Die Autoren möchten April Wiles und Dr. Roger Broderson für Hilfe mit tierischen Sektions- und Drüse Isolation, bzw. zu bestätigen. Mittel für diese Arbeit wurde von den Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers für chronische Erkrankungen des Alterns unterstützt.

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen in diesem Protokoll wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee des Philadelphia College of Osteopathic Medicine genehmigt und alle Techniken wurden unter strengen durchgeführt ethische Leitlinien.
 1. Probe Beschaffung und Verarbeitung <ol><li>Wählen Sie geeignete tierische Betreff und Ort in eine CO-2-Kammer. Verwenden Sie für dieses Experiment 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J und C57BI/6J.</li>
	<li>Schalten Sie Gasstrom zu 30-40 %. Sobald das Tier nach ca. 2 min sichtlich bewusstlos ist, öffnen Sie das Gasventil zu vollen Druck für eine zusätzliche 5 min. 
	Hinweis: Bestätigen Sie tierischen Tod durch die Beobachtung von sichtbaren Zeichen der Atmung (z.B. Bewegung der Brust) für einen Zeitraum von 10 Minuten nach Beendigung der CO 2 Lieferung. Wenn das Tier noch am Leben ist, kann es wieder in die CO-2-Kammer platziert. Zervikale Dislokation kann auch verwendet werden, obwohl es nicht empfohlen wird, da Blut ansammeln kann, um die Milchdrüsen stören die Dissektion und Ergebnisse.</li>
	<li>Nach Opfer, pin-Kadaver in Rückenlage und mit 70 % Ethanol zu sättigen.</li>
	<li>Kneifen das Fell direkt über dem Schambein mit Pinzette und nick mit kleine chirurgische Scheren. Drehen der Schere das Fell entlang der ventralen Mittellinie bewegen auf kranialen kaudalen geschnitten.</li>
	<li>Mit größeren Schere oder einer Gefäßklemme unverblümt sezieren die subkutane Faszie bilateral, mit Vorsicht nicht auf um das Peritoneum zu durchbohren. Schneiden Sie entlang der horizontalen Ränder an beiden distalen Enden des Schnittes.</li>
	<li>Pin das Fell Klappen öffnen und wieder mit 70 % Ethanol sprühen. 
	Hinweis: Obwohl die Verwendung von 70 % Ethanol bessere visuelle Unterscheidung zwischen der Drüse und die umliegenden Unterhautgewebe erlaubt, seien Sie vorsichtig zu trocknen des Gewebes als Folge der Verwendung dieser Lösung. Um zu vermeiden, trocknen, entfernen der Drüsenkörpers in einem Zeitrahmen nicht zu 4 min nicht überschreiten. Als Alternative zu 70 % Ethanol, kann der Prüfer auch ersetzen einen allgemeinen isolieren Puffer, z. B. 1 X PBS, um Gewebe Austrocknung zu vermeiden.</li>
	<li>Ortung der Milchdrüsen von Interesse, schieben Sie ein #4 Skalpellklinge entlang der Innenseite der Fell-Klappen, Schneiden der Brustdrüse und die damit verbundenen kutane Fettgewebe frei von der Dermis. 
	Hinweis: 3,5 x chirurgische micro Lupen können einfacher Visualisierung der Drüsen helfen.</li>
	<li>Tauchen sofort neu isoliert Drüse in konische Rohr mit 10:1 Lösung-Gewebe-Volumen von 10 % neutral gepuffertem Formalin für 24-48 h 
	Hinweis: Je nach Absicht der Studie, viele alternative Fixiermittel verwendet werden wie Paraformaldehyd, Ethanol für genomische Studien und handelsüblichen RNA Puffer erhalten.</li>
	<li>Folgen institutionelle Protokolle für die Einbettung von Paraffin, reichen Proben an einen Lieferanten für die Verarbeitung, einbetten, und schneiden/Folie Montage. Sektion Gewebe bei 5 µm. 
