The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec les recommandations du Code australien de pratiques pour le soin et l&#39;utilisation des animaux à des fins scientifiques. Le protocole de cette étude a été approuvée par le Comité de protection des animaux et de l&#39;hôpital Royal North Shore éthique. Femme rats Fischer 344 (F344, 150-200 g) ont été maintenus à l&#39;installation Kearns, Kolling Institut dans des conditions standard (12 h cycles lumière / obscurité et l&#39;accès libre à la nourriture et de l&#39;eau). Remarque: Un organigramme pour toutes les procédures expérimentales est présentée dans la figure 1. 1. Préparation des cellules pour implantation <ol><li> Le mésothéliome de rat ligne de culture II-45 cellulaire (aussi connu comme l&#39;IL-45; dérivée par l&#39;introduction péritonéale de l&#39;amiante crocidolite) dans du RPMI 1640 (RPMI) médias complété avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et de grandir dans des conditions standard (37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2). Maintapar passage dans et sous-culture à environ 1:50 deux fois par semaine dans un flacon de 2 75 cm. </li><li> Préparer les réactifs pour la culture cellulaire et des parties aliquotes chaud à 37 ° C. Réactifs nécessaires comprennent médias libres sériques RPMI (AFD), RPMI avec 10% de FBS, tampon phosphate salin (PBS) et 0,5% de trypsine-EDTA. </li><li> Cellules de culture pour l&#39;implantation à environ 70-80% de confluence. Ceci assure qu&#39;ils sont dans la phase de croissance linéaire. </li><li> Récolte des cellules en éliminant le support, lavage une fois avec 5 ml de PBS stérile, puis en ajoutant 3 ml de 0,5% de trypsine-EDTA. </li><li> Flacons Retour à l&#39;incubateur pendant environ 5 minutes jusqu&#39;à ce que toutes les cellules deviennent non-adhérent. </li><li> Une fois que les cellules sont non adhérente, ajouter 3 ml de RPMI avec 10% de FBS pour inactiver la trypsine. Recueillir et cellules de centrifugation à 300 g pendant 3 min. </li><li> Laver le culot cellulaire dans 10 ml de GDF et centrifuger à 300 g pendant 3 min. </li><li> Laver culot cellulaire à nouveau avec 10 ml de GDF et centrifuger comme ci-dessus. </li><li> Reprendre les cellules dans 10 ml de GDF et d&#39;effectuer un nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou instruments similaires. </li><li> Diluer les cellules de sorte que 100 ul contient la quantité de cellules à implanter. Remarque: la croissance de la tumeur a été démontrée à une dose aussi faible que 100 cellules dans 100 pi, mais une dose standard est de 500.000 cellules dans 100 pi. </li><li> Préparer suffisamment de cellules dans un milieu pour le nombre de rats à être implanté (par exemple, 100 ul / rat), ainsi que d&#39;au moins 0,5 ml supplémentaire pour compenser les pertes de l&#39;amorçage et le volume mort de l&#39;aiguille. </li><li> Préparer suffisamment de GDF (sans cellules) pour être implanté dans des rats de contrôle (par exemple, 100 pl / rat), majoré d&#39;au moins 0,5 ml supplémentaire. Remarque: Les cellules et GDF sont maintenant prêts pour l&#39;implantation. Ils doivent être maintenus à 37 o C et implantés dans les 2 heures de la récolte pour maintenir la viabilité. </li></ol> 2. In vivo implantation de cellules<ol><li> Placez le rat F344 (&gt; 13 semaines d&#39;âge) dans la chambre d&#39;induction et anesthésier utilisant 1,4% inhalation isoflurane (ou la méthode en usage dans l&#39;installation). Une fois que le rat semble être endormie mouvement à partir de la chambre à un cône de nez (avec 1,4% d&#39;isoflurane qui coule), placez-le sur le dos, la poitrine vers le haut (vue ventrale). Ceci permet aux organes internes de régler l&#39;écart de la cavité thoracique. Vérifiez réflexes selon les protocoles institutionnels pour assurer le rat est totalement anesthésié. </li><li> Rasez la zone de droite regio costalis (poitrine) pour enlever la fourrure. </li><li> Nettoyer la zone rasée avec 80% v / v d&#39;éthanol. </li><li> Identifier le site d&#39;injection: sur le côté droit, trouver le 2ème glande crânienne départ. Le site d&#39;injection est de 0,5 cm proximale à cela, entre la 3e et 4e côtes à partir de l&#39;extrémité caudale de la cage thoracique. (Figure 2A). </li><li> Mélanger délicatement les cellules II-45 pour remettre en suspension. Aspirez lentement la suspension de cellules (ou GDF pour les rats de contrôle) dans 1 ml &amp;# 160; seringue sans aiguille attachée. Si une aiguille est fixée pour le dessin de cellules il y a le potentiel de se développer le long des cellules de la ligne d&#39;injection à aiguille. Joindre une 23G x 1 ¼ needle. Premier l&#39;aiguille et enlever les bulles d&#39;air. </li><li> Une fois la seringue et l&#39;aiguille sont amorcées, placer à 20 mm de long et de 5 mm de diamètre entretoise sur l&#39;arbre de l&#39;aiguille. Ceci est utilisé pour empêcher l&#39;aiguille de pénétrer trop profondément dans la cavité pleurale au cours de l&#39;injection. Environ 5 mm-12 mm de l&#39;aiguille exposée est suffisante pour la pénétration à