Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KFO 196 &quot;Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen&quot;, FR 1638 / 1-2) und vom DZHK (Deutsches Zentrum für Kreislaufforschung, einem Teil der German Centres of Health Research , die eine BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung) Initiative) ist.

HINWEIS: Die Grundschritte des Isolationsverfahren sind in Abbildung 1 dargestellt Alle Schritte werden ausführlich in dem folgenden Protokoll beschrieben.. Papillarmuskel Isolation, Montage im Organbad Kammer, Erfassung und Auswertung wird in einer fortlaufenden und obligatorische Zeitskala durchgeführt. Alle Tierversuche wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren durchgeführt und wurden von der Ethikprüfung Board of Universität Heidelberg genehmigt. 1. Vorbereitung der Besetzung <ol><li> Für Kontraktionsmessungen verwenden eine Mehrkammer Organbad Setup. Komponenten einer ex vivo Kontraktilität Organbad Einrichtung sind in Abbildung 2 dargestellt. HINWEIS: Um die Zeitspanne zwischen der Herstellung der Papillarmuskel und dem Beginn der Versuchsprotokoll, einzurichten Geräte minimieren und vor vorzubereiten Puffer, um das Sammeln experimenteller tissue.This provides die größte Menge an Zeit, die das Gewebe lebensfähig bleibt, um Experimente durchzuführen. </li><li> Starten Sie Computer und Datenerfassungsgeräte. Schalten Sie Organbad Wärme (Werkseinstellung auf 32 ° C) und lassen Einheiten voreingestellte Temperatur. </li><li> Bereiten Sie den Erfassungsgeräten. Starten Sie die Aufnahme-Daten als im Softwarehandbuch erwähnt. </li><li> Prüfen und Durchführung der Kalibrierung (falls erforderlich) auf jedem Kanal und Null alle Kanäle, die von den jeweiligen Kraftwandler (mit dem Kanal zugeordneten) zugeführte elektrische Signal zu einem von einem zertifizierten Gewichts versorgt 2-g-Kraft zu standardisieren. </li><li> Schalten Sie Gasversorgung (95% O 2/5% CO 2) um Organbad Kammern. Kontinuierlich Gas alle Kammern während der gesamten Protokoll-Messungen. </li></ol> 2. Herstellung von Puffern und physiologischen Lösungen <ol><li> Vorbereitung einer Krebs-Henseleit-Pufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 119 mM NaCl zu erreichen; 25 mM NaHCO 3; 4,6 mM KCl; 11 mM Glucose; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl 2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH 2 PO 4 und pH-Wert auf 7,4 (siehe Tabelle 1 Physiologische Lösung). </li><li> Bereiten separaten Krebs-Henseleit-Pufferlösung, um während der Isolierung zu verwenden, wie in Schritt 2.1 mit zusätzlichen 30 mM 2,3-Butan Monoxim (BDM) und 50 IE Heparin / ml beschrieben. Coole Lösung auf 4 ° C (siehe Tabelle 1: Herstellung Lösung). Ischämie Simulation vorbereitet Ischämie-Lösung, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Für das Protokoll des Ca 2 + - abhängigen Kontraktilität, fügen Ca 2+ zu der Krebs-Henseleit-Pufferlösung zu angeforderten Endkonzentration. HINWEIS: bereiten diese Lösungen direkt vor seiner Verwendung und Gass mit Carbogen um die Ausfällung von Calciumcarbonat zu vermeiden. Vorwärmen Lösung auf 32 ° C vor dem Gebrauch. </li></ol> 3. Herstellung der Begasungsrohr und Dissection Dish während des Papilläre Excision Procedure verwendet <ol><li> Schließen Sie einen weichen Gassingen Rohr (Außendurchmesser 2-4 mm) auf den Gasanschluss (100% Sauerstoff, Carbogen alternativ) mit Expertenarbeits. </li><li> Erstellen Sie einen geschlossenen Ring der Begasung Rohrverbindung innerhalb der Dissektion Gericht. Punktion der Vergasungsrohr mehrmals, dass ein kontinuierlicher Blasenbildung gewährleistet ist. Diese Begasungsrohr kann mehrmals verwendet werden. </li><li> Vorbereitung Dissektion Schale mit einem Silikonelastomer an der Unterseite (0,5 cm dick), so dass die Stifte in sie gesteckt werden. Dieses Gericht kann mehrmals verwendet werden. </li></ol> 4. Isolierung des linken vorderen Papillarmuskel von Mäusen HINWEIS: Vor dem Start der Isolierung der Papillarmuskel, überprüfen, dass die Gasleitungen frei von Blockaden. <ol><li> Bereiten Organbad Setup wie im Protokoll Abschnitt 3.1 erwähnt, bevor die Vorbereitung der Papillarmuskeln. Bereiten alle Lösungen am Tag des Experiments. </li><li> Opfern Sie die Maus (ungefähr 8-12 Wochen alt) durch Genickbruch according Expertenarbeits und institutionellen Richtlinien. </li><li> Befestigen Sie das Tier in Rückenlage durch Fixierung Vorderpfoten und Hinterpfoten auf einer Dissektion Bord, öffnen Sie die Thoraxseiten auf beiden Seiten durch Schneiden durch die Rippen mit scharfen Knochen Schere, schneiden Sie dann die Membran mit einem Querschnitt. Entfernen Sie den Herzbeutel. Nun das Herz und die Aorta sind zugänglich. </li><li> Befestigen Sie das Herz mit stumpfen Pinzette auf das Gefäß truncus der Nähe des Herzens und trennen Sie die Herzen schnell mit einer Schere aus der Lunge und dem umgebenden Gewebe. </li><li> Übertragen Sie das schlagende Herz in eine Petrischale mit gekühlten Präparationslösung mit Sauerstoff (Schritt 2.2) vergast gefüllt. Lassen Sie das Herz zu schlagen und zu stimulieren Herzkontraktionen sanft über Berührung der Herzspitze mit einer Pinzette. </li><li> Sobald das Herz ist völlig exsanguinous, überträgt es auf die Dissektion Gericht mit gekühlten Präparationslösung (Schritt 2.2) gefüllt und mit O 2 begast. Von diesem Schritt auf den Einsatz ein Stereomikroskop. </li><li> Befestigen Sie das heaRT mit einem kleinen Stift durch die rechte Herzkammer, so dass das Herz von dorsal gesehen (rechte Ventrikel auf der rechten Seite aus Sicht des Bedieners befindet). </li><li> Mit Hilfe mikrochirurgischen Schere trennen die beiden Atrien auf der AV-Ebene, schneiden Bindegewebe von den Ventrikeln und entsorgen. Führen einen Schnitt durch die Kammerwand von der AV-Ventil-Pegel auf den Apex des Herzens Vermeidung jeglicher mechanischen Druck. </li><li> Öffnen Sie die Herzkammer und befestigen Sie den linksseitigen freien Wand mit einer Pinzette, damit er einen Blick auf