	Hinweis: Aufgrund von überschüssigem Fettgewebe umliegenden Drüse, sollten Sie entfernen 100-200 µm Gewebe vor dem Schneiden und färben.</li>
</ol> 2. Retikuläres Gewebe <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>Ort-Folien auf Heizblock gefärbt werden gesetzt auf 58 ° c für 1 h Paraffin schmilzt. 
		Achtung: Paraffin Wachs schmelzen Folie überschreiten. Aufmerksam verfolgen oder platzieren Sie wischen unter Folie, Abfluss Wachs zu erfassen. 
		Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich und kann übersprungen werden. Wenn Ergebnisse sind nicht wie erwartet, Hinzufügen von diesen Schritt zurück kann Ergebnis verbessern.</li>
		<li>Inkubieren Folien in einer Folie jar mit 100 % Xylol für 30 min vollständig untertauchen zu gewährleisten. Einmal zu wiederholen. 
		Hinweis: an dieser Stelle sollte Sichtprüfung durchgeführt werden um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte sind frei von Fettgewebe und Paraffin. Wenn zusätzliche Fettgewebe oder Wachs ersichtlich ist, sollte die Folie wieder in Xylol eingetaucht sein. Seien Sie vorsichtig, um zusätzliche Exposition gegenüber Xylol zu minimieren, da dies Schrumpfung des Gewebes führen kann.</li>
		<li>Einmal rehydrieren Gewebe in eine Folie JAR-Datei mit 100 % igem Ethanol für 10 min. wiederholen.</li>
		<li>Umzug Folien eine Folie JAR-Datei mit 95 % igem Ethanol für 10 min. wiederholen einmal.</li>
		<li>Verschieben Sie Folien eine Folie Glas enthält 75 % Ethanol für 5 min.</li>
		<li>Verschieben Sie Folien eine Folie Glas mit 50 % Ethanol für 5 min.</li>
		<li>10 mM Natriumcitrat Lösung (pH-Wert 6,0) in einer heißen Platte oder eine Mikrowelle kochen und gießen Sie in Coplin Jar. 
		Achtung: Überwachen Sie Lösung beim Erwärmen und vermeiden Sie kochen über zu. Container werden sehr heiß. Schutz verwenden, um Verbrennungen zu vermeiden.</li>
		<li>Langsam Platz Dias in Coplin jar, vollständiges Untertauchen zu gewährleisten und bei 100 ° C für 10 min zum Abrufen von Epitopen inkubieren. Entfernen und sorgfältig trocknen Folien.</li>
		<li>Zeichnen eine Sperre um Gewebe mit einem hydrophoben Marker. Fügen Sie genügend körpereigene Enzym-Blocker (Wasserstoffperoxid und Natriumazid, erhältlich im Handel) Gewebe abdecken und 10 min. inkubieren</li>
		<li>Submerge Folien in 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 10 min.</li>
		<li>Fügen Sie genügend Serum 10 % Esel in 1 X PBS Gewebe abdecken und für 1 h bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer inkubieren. 
		Hinweis: Das Experiment kann hier durch die Speicherung der Folien in die feuchte Kammer bei 4 ° C über Nacht angehalten werden. Während Esel Serum gefunden wurde, um optimale Färbung Ergebnisse zu erzielen, kann der Prüfer verschiedene Seren wie Rinderserumalbumin (BSA), Ziegenserum oder Pferd Serum, um optimale Ergebnisse zu bestimmen testen möchten. Wenn BSA verwenden, sollte der Prüfer diese frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
		<li>Dekantieren überschüssige Blocker von Folien und richtig verdünnte Primärantikörper in 1 % Serum direkt hinzufügen Folien um sicherzustellen, dass das Gewebe in Lösung gleichmäßig bedeckt ist. 30 min bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer inkubieren. 