travers les côtes sans endommager les organes. </li><li> Insérer lentement l&#39;aiguille entre les côtes, reculer sur la seringue pour assurer un vaisseau sanguin n&#39;a pas été perforé (pas de sang devrait apparaître dans la seringue), puis injecter 100 cellules ul ou GDF. (Figure 2B). </li><li> Retirez l&#39;aiguille et rouler doucement le rat de gauche à droite pour répandre cellules dans la cavité thoracique. </li><li> Placez le rat dans une cage et vérifier pour la récupération. The rat devrait être éveillé au sein de 1 min et de commencer à se déplacer. </li><li> Répétez l&#39;opération pour chaque rat en utilisant une nouvelle aiguille. Réutilisation de la même aiguille se traduira par la croissance des cellules le long de la conduite d&#39;injection de l&#39;aiguille. </li><li> Surveiller le bien-être des animaux quotidienne. </li><li> Euthanasier les animaux à extrémités éthique définis comme régi par le comité institutionnel de l&#39;éthique animale. Les critères éthiques pour les rats dans ces expériences étaient perte de poids de plus de 10% ou la respiration difficile. </li></ol> 3. veine de la queue de prélèvement sanguin <ol><li> Si le sang doit être collecté immédiatement après l&#39;implantation des cellules, gardez le rat anesthésié. Si l&#39;échantillonnage de sang à un autre point de temps, anesthésier la rat en utilisant 1,4% inhalation isoflurane. Vérifiez réflexes selon les protocoles institutionnels pour assurer le rat est totalement anesthésié. </li><li> Placez le rat sur le côté et localiser un veine de la queue latérale. </li><li> Stériliser la queue avec 80% d&#39;éthanol et étiqueter un 0,5 ml EDTA ctube de ollection. </li><li> Pour recueillir le sang, toujours commencer à l&#39;extrémité caudale de la queue (environ un tiers du chemin long). Ceci permet de nouvelles tentatives plus proche de l&#39;extrémité crânienne de la queue dans le cas où la première tentative échoue. Jamais rééchantillonner caudale car cela peut causer un caillot de sang. </li><li> Positionner un 23G x 1 ¼ needle parallèle à la veine latérale et faites-le glisser dans la veine à un angle faible de sorte qu&#39;il pénètre d&#39;environ 10 mm (figure 3A). </li><li> Remarque: Si la veine a été percé avec succès le sang sera visible dans l&#39;extrémité de fixation de l&#39;aiguille (figure 3B). </li><li> Une goutte de sang se forme sur la queue au niveau du site de la ponction de l&#39;aiguille. Recueillir ce sang à l&#39;aide d&#39;une pipette et le transfert dans les étiquetées 0,5 ml (ou plus petit) tube de collecte de l&#39;EDTA. Pour le dosage des cellules immunitaires 25 ul est suffisante. Appliquer de la gaze avec une pression à la perforation site jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. </li><li> Flick le tube de sang de mélanger le sang et de l&#39;EDTA à PRévénement de coagulation. Conserver le temps entre le prélèvement de sang et le mélange avec l&#39;EDTA aussi court que possible pour empêcher la coagulation. </li><li> Lors de la collecte du sang à partir de plusieurs rats magasins échantillons EDTA-sang dans un rack à température ambiante jusqu&#39;à l&#39;analyse. De traitement du sang dans les 2 heures de la collecte. </li></ol> 4. Préparation d&#39;échantillons pour des cellules immunitaires profilage à l&#39;aide de la méthode fondée sur la Perle Note: Cette méthode de plate-forme unique repose sur l&#39;utilisation des tubes de comptage absolu disponibles dans le commerce qui ont connu un certain nombre de billes pour chaque échantillon. Ces tubes contiennent des granulés lyophilisés qui se dissolvent lors de la préparation de l&#39;échantillon, en libérant les perles. Les perles sont marquées par fluorescence et par gating sur la population de billes, les chiffres absolus peuvent être calculés. <ol><li> Vérifiez que le EDTA échantillon de sang entier est bien mélangé en le plaçant sur un mélangeur rotatif lente pendant plusieurs minutes. Etiqueter un tube de comptage absolu pour chaque échantillon. Un culot contenant les perles devrait être visible sous til support de bille de métal au fond du tube. </li><li> Transférer 25 ul de sang entier dans un tube EDTA de comptage absolu marqué. Le culot de bille va se dissoudre lors de l&#39;addition du sang. </li><li> Pour chaque tube ajouter 20 ul d&#39;anti-rat T / B / Natural Killer (NK) cellule cocktail, 10 pi d&#39;anti-rat CD8a PE, 10 pi d&#39;anti-rat CD4 (domaine 1) FITC et 10 pi d&#39;anti-rat CD45 PE / Cy7 (figure 4A). Les fluorophores sont définis dans le Tableau 1. </li><li> Centrifuger brièvement le tube (300 xg) pour assurer les anticorps et les cellules sont dans le fond du tube et non pas collées sur le côté du tube. Vortex pour mélanger et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Pour lyser les globules rouges d&#39;ajouter 400 ul de Tris 10 mM, 0,15 M de tampon chlorure d&#39;ammonium (pH 7,5) et vortex pour mélanger. Lyse est complète lorsque l&#39;échantillon apparaît translucide et non trouble (figures 4B et C). Défaut de lyser l&#39;échantillon complètement conduira à augmenterd