beide linksventrikulären Papillarmuskeln. </li><li> Die ventrikuläre Gewebe lateral auf beiden Seiten der linken vorderen Papillarmuskel Erhaltung eines Teils der Klappensegel am Papillarmuskel Vorbereitung etwas weggeschnitten und berühren oder Dehnen der Papillarmuskel so viel wie möglich. Präparieren Sie die restlichen Ventrikelwand Gewebe aus dem Papillarmuskel. </li><li> Bringen Seidenfaden (7/0, metrisch 0,5) auf beiden Seiten der Papillarmuskel preptung, eine auf der Klappensegel und eine auf der Muskelteil. Befestigen Sie die Zubereitung in das Organbad Kammer mit Organbad Lösung gefüllt und mit Carbogen begast, wie Temperatur 32 ° C empfohlen. </li></ol> 5. Equilibrierung und Stimulation der Papillarmuskel <ol><li> Stimulieren die Papillarmuskel Zubereitung mit Rechteckimpulsen (Dauer 2 ms und einem Strom von 100 mA) bei Anregungsfrequenz von 1 Hz sofort nach der Fixierung im Organbad. </li><li> Stellen Sie sicher, einen häufigen Wechsel der Organbad Lösung, entweder durch kontinuierliche Veränderung oder durch häufige manuelle Wechsel (alle 5 min) nach dem Aufbau der Organbad-Typ verwendet. </li><li> Schrittweise Erhöhung der Vorspannung bis zum maximalen Zuckungskraft in erreicht. Maximalen Zuckungskraft ist erreicht, wenn die Erhöhung der Vorspannung wird von einer weiteren Steigerung in der Zuckungskraftmessungen gefolgt. </li><li> Nach 45-60 min Äquilibrierungspuffer, starten Sie den Versuchsprotokoll. </li></ol> HINWEIS: Das Versuchsprotokoll unten beschrieben umfasst Standardmanöver, um Herzkontraktilität unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu charakterisieren. In der repräsentativen Abschnitt beschreiben wir diese Protokolle im Detail zeigt auch repräsentative Ergebnisse (siehe auch Tabelle 2). <ol><li> Erfassung und Auswertung der Versuchsprotokolle <ol><li> Für die Aufnahme sollten Sie eine geeignete Software mit ausreichender zeitlicher Auflösung (Erfassungsrate ≥ 1 kHz). </li><li> Analysieren Parameter einschließlich Zuckungskraftmessungen Amplitude (Höhe), Zeit, Spannung (TTP) und halbe maximale Relaxationszeit (R 50 / tfall, respectively), wie in der Software-Programm erwähnt (als Beispiel Abbildung 5.5 ADInstruments, siehe Abbildung 4) ihren Höhepunkt erreichen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Endoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Ca2++signaling+and+Ca2++sensitizers.">Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers.</a> Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Bers, D., Despa, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K-ATPase&#8212;an+integral+player+in+the+adrenergic+fight-or+flight+response.">Na/K-ATPase&#8212;an integral player in the adrenergic fight-or flight response.</a> Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).</li><li>Bers, D. 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D., Perez, N. G., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+contractile+activation+in+intact+mouse+cardiac+muscle.">Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle.</a> J Physiol. 507, 175-184 (1998).</li><li>Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. 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G., Jewell, B. R., Wood, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+contractility+of+mammalian+myocardium+at+low+rates+of+stimulation.">Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation.</a> J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).</li><li>Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoplasmic+reticulum+Ca2++load+in+human+heart+failure.">Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure.</a> Basic Res Cardiol. 97, 163-171 (2002).</li><li>Koch-Weser, J., Blinks, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+the+Interval+between+Beats+on+Myocardial+Contractility.">The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility.</a> Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).</li><li>Bocalini, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+remodeling+after+large+infarcts+in+rat+converts+post+rest-potentiation+in+force+decay.">Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay.</a> Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).</li><li>Juggi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ischemia-reperfusion+on+the+post-rest+inotropy+of+isolated+perfused+rat+heart.">Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).</li><li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Bowditch:+the+convergence+of+cardiac+chronotropy+and+inotropy.">Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy.</a> Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).</li><li>Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+rat+left+ventricle+force+and+Ca2++-frequency+relationships:+similarities+to+dog+and+human.">Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human.</a> Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).</li><li>Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+force-interval+relationship+in+human+myocardium.">The force-interval relationship in human myocardium.</a> J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).</li><li>Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3. r. d., Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intracellular+free+calcium+concentration+during+long+exposures+to+simulated+ischemia+in+isolated+mammalian+ventricular+muscle.">Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle.</a> Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Verfahren, um die Kontraktilität von murinen Papillarmuskel in vitro, die verwendet werden können, um mehrere wissenschaftliche Fragen zu Herz Physiologie und Pathologie in Mäusen zu beantworten und um die Analyse der transgenen Linien und die Entdeckung von neuen pharmazeutischen Ansätze unterstützen untersuchen Herzfunktionsstörungen zu behandeln. Wir veranschaulichen die Anwendung dieser Methode auf physiologische, pathologischen und pharmakologischen Eigenschaf...