		Hinweis: Dieser Schritt fortgesetzt werden für längere Zeit Laufzeiten mit feuchten Kammer gelagert um 4 ° C. Achten Sie darauf, die richtige Negativkontrolle Folien (z. B. eine Folie mit keine primären Antikörper, Antigen-negativen Gewebe, etc. bekannt) bei diesem Schritt enthalten.</li>
		<li>Sorgfältig waschen Dias durch fließt etwa 1 mL der DiH 2 O über Gewebe und inkubieren Sie 1 Änderung der 1 X PBS für 5 min.</li>
		<li>Dekantieren überschüssige PBS und fügen Sie genug Meerrettich-Peroxidase-Label Gewebe zu bedecken und 30 min. in eine feuchte Kammer inkubieren. 
		Hinweis: Bei diesem Schritt kann der Prüfer, fluoreszierende Färbung mit Gewebekulturen konjugierten Sekundärantikörper fortfahren möchten. Wenn dies gewünscht ist, sollten die nächsten Schritte beschrieben entsprechend angepasst werden.</li>
		<li>Sorgfältig waschen Dias durch fließt etwa 1 mL der DiH 2 O über Gewebe und inkubieren Sie 1 Änderung der 1 X PBS für 5 min.</li>
		<li>Diaminobenzidine (DAB) plus Chromogen-Lösung entsprechend dem Hersteller empfohlene Verhältnis und vermischen von Wirbel. 
		Hinweis: Viele fertige Kits sind im Handel erhältlich neben in diesem Protokoll verwendet.</li>
		<li>Dekantieren Überschuss Puffern von Folien und fügen Sie 2-3 Tropfen (10-50 µL) Chromogen Fleck direkt zu den Geweben und 5 min in die feuchte Kammer inkubieren. Sorgfältig waschen Folien durch fließende etwa 1 mL DiH 2 O über Gewebe. 
		Achtung: DAB-Chromogen ist hochgiftig. Vermeiden Sie direkten Kontakt des Flecks mit Haut und sammle Flow aus Sondermüll.</li>
	</ol></li> <li>Hämatoxylin und Eosin (H &#38; E) <ol><li>Chromogen Inkubation Nachspülung nach Tauchen Folien in Harris Hämatoxylin für 2-2,5 min. Spülen Folien vorsichtig unter fließendem Wasser für 1-2 min. 
		Hinweis: Achten Sie darauf, direkten Wasserstrahl auf Geweben.</li>
		<li>Folien Submerge für 2-3 s in Differenzierung Lösung (0,25 mL Salzsäure in 100 mL 70 % igem Ethanol). Spülen Sie Folien vorsichtig unter fließendem Wasser für ca. 1-2 min.</li>
		<li>Tauchen Sie Folien in blauen Agent (4,5 mg Calciumcarbonat in 100 mL Leitungswasser, pH-Wert eingestellt auf 9,4) für 60 S. Spülen Folien in 95 % igem Ethanol für 30 s.</li>
		<li>Submerge Folien in alkoholischer Eosin Y für ca. 2-3 min.</li>
		<li>Entwässern Gewebe in 2 Änderungen von 95 % Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Gelief Gewebe in 1 von 100 % Ethanol für mind. 1 ändern</li>
		<li>Trocknen Folien mit einem fusselfreien Tuch. Geben Sie 1 Tropfen (ca. 100-200 µL) von synthetischen, nichtwässrigen, Harz-Basis Montage Medien zu schieben und Deckglas anzuwenden. 