arrière-plan et faussement élevés compte lors de l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 5. cytométrie en flux traitement des échantillons Remarque: Effectuez une couleur 4 cytomètre de flux. <ol><li> Ouvrez le logiciel en mode d&#39;acquisition et un nouveau modèle avec 8 parcelles comme le montre la Figure 5. </li><li> Réglez les paramètres de l&#39;instrument à ceux énumérés dans le tableau 1 et mettre en place la porte R1 (FITC [FL-1] par rapport APC [FL-4]), Figure 5ai) pour compter les perles fluorescentes. Les autres portes ne sont pas aussi important à ce stade de l&#39;acquisition, mais seront nécessaires pour l&#39;analyse. Les perles de comptage absolu utilisé dans ce protocole contiennent des colorants fluorescents et peuvent être détectés dans un canal bien sont les plus faibles dans le canal bleu. </li><li> En utilisant un échantillon de sang de commande préparée, vortex et ensuite charger sur le cytomètre et courir à une vitesse faible (12 pi / min) sur le mode de configuration afin portes d&#39;acquisition de données peuvent être ajustés. </li><li> Réglez l&#39;acquisition derecueillir 10.000 événements dans la porte de perles R1. </li><li> Mettre en place un dossier pour enregistrer les données et de définir le nombre de fichiers et l&#39;étiquette exemple de fichier dans le menu d&#39;acquisition. </li><li> Charger l&#39;échantillon à analyser sur le cytomètre et a fixé le taux à moyen (35 pi / min) Débit. Exécutez chaque échantillon au même débit. Le débit peut avoir besoin d&#39;être modifiée à faible (12 pi / min) ou élevée (60 pi / min), mais moyen est généralement appropriée. A ce rythme, il faut environ 90 à 120 secondes à acquérir 10.000 événements billes pour chaque échantillon. </li><li> Une fois que l&#39;échantillon est chargé regarder les diagrammes de dispersion à faire en sorte que les événements apparaissent dans la grille de perles R1. Initialement il peut y avoir une certaine instabilité dans la pression de l&#39;échantillon provoquant la dérive dans les diagrammes de dispersion. Attendre que ce se stabiliser. </li><li> Une fois stabilisé, cliquez sur acquérir et permettre échantillon de fonctionner. Une fois que le cytomètre a terminé l&#39;acquisition de 10.000 événements perles dans le cytomètre R1 va cesser d&#39;acquérir et de sauvegarder toutes les données. </li><li> Retirer l&#39;échantillon et jetez écouler tuêtre. Le cytomètre est maintenant prêt pour l&#39;échantillon suivant. Exécutez tous les échantillons et ensuite procéder au mode d&#39;analyse. </li></ol> 6. immunitaire analyse cellulaire Remarque: les stratégies de blocage et d&#39;algèbre de Boole sont utilisés pour définir la population de chaque cellule. Algèbre booléenne est une méthode d&#39;analyse logique sur la base qui permet plusieurs opérations sur un seul définition. Le logiciel d&#39;analyse du cytomètre de flux (par exemple, BD CELLQuest) permet l&#39;utilisation de l&#39;algèbre de Boole. Les équations sont utilisés activement pour tenir compte de la réactivité négative importante qui aide dans la définition de la cellule pour identifier plus précisément chaque population de cellules. «Régions» sont utilisés pour définir une «porte». Les régions définissent un espace à 2 dimensions alors que les portes peuvent être constituées de nombreuses régions connectées par des opérateurs algébriques (+, *, -, défini dans le Tableau 2). <ol><li> Mettez le logiciel en mode d&#39;analyse. Un modèle d&#39;analyse doit être généré pour correspondre <strong&gt; Figure 5 avec les parcelles et portails indiqués. </li><li> Analyser chaque fichier individuel (ie, chaque échantillon individuel) séparément. Mettre en place des portes R1 à R9 et à ensuite mettre en place les algorithmes pour chaque type cellulaire tel que défini dans le tableau 2 (également représenté sur la figure 5). </li><li> Utiliser les statistiques cellulaires compteur pour calculer populations de cellules individuelles définies par les portes et les algorithmes (tableau 2 et figure 5). Les algorithmes ajuster automatiquement le nombre de cellules dans les statistiques de la cellule contre. </li><li> Calculer des sous-ensembles de cellules en utilisant l&#39;équation suivante: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53019/53019eq1.jpg" /> Note: Nombre d&#39;événements cellulaires comptés (par exemple, les événements de cellules T CD4) est énumérée en utilisant l&#39;équation ci-dessus pour donner le nombre de cellules par ml de sang. Des exemples sont montrés sur la figure 5. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Cet article détaille une méthode pour la génération d&#39;un modèle orthotopique syngénique de rat de mésothéliome pleural et une méthode simple pour surveiller la progression de la maladie grâce à un échantillonnage de sang longitudinale. Le modèle II-45 a été développé par l&#39;exposition des rats Fischer 344 aux fibres d&#39;amiante 13. Bien que cette exposition représente les vrais dynamique des interactions du système hôte-amiante-immune pour le mésothé...