Die Untersuchung von Proteinen, wie Ionenkanäle beziehen ihre Rolle für die Kontraktilität des Herzens ist wichtig, verschiedene Pathomechanismen zu entdecken und neue therapeutische Strategien für Herzerkrankungen wie Ischämie und Herzversagen etablieren. Kontraktile Funktion Säugerkardiomyocyten ist bekannt, durch verschiedene Ionenkanäle, Transporter und andere Proteine ​​moduliert werden. Aktionspotential ausgelöst Aktivierung der spannungsabhängige sarkolemmalen L-Typ-Ca 2+ Kanälen führt zu Ca 2+ Einstrom von extrazellulären Raum und anschließend an Ca 2+ -induzierte Ca 2+ Freisetzung (CICR) 1, die zelluläre Kontraktions 2 auslöst. Ca 2+ -signaling eine zentrale Rolle bei der kardialen Kontraktilität und Anpassung an physiologische oder pathologische Stress spielt. Katecholamine aktivieren kardialen β-adrenergen Rezeptoren, so anregend Adenylylcyclase (AC), die cAMP synthetisiert. Aktiviert, protein Kinase A (PKA) phosphoryliert verschiedene intrazelluläre und membranassoziierten Proteinen, wie L-Typ-Ca 2+ -Kanälen, Phospholamban und Ryanodinrezeptoren was Modifikation Ca 2+ Transienten und Herzkontraktilität 1,3,4. cAMP wird von Phosphodiesterase (PDE) abgebaut wird. Aktivierung anderer als β-Adrenozeptoren Gs-gekoppelter Rezeptoren führt auch zu einer Akkumulation von cAMP. Die Technik der Kontraktilität Messungen in isolierten ventrikulären Muskel-Streifen ist gut für größere Säugetierarten 5-8 etabliert. Bezogen auf die Möglichkeit, das Gen-Targeting in Mäusen ist es wichtig, Methoden zu ermitteln und murine Herzphysiologie analysieren. Unterscheiden sich jedoch vorhandenen Daten über die physiologischen Eigenschaften isolierter Muskelpräparate Mäuse auf experimentellen Bedingungen 9-12 variiert. Das beschriebene Verfahren wird verwendet, um die Herzkontraktionsfähigkeit des linken Ventrikels Papillarmuskel pre analysierenPräparate in vitro. Untersuchung der Herzkontraktilität in Abwesenheit von Einflüssen Modifizieren Herzkontraktilität in vivo, wie Blutdruck, neurohumoral Stimulation und physikalischen oder metabolischen Stress durchgeführt. Die Schlagfrequenz des öffentlichen Muskel-Präparat kann streng definiert und beliebig verändert werden. Zuckungskraftmessungen kann im Kontext von spezifischen Stimuli wie Calciumkonzentration, Schlagfrequenz oder Temperatur analysiert werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet, um verschiedene Signalweg Komponenten zu untersuchen und die Herzleistung von genetisch veränderten Mausmodellen durch Steuern oben erwähnten Versuchsbedingungen zu vergleichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P 5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3917</td>
			<td>Hazard statement H312, solve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-?Isobutyl-?1-?methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Hazard statement H 302, solve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Hazard statement H 315-H319-H335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparine 250.000 IE/10ml</td>
			<td>ratiopharm</td>
			<td>PZN 3874685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7250</td>
			<td>Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractility measurements on isolated papillary muscles for the investigation of cardiac inotropy in mice