		Hinweis: Wenn eine andere Färbung Methode gewählt wurde, möglicherweise eine andere Montage-Medien erforderlich. Zum Beispiel, wenn der Prüfer eine Leuchtstoff-konjugierten Sekundärantikörper gewählt haben, eine wässrige Halterung mehr ideal wäre.</li>
		<li>Folien über Nacht bei Raumtemperatur einstellen lassen.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius rot (PSR) färben <ol><li>Wählen Sie Folien werden gebeizt und Immunhistochemie Protokoll über Schritt 6 (50 % Ethanol einweichen) folgen.</li>
		<li>Submerge Folien in PSR Fleck für 1 h.</li>
		<li>Tauchen Sie Folien in 0,5 % Essigsäure für 1-2 s zweimal, um Flecken zu differenzieren.</li>
		<li>Entwässern Gewebe in 2 Änderungen von 95 % Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Gelief Gewebe in 1 von 100 % Ethanol für mind. 1 ändern</li>
		<li>Klare Folien durch kurz eintauchen in 100 % Xylol für über 3-4 s.</li>
		<li>Trocknen Folien mit einem fusselfreien Tuch. Geben Sie 1 Tropfen (ca. 100-200 µL) von synthetischen, nichtwässrigen, Harz-Basis Montage Medien zu schieben und Deckglas anzuwenden.</li>
	</ol></li></ol> 3. Probieren Sie Analyse <ol><li>Duktales Analyse <ol><li>Select Folien gebeizt für α-SMA. Mit einem Lichtmikroskop, ausgestattet mit einem Kamera Ziel, repräsentative Bilder mit 20 X Vergrößerung sammeln.</li>
		<li>Mit ImageJ (NIH), zu unterscheiden und zählen Kanäle in jedem Bild. Diese können manuell aufgelistet werden oder man kann einzelne Kanäle eine Punkteskala zuweisen. Zuweisen einer Punkteskala, ImageJ zu öffnen und wählen Plugins. Als nächstes wählen Sie Analyze und Zelle Zähler aus dem Drop-down-Menü. Initialize klicken Sie unter markieren Sie Typ1 zunächst Kennzeichnung der Rohre zu. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Ergebnisse anzeigen die Anzahl die duktale. 
		Hinweis: Achten Sie darauf, überprüfen Strukturen sind duktale und nicht vaskulären.</li>
		<li>In &#39; setzen Messung &#39; Optionen, aktivieren Sie &#39; Umfang &#39; und &#39; Bereich &#34;.</li>
		<li>Mit dem Freihand Polygon-Werkzeug zeichnen Sie eine Linie um jedes Rohr auf das Myoepithelial Fach (Sichtbarkeit von α-SMA Fleck unterstützt). Wählen Sie &#39; Messen &#39; und notieren Sie den Umfang und die Fläche.</li>
		<li>Wieder mit dem Freihand Polygon-Werkzeug eine Linie entlang der apikalen Seite des duktalen Epithel im Innern des Gefäßlumens. Wählen Sie &#39; Messen &#39; und notieren Sie den Umfang und die Fläche.</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Umfang der luminalen Abteil aus dem Umfang des Myoepithelial Fach um den Umfang des duktalen Epithel zu erhalten. Subtrahieren Sie den Bereich der luminalen Fach aus dem Bereich der Myoepithelial Fach, das Gebiet der duktalen Epithel zu erhalten.</li>
	</ol></li> <li>Immunohistochemistry Analyse <ol><li>auf eine Analysesoftware wie ImageJ oder Fidschi Suite Hellfeld Bilder hochladen. 
		Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zum Beizen Analyse mit ImageJ und der IHC Toolbox Plugin.</li>
		<li>Öffnen Sie die Toolbox IHC aus dem Plugin-Menü. In der &#34; Modell auswählen &#34; Combo-Box öffnet sich, wählen geeignete Fleck (d. h. H-DAB, PSR, etc.). Wählen Sie die &#34; Farbe &#34; Option, um den Fleck zu isolieren. Dadurch öffnet sich ein Ergebnisfenster. 
		Hinweis: Diese Methode ist sinnvoll, wenn ein Protein des Interesses in den extrazellulären oder cytosolischen Räumen liegt oder an der Plasmamembran gebunden ist. Wenn das Protein des Interesses Atomkraft ist, Auswahl, &#34; Kerne &#34; fordert das Plugin, das Bild für positiv gefärbten Kernen analysieren.</li>
		<li>Color Chooser schieben verwenden, um den Fleck ohne Hintergrund Einschluss oder Ausschluss der übermäßigen Fleck richtige Isolierung. 