Le mésothéliome malin (MM) est une tumeur maligne agressive qui se pose à partir de cellules transformées dans la membrane (mésothélium) que les lignes les poumons et la cavité abdominale, le coeur et les organes génitaux internes, et est la tumeur primaire la plus fréquente de la cavité du poumon ou de la plèvre 1,2 . L&#39;exposition aux fibres d&#39;amiante représente 80% de tous les MM, et tandis que les interdictions sur utilisation de l&#39;amiante ont été introduits il ya plusieurs décennies dans la plupart des pays occidentaux, son utilisation répandue dans la communauté a laissé un héritage mortel. L&#39;Organisation mondiale de la santé a estimé que 107.000 personnes dans le monde meurent chaque année de maladies liées à l&#39;amiante, avec des taux de mortalité continue d&#39;augmenter. Une nouvelle vague d&#39;incidence non professionnelle est également en train d&#39;émerger et il ya peu de compréhension de quand, et à quel niveau ce sera à son maximum 3. La majorité des gens atteints de MM sont diagnostiqués tardivement lorsque la chimiothérapie systémique représente une des seules options viables 4. Les plupart des effective chimiothérapie et de courant standard de soins &quot;(pemetrexed association avec le cisplatine 5) a été identifié il ya plus de 10 ans. Cependant l&#39;échec de ce traitement est inévitable et il n&#39;y a pas des options de seconde ligne éprouvées, laissant les patients avec un pronostic sombre et la survie médiane de 12 mois seulement 2. Par conséquent, il ya un besoin non satisfait urgent de traitements plus efficaces. Malgré l&#39;examen d&#39;un certain nombre de nouvelles thérapies dans des essais cliniques aucune n&#39;a abouti à des changements dans la pratique. Cela est dû en partie à la faible (5%) le transfert des résultats pré-cliniques, généralement effectuée dans des modèles de xénogreffe de souris, pour le réglage de la clinique 6-8. De tels modèles ne récapitulent pas fidèlement les aspects complexes du microenvironnement tumoral se produisant dans les zones non physiologiques, souvent en l&#39;absence d&#39;un système immunitaire fonctionnant 9. Orthotopiques modèles syngéniques créent un environnement de la tumeur significativement plus réaliste que le commonly utilisé des modèles de xénogreffes sous-cutanées que les tumeurs se produisent dans l&#39;emplacement physiologique correcte avec un système immunitaire 10,11 intacte. La grande taille du rat améliore son utilisation comme modèle de la maladie des rongeurs, en particulier dans les études sur les médicaments où le sang de série tire sont nécessaires pour évaluer la réponse au traitement et la toxicité 12. De plus, dans des modèles dans lesquels la surveillance de la maladie est la progression difficile en raison de l&#39;emplacement des tumeurs (par exemple dans la cavité pleurale), la capacité de surveiller la progression de la maladie en utilisant des facteurs présents dans la circulation est extrêmement attrayant. La génération d&#39;un modèle orthotopique syngénique de mésothéliome pleural en utilisant des rats immuno-compétentes est décrite. En outre, un procédé relativement simple et non invasif de surveillance de progression de la maladie en mesurant pleural cellules immunitaires circulantes est également décrite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA Collection tube (0.5ml)</td>
			<td>Greiner Bio One GmbH</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat T/B/NK Cell cocktail</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558509</td>
			<td>anti-Rat CD3&#160; APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RAT CD8a PE&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200608</td>
			<td>(IgG1vClone G28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>203406</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD45 PE/Cy7&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202214</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruCount&#8482; Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340334</td>
			<td>Box of 50 absolute counting tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Scientifix</td>
			<td>FBS500-S (lot# 010101-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago AB</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23Gx1&#188; Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fischer 344 Rat</td>
			<td>Animal Resources Centre, Perth Australia</td>
			<td>F344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.S.O (Isoflurane USP)</td>
			<td>Veterinary Companys Australia (VCA)&#160;</td>
			<td>B7058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II-45 Rat Mesothelioma line</td>
			<td>Zurich University</td>
			<td></td>
			<td>Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur&#8482; 4 colour</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>342975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Machine (The stinger)</td>
			<td>Advanced Anaesthesia specialists</td>
			<td>#00449</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model

