhance+tumor+aggressiveness.">Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness.</a> Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).</li><li>Abolhassani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+well-established+drugs+targeting+cancer+metabolism:+reproducibility+of+the+efficacy+of+a+highly+effective+drug+combination+in+mice.">Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice.</a> Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).</li><li>Hudson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+panel+of+chemo-resistant+mesothelioma+models+for+investigating+chemo-resistance+and+identifying+new+treatments+for+mesothelioma.">Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma.</a> Sci Rep. 4, 6152 (2014).</li><li>Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats!.">Rats!.</a> Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).</li><li>Craighead, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+tumors+and+tumor+cells+cultured+from+experimental+asbestos-induced+mesotheliomas+in+rats.">Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats.</a> Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).</li><li>Hunter, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+subset+analysis+by+Boolean+algebra:+a+phenotypic+approach+using+a+cocktail+of+5+antibodies+and+3+color+immunofluorescence.">Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence.</a> Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).</li><li>Brando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis.">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).</li><li>Schnizlein-Bick, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+TruCount+absolute-count+tubes+for+determining+CD4+and+CD8+cell+numbers+in+human+immunodeficiency+virus-positive+adults.">Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).</li><li>Gajkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+enumeration+of+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+leukapheresis+product+and+bone+marrow+for+clinical+transplantation:+a+comparison+of+three+methods.">Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods.</a> Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Kao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+blood+neutrophil-to-lymphocyte+ratio+is+an+indicator+of+poor+prognosis+in+malignant+mesothelioma+patients+undergoing+systemic+therapy.">High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy.</a> Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).</li><li>Kao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+prognostic+factors+in+malignant+pleural+mesothelioma:+a+retrospective+analysis+of+data+from+patients+seeking+compensation+from+the+New+South+Wales+dust+diseases+board.">Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board.</a> Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).</li><li>Burt, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+and+tumor-infiltrating+myeloid+cells+predict+survival+in+human+pleural+mesothelioma.">Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma.</a> Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).</li><li>Weir, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin:+a+novel+immunostimulant+for+the+selection+and+delivery+of+autologous+and+syngeneic+tumor+vaccines.">Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines.</a> Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dettagli Questo documento un metodo per la generazione di un ratto singenici modello ortotopico di mesotelioma pleurico e un metodo semplice per monitorare la progressione della malattia attraverso longitudinale prelievo di sangue. Il modello II-45 è stato sviluppato da esponendo ratti Fischer 344 alle fibre di amianto 13. Anche se questa esposizione rappresenta le vere dinamiche delle interazioni ospite-amianto sistema-immunitario per il mesotelioma patogenesi, ha un ritardo di ...

Mesotelioma maligno (MM) è un tumore aggressivo che deriva da cellule trasformate nella membrana (Mesotelio) che riveste la cavità addominale e polmonare, cuore e gli organi riproduttivi interni, ed è il tumore primario più comune della cavità polmonare o pleura 1,2 . L&#39;esposizione a fibre di amianto rappresenta l&#39;80% di tutte le MM, e mentre sono stati introdotti anni fa il divieto di uso di amianto nella maggior parte dei paesi occidentali, il suo uso molto diffuso nella comunità ha lasciato un&#39;eredità letale. L&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità ha stimato che 107.000 persone nel mondo muoiono ogni anno per malattie legate all&#39;amianto, con tassi di mortalità continuano ad aumentare. Una nuova ondata di incidenza non professionale è anche emergendo e c&#39;è poca comprensione di quando, ea quale livello questo raggiungerà il picco 3. La maggior parte delle persone con MM viene diagnosticato tardi, quando la chemioterapia sistemica rappresenta una delle uniche opzioni valide 4. La maggior parte effective la chemioterapia e la corrente &#39;standard di cura&#39; (pemetrexed in combinazione con cisplatino 5) è stato identificato più di 10 anni fa. Tuttavia il fallimento di questo trattamento è inevitabile e non ci sono provati opzioni della riga di secondo, lasciando i pazienti con una prognosi infausta e la sopravvivenza mediana di soli 12 mesi 2. Pertanto, non vi è un urgente bisogno insoddisfatto per trattamenti più efficaci. Nonostante l&#39;esame di un numero di nuove terapie in studi clinici, nessuno ha portato a cambiamenti nella pratica. Ciò è dovuto in parte al basso (5%) trasferimento dei risultati pre-clinici, generalmente eseguiti in modelli murini xenotrapianto, per l&#39;impostazione della clinica 6-8. Tali modelli non fedelmente ricapitolano i complessi aspetti del microambiente tumorale si verificano in posizioni non fisiologiche, spesso in assenza di un sistema immunitario funzionante 9. Modelli ortotopici singenico creare un ambiente tumorale significativamente più realistico rispetto alla commonly usato modelli di xenotrapianto sottocutanei come i tumori si verificano nella posizione fisiologica corretta con un intatto 10,11 sistema immunitario. Le maggiori dimensioni del ratto esalta il suo uso come un modello di malattia roditore, soprattutto negli studi di droga in cui il sangue di serie trae sono necessari per valutare la risposta al trattamento e la tossicità 12. Inoltre, in modelli in cui il monitoraggio della progressione della malattia è difficile a causa della posizione dei tumori (come nella cavità pleurica), la possibilità di monitorare la progressione della malattia utilizzando fattori trovati in circolo è estremamente attraente. La generazione di un modello ortotopico singenici del mesotelioma pleurico utilizzando ratti immuno-competenti è descritto. Inoltre, un metodo semplice e relativamente non invasivo per monitorare la progressione della malattia pleurica misurando circolanti cellule immunitarie è anche descritto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA Collection tube (0.5ml)</td>
			<td>Greiner Bio One GmbH</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat T/B/NK Cell cocktail</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558509</td>
			<td>anti-Rat CD3&#160; APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RAT CD8a PE&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200608</td>
			<td>(IgG1vClone G28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>203406</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD45 PE/Cy7&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202214</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruCount&#8482; Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340334</td>
			<td>Box of 50 absolute counting tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Scientifix</td>
			<td>FBS500-S (lot# 010101-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago AB</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23Gx1&#188; Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fischer 344 Rat</td>
			<td>Animal Resources Centre, Perth Australia</td>
			<td>F344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.S.O (Isoflurane USP)</td>
			<td>Veterinary Companys Australia (VCA)&#160;</td>
			<td>B7058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II-45 Rat Mesothelioma line</td>
			<td>Zurich University</td>
			<td></td>
			<td>Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur&#8482; 4 colour</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>342975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Machine (The stinger)</td>
			<td>Advanced Anaesthesia specialists</td>
			<td>#00449</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model