Papillarmuskel aus adulten Mäuseherzen isoliert verwendet werden, um Herzkontraktilität während verschiedene physiologische / pathologische Zustände zu untersuchen. Die kontraktilen Eigenschaften unabhängig von äußeren Einflüssen wie Gefäßtonus oder neurohumoral Status ausgewertet. Es zeigt einen wissenschaftlichen Ansatz zwischen Einzelzellmessungen mit isolierten Herzmuskelzellen und in vivo Studien wie Echokardiographie. So Papillarmuskel Präparate dienen als ein hervorragendes Modell, um Herzphysiologie / Pathophysiologie zu studieren und kann für Untersuchungen wie die Modulation durch pharmakologische Mittel oder die Erforschung der transgene Tiermodelle verwendet werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung des murinen linken vorderen Papillarmuskel zu Herzkontraktilität in einem Organbad Setup zu untersuchen. Im Gegensatz zu einer Muskelstreifen Zubereitung aus der Herzkammerwand getrennt, kann der Papillarmuskel in toto, ohne die Muskel tissu vorbereitet werdenE streng. Das Organbad Setup besteht aus mehreren temperaturgesteuerten, vergast und Elektroden ausgestattete Organbad Kammern. Isoliertes Papillarmuskel wird im Organbad Kammer befestigt und elektrisch stimuliert. Die hervorgerufene Zuckungskraftmessungen wird mit einem Druckaufnehmer und Parameter wie Zuckungskraftmessungen Amplitude und twitch Kinetik analysiert werden aufgezeichnet. Verschiedenen Versuchsprotokollen durchgeführt werden kann, um die Calcium- und frequenzabhängige Kontraktions sowie Dosis-Wirkungskurven von kontraktilen Mittel wie Katecholaminen oder anderen Arzneimitteln zu untersuchen. Zusätzlich können pathologische Zustände wie akute Ischämie simuliert werden.

Das Protokoll des Manuskripts für die Kontraktilität Messungen von isolierten Maus-Papillarmuskel Zubereitungen wird, um optimale Bedingungen abgestimmt, um reproduzierbare Versuchsergebnisse unter physiologischen Bedingungen zu erreichen. Um eine optimale Versuchsbedingungen definieren wir geführt Pilotversuche unterschiedlicher Organbad Temperatur und extrazellulären Calcium-Konzentration (siehe auch 12). Das hier beschriebene Protokoll wurde mit einer extrazellulären Calciumkonzentration von 1,5 mm un...

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Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Murine linksventrikulären Papillarmuskeln können verwendet werden, um Herzkontraktilität in vitro untersucht werden. Dieser Artikel beschreibt im Detail die Isolierung und experimentelle Protokolle, um die Herzkontraktionseigenschaften zu studieren.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

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Biology

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Serie: Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Forschung

Biologie

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Die Ex vivo Isoliert Skeletal Mikrogefäßdichte Vorbereitung für Untersuchung der vaskulären Reaktivität

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...