L&#39;énorme regain d&#39;intérêt dans les traitements à base immunitaire contre le cancer tels que les vaccins et les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire, et une meilleure compréhension du rôle du microenvironnement de la tumeur dans la réponse au traitement, pointez sur la nécessité pour les modèles orthotopiques immunitaire compétentes pour les essais pré-cliniques collectivement de ces nouvelles thérapies. Cet article montre comment établir un modèle de rat immunitaire compétent orthotopique du mésothéliome pleural malin. Suivi progression de la maladie dans des modèles orthotopiques se confond interne par l&#39;emplacement des tumeurs. Pour surveiller longitudinalement progression de la maladie et ses effets sur cellules immunitaires circulantes dans ce domaine et d&#39;autres modèles de rats de cancer, un seul tube cytométrie de flux dosage ne nécessitant que 25 ul de sang entier est décrite. Ceci permet d&#39;obtenir une quantification précise de sept paramètres immunitaires: les lymphocytes totaux, monocytes et neutrophiles, ainsi que les sous-ensembles de cellules T CD4 et CD8, les cellules B et les cellules tueuses naturelles. Différents sous-marinsets de ces paramètres sont utiles dans des circonstances et des modèles différents, avec le rapport des neutrophiles à des lymphocytes ayant la plus grande utilité pour le suivi de progression de la maladie dans le modèle de mésothéliome. Analyser les taux circulants de cellules immunitaires en utilisant cette méthode de tube unique peut également aider à surveiller la réponse aux traitements à base immunitaire et de comprendre les mécanismes sous-jacents menant à la réussite ou l&#39;échec du traitement.