L&#39;enorme aumento di interesse nei trattamenti immuno-based per il cancro, come i vaccini e gli inibitori checkpoint del sistema immunitario, e una maggiore comprensione del ruolo del microambiente tumorale in risposta al trattamento, collettivamente puntare l&#39;esigenza di modelli ortotopici immuno-competenti per i test pre-clinici di queste nuove terapie. Questo documento dimostra come stabilire un modello di topo immuno-competenti ortotopico di pleurico mesotelioma maligno. La progressione della malattia di monitoraggio nei modelli ortotopici è confuso dalla posizione interna dei tumori. Per monitorare longitudinalmente progressione della malattia e il suo effetto sulle cellule immunitarie circolanti in questo e altri modelli di ratto di cancro, un unico tubo citometria a flusso saggio che richiede solo 25 ml di sangue intero è descritto. Ciò fornisce la quantificazione accurata dei sette parametri immunitari: linfociti totali, monociti e neutrofili, così come i sottoinsiemi di cellule T CD4 e CD8, cellule B e le cellule natural killer. Diversi Subsets di questi parametri sono utili in diverse circostanze e modelli, con il neutrofili rapporto dei linfociti, con il massimo di utilità per monitorare la progressione della malattia nel modello mesotelioma. Analizzare i livelli circolanti di cellule immunitarie che utilizzano questo metodo del tubo singolo può anche aiutare a monitorare la risposta ai trattamenti immuno-based e la comprensione dei meccanismi sottostanti che determinano il successo o il fallimento del trattamento.

Il metodo usato in questo documento per la generazione di un modello ortotopico di mesotelioma pleurico utilizzando cellule II-45 ha determinato animali soccombono a mesotelioma in tempi riproducibile e rapido, senza ratti morire a causa del metodo di impianto. Titolazione del numero di cellule impiantate determinato che 1x 10 3 cellule era il numero minimo richiesto per modello pienamente penetrante (100% attecchimento). Il diverso numero di cellule impiantate nei ratti cambiato il decorso della malattia sen...

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Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model | Medicine | Video

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

La generazione di un modello di ratto ortotopico di pleurico mesotelioma maligno da impianto di II-45 cellule di mesotelioma nella cavità pleurica di topi immunocompetenti è presentato. Metodo citometria di flusso per analizzare sette sottoinsiemi di cellule immunitarie di questi animali da un campione di sangue di 25 ml è anche descritto.

Ortotopico impianto e periferico immunitario monitoraggio cellulare nel Modello II-45 Singenico Rat mesotelioma

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

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9.1K Views.  Royal North Shore Hospital, University of Sydney.  La generazione di un modello di ratto ortotopico di pleurico mesotelioma maligno da impianto di II-45 cellule di mesotelioma nella cavità pleurica di topi immunocompetenti è presentato. Metodo citometria di flusso per analizzare sette sottoinsiemi di cellule immunitarie di questi animali da un campione di sangue di 25 ml è anche descritto. 

Video: Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Trapianto ortotopico aortica: un modello di ratto per studiare lo sviluppo di vasculopatia cronica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

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Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

L&#39;alcool polivinilico Sponge impianto modello

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Procedure chirurgiche per un modello di Rat parziale trapianto di fegato con la ricostruzione arteriosa epatica

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema ottimizzato per il monitoraggio perfusione cerebrale nel modello Rat Stroke of intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

A &quot;paziente-Like&quot; ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

Complicazioni ridotte dopo la riconnessione arteriosa in un modello di ratto di trapianto di fegato ortotopico

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...