		Hinweis: Wenn der automatische Modus nicht in der Lage ist, den Fleck zu erkennen oder nicht akzeptable Bilder führt, zeichnen Sie ein Quadrat Region von Interesse (ROI) über eine identifizierte Region gebeizt. Wählen Sie im Fenster "IHC-Toolbox" &#34; Zug &#34;, Plugin, um das entsprechende Ziel zu lenken.</li>
		<li>Konvertieren Sie das Bild auf 16-Bit. Gehen Sie zu Bild &#8594; Typ &#8594; 16bit.</li>
		<li>Schwelle das Bild. Gehen Sie zu Bild &#8594; einstellen &#8594; Auto Schwelle.</li>
		<li>Setzen die Messskala Bild durch Ziehen einer Linie ROI direkt über die Maßstabsleiste in das Bild, dann die Länge zuweisen. Um die Maßstabsleiste einzustellen, gehen Sie zu Analyse &#8594; Set Maßstab. Geben Sie die Anzahl der Pixel pro die gewünschte Längeneinheit (z.B. 120 Pixel pro 50 µm).</li>
		<li>Die resultierende Fläche messen und grauen Mittelwert. Gehen Sie zu Analyze &#8594; Set Messungen und sammeln Sie die Messung durch Klicken auf Analyze &#8594; Maßnahme.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dem Papier haben wir eine Technik, um intakte Maus Milchdrüsen für nachgeschaltete histologische Analysen der ECM Ausdruck und duktale Morphologie isolieren beschrieben. Im Hinblick auf Analysen von duktalen Morphologie ermöglicht diese Methode die rasche Untersuchung der duktalen Architektur basiert auf gefärbten histologischen Abschnitte. Andere Methoden des duktalen Analysen beruhen auf Injektionen von Farbstoffen ermöglicht Visualisierung des Baumes duktale Methoden die technisch schwierig und zeitraubend sei...

Brustkrebs ist gekennzeichnet durch ein hohes Maß an Gewebe Fibrose1,2,3,4. Als die ECM bezeichnet, diese nicht-zelluläre Einheit findet sich in unterschiedlichem Ausmaß in allen Geweben und besteht hauptsächlich aus einem komplexen Geflecht von fibrillären und nicht-fibrillären Kollagene, Elastin und Glykoproteinen neben verschiedenen Signalmoleküle, die in dieser Matrix abgesondert. Homöostatische Bedingungen wird die Ablagerung und den Abbau des ECM streng kontrolliert. 5 während Brust Tumorgenese, wird das Gleichgewicht der ECM-Ablagerung und Abbau gestört. Als solche wurden Brusttumoren berichtet, reichlich ECM-Proteine wie Kollagene, Fibronektin und Tenascin-C unter anderem zum Ausdruck bringen. 6 der abnorme Ausdruck dieser Proteine zusätzlich erhöhte Muster Matrix Vernetzungsgrad ist dokumentiert worden, zur Förderung der Brust Tumor Progression, Metastasierung und Therapie Widerstand1,3, 4,7,8,9.
Um ECM Zusammensetzung und duktale Morphologie zu beurteilen, wurde Isolation intakt Milchdrüsen durchgeführt. Hier wir weibliche nulliparous Mäusen unzulänglich für Caveolin-1 verwendet, eine integrale Membranprotein, verbunden mit einer aggressiven Brustkrebs-Tumor Signatur10,11,12, und weibliche nulliparous B6 zu kontrollieren Mäuse. Histologischen Verarbeitung und Färbung dieser Gewebe erlaubt die Identifizierung von mehreren ECM-Proteinen zusammen mit Charakterisierung von duktalen Morphologie.