La méthode utilisée dans ce document pour la génération d&#39;un modèle orthotopique du mésothéliome pleural en utilisant des cellules II-45 a donné lieu à des animaux succombant à mésothéliome dans un délai reproductible et rapide, sans rats meurent en raison de la méthode d&#39;implantation. Le titrage du nombre de cellules implantées déterminé que 1x 10 3 cellules a été le nombre minimum requis pour un modèle entièrement pénétrant (100% de la prise de greffe). Le nombre différent de...

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Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model | Medicine | Video

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

La génération d&#39;un modèle de rat orthotopique du mésothéliome pleural malin par implantation des II-45 cellules de mésothéliome dans la cavité pleurale de rats immunitaires compétentes est présentée. Un procédé de cytométrie de flux pour analyser les sept sous-ensembles de cellules immunitaires chez ces animaux à partir d&#39;un échantillon de sang 25 ul est également décrit.

Orthotopique Implantation et périphérique des cellules immunitaires surveillance dans le modèle II-45 Syngénique Rat mésothéliome

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

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9.1K vues.  Royal North Shore Hospital, University of Sydney.  La génération d'un modèle de rat orthotopique du mésothéliome pleural malin par implantation des II-45 cellules de mésothéliome dans la cavité pleurale de rats immunitaires compétentes est présentée. Un procédé de cytométrie de flux pour analyser les sept sous-ensembles de cellules immunitaires chez ces animaux à partir d'un échantillon de sang 25 ul est également décrit. 

Vidéo: Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Orthotopique aortique transplantation: un modèle de rat pour étudier le développement de la vasculopathie chronique

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Recherche

Médecine

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

Orthotopique xénogreffe de l&#39;homme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test d&#39;agents thérapeutiques candidats

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

L&#39;alcool polyvinylique Modèle éponge Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Interventions chirurgicales pour un modèle de rat de transplantation hépatique orthotopique partielle avec reconstruction artérielle hépatique

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Système optimisé pour la surveillance de la perfusion cérébrale chez le rat des maladies du intraluminale occlusion de l&#39;artère cérébrale moyenne

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Un «Patient-Like&quot; Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

Complications réduites après reconnexion artérielle dans un modèle de rat de transplantation orthotopique de foie

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...