Alles in allem Möglichkeit die Isolierung des gesamten, intakte Milchdrüsen Forscher die, Gewebe-weite morphologische oder zelluläre Veränderungen in Reaktion auf exogene oder endogene Faktoren zu untersuchen. Nachteile der Technik sind verbunden mit Analysen von 2 Dimension (2D) Gewebeschnitte im Gegensatz zu einer 3D Perspektive, die ein vollständigeres Bild der komplexen Morphologie des Baumes duktale erbringen würde. Angesichts der Komplexität der Zell-Zell und Zelle-ECM-Interaktionen, die stattfinden in der Brustdrüse, ist die Isolierung des gesamten, intakten Drüsen vorteilhaft für effizient analysieren duktale Morphologie und Protein Ausdruck in verschiedenen Regionen der Murine Milch- Drüse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Entry software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5x-R Surgical Micro Loupes</td>
			<td>Rose Micro Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Magnification at researcher&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>Medline</td>
			<td>DYND04035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Size appropriate for tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K400611-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792780</td>
			<td>suitable for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S1964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt&#39;s Mounting Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB23750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB108930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB124964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Envision Dual Link System HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4065</td>
			<td></td>
		</tr>
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isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology

Das Ziel dieses Verfahrens war #4 Bauch Milchdrüsen von weiblichen nulliparous Mäusen zu ernten, um ECM Ausdruck und duktale Architektur zu beurteilen. Hier entstand eine kleine Tasche unter der Haut mit Mayo Schere, so dass Trennung der Drüsen in das subkutane Gewebe von der zugrunde liegenden Bauchfell. Visualisierung der Drüsen wurde unterstützt durch den Einsatz von 3,5 X-R chirurgische micro Lupen. Das Fell wurde invertiert und merken zurück ermöglicht Identifikation von intakten Mamma Fettpolster. Jeder der #4 Bauch-Drüsen wurde unverblümt zergliedert durch Verschieben der Skalpellklinge seitlich zwischen die subkutane Schicht und die Drüsen. Sofort nach der Ernte, wurden die Drüsen in 10 % neutral gepuffertem Formalin für die anschließende Gewebe Verarbeitung gelegt. Exzision der gesamten Drüse ist vorteilhaft, weil es in erster Linie eliminiert das Risiko des Ausschlusses wichtiger Gewebe-weite Wechselwirkungen zwischen duktalen Epithelzellen und andere microenvironmental zellularen Bevölkerungen, die in einer partiellen Biopsie entgehen lassen könnte. Ein Nachteil der Methode ist die Verwendung von Schnittserien aus festen Geweben die Analysen des duktalen Morphogenese und Protein Ausdruck an diskreten stellen innerhalb der Drüse begrenzt. Als solche Veränderungen in duktale Architektur und Protein-Expression in 3 Dimensionen (3D) ist nicht leicht erhältlich. Alles in allem ist die Technik auf Studien, die völlig intakt murinen Milchdrüsen für nachgelagerte Untersuchungen wie Entwicklungsstörungen duktale Morphogenese oder Brust Krebs anwendbar.

Weibliche Mäuse haben 5 paar Milchdrüsen. Insbesondere gibt es ein paar von zervikalen Drüsen (#1), zwei Paare von thorakalen Drüsen (#2 und #3), ein paar Bauch-Drüsen (#4) und 1 paar inguinalen Drüsen (#5) (Abb. 1A). Hier isoliert wir #4 Drüsen, da sie leicht zu identifizieren sind. In einigen Fällen wurden #4 und #5 Drüsen zusammen isoliert da Unterscheidung zwischen den beiden schwierig war. Zur Isolierung intakt #4 Bauch war Milc...

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Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Aufrufe.  University of Nebraska Medical Center. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.

Serie: Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Änderungen der Brustdrüsen Morphologie und Breast Cancer Risk in Ratten

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Forschung

Biologie

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...