Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 unterstützt; Merit Review Award I01 BX002356 aus dem US Department of Veterans Affairs; Craig H Neilsen Stiftung 296749; Indiana-Rückenmark und Hirnverletzung Forschungsstiftung und Mari Hulman George Endowment Funds (XMX); Norton Healthcare, Louisville, KY (YPZ); Der Staat Indiana ISDH 13679 (XW); Und die NeuroCures-Stiftung.

Alle chirurgischen und tierischen Handhabungsverfahren wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und den Richtlinien der Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt. 1. Vorbereitung des Tieres und Durchführung der T10 Wirbelsäule Laminektomie <ol><li> Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente und den Metall-Wirbelsäulen-Stabilisator in einem Autoklaven. Den chirurgischen Operationstisch reinigen. Warm ein Heizkissen auf 37 ° C. Legen Sie den Heizkissen auf den Operationstisch und decken Sie ihn mit sterilen chirurgischen Vorhängen ab. Verwenden Sie sterile Technik während des gesamten Betriebs. </li><li> Verwenden Sie weibliche junge erwachsene C57 / 6J Mäuse bei 10 Wochen alt für diese Studie. Anästhesieren Sie jedes Tier mit einer intraperitonealen (ip) Injektion eines Ketamins (87,7 mg / kg) und Xylazin (12,3 mg / kg) Mischung. Bestätigen Sie die vollständige Anästhesie, indem Sie keine Antwort auf eine Paw-Pinch-induzierte Nozizeptionsstimulation auslösen. </stro<html> Ng&gt; <ol><li> Subkutane Verabreichung von Buprenorphin (0,01-0,05 mg / kg), einem Analgetikum und Carprofen (5 mg / kg), einem nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneimittel. </li></ol></li><li> Rasieren Sie die Haare über die Thorakolumbar Wirbelsäule mit einem elektrischen Clipper. Schrubben Sie die Haut mit Betadin-Lösung und 70% Alkoholtücher. </li><li> Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Hornhaut, um die Augen vor dem Trocknen während der Operation zu schützen. </li><li> Mit einem Skalpell, machen Sie eine 1,5 cm Mittellinie Hautinzision auf der Rückseite des Tieres, um die 9. bis 11. thoracic vertebral laminae. Schieben Sie das subkutane Fettgewebe rostrisch. Die paraspinalen Muskeln von den Dornfortsätzen und den Laminae zerlegen, in Richtung der seitlichen Facetten auf jeder Seite. </li><li> Positionieren Sie die Maus auf den U-förmigen Trog des Stabilisators (Abbildung 2A Und 2B ). Die rostfreien Stahlarme unter den sichtbaren Facetten des T10-Wirbels (G &quot;&gt; Abbildung 4A) und mit den an den Armen befestigten Rändelschrauben festziehen ( Abbildung 2A ). </li><li> Entfernen Sie den T10-Dornfortsatz und Lamina (Laminektomie) mit einem Mikro-Rongeur, der die Dura mater über dem Rückenmark aufdeckt (Abbildung 4B ). </li></ol> 2. Durchführen der T10-Kontusionsverletzung mit dem LISA-Impaktor <ol><li> Drehen Sie den Knopf des Druckreglers auf den Stickstofftank, um den komprimierten Stickstoff auf 20 PSI oder 138 kPa (Abbildung 1A ) für diese Studie einzustellen. HINWEIS: Der Druck ist von 10-120 PSI einstellbar. Ein höherer Druck führt zu einem höheren Aufprall. Die SCI-Gerätespitze mit einem Durchmesser von 1,2 mm ist für Mäuse ausgelegt und die Spitze mit einem Durchmesser von 2,2 mm ist für Ratten ausgelegt. Beim Wechsel von Mäusen zu Ratten kann die Spitze des größeren Durchmessers durch Zugabe eines Ringes zur Metallspitze (id 1,2 mm / od 2,2 mm) gebildet werden. Wir verwendeten die 1,2 mm Spitze in diesem Mäuse SCI sTudy Sterilisieren Sie die SCI-Spitze vor Gebrauch. </li><li> Schalten Sie den Computer ein, um die Software zu starten. Drücken Sie die Taste 1 ( Abbildung 1B ), um die Impaktorspitze in eine vollständig ausgefahrene Position zu aktivieren ( Abbildung 3A -1 ). HINWEIS: Die Funktion von Taste 1 besteht darin, den Pneumatikzylinder manuell zu aktivieren oder zu deaktivieren. </li><li> Legen Sie den U-förmigen Behälter mit der Maus auf die Bühne (Abbildung 2B ). Befestigen Sie die Bühne durch Anziehen der Rändelschrauben der Halterung (Abbildung 2B ). </li><li> Stellen Sie unter der Ziffer &quot;SET ZERO LEVEL&quot; (grün) den Nullpunkt ein, mit einem Lasersensor, der den Abstand zur vollständig ausgedehnten Kolbenspitze misst, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;START READING&quot; klicken (Abbildung 3A ). Der Abstand wird im Parameter &quot;Range&quot; in dieser Zone angezeigt ( Bild 3A ). Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;SET ZERO&quot; ( zB 8,951 mm, siehe Abbildung 3A ). </li><li> Drücken Sie die Taste 1 (Abbildung 1B ), um die Impaktorspitze zurückzuziehen (Abbildung 3B -1 , angezeigt durch einen oberen Pfeil) und entriegeln Sie die Befestigungsschraube 1 (Abbildung 2B ). Ziehen Sie die Schraube in die richtige Position ( Abb. 3B -1 , angedeutet durch einen seitlichen Pfeil), um die Spitze vom Laserstrahlengang weg zu bewegen und die Schraube um 90 ° im Uhrzeigersinn zu drehen, um die Schraube zu verriegeln. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, indem Sie die vorderen und lateralen Mikrotreiber einstellen (Abbildung 1C ), um den Laserstrahl auf die Mitte des exponierten Rückenmarks zu richten. Nachdem die Verletzungsstelle gezielt ist, messen Sie die Gewebeabstand, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;START READING&quot; unter &quot;SET INJURY L&quot; klickenEVEL &quot;-Zone (blau) ( Fig. 3B und 3B-1 ). </li><li> Langsam den Abstand zwischen dem Sensor und dem Rückenmark über den senkrechten Mikrotreiber einstellen ( Bild 1C ), um den gewünschten Verschiebungsparameter ( zB 0,500 mm, im Feld &quot;Verletzung&quot;) in der Zone &quot;SET INJURY LEVEL&quot; zu erreichen (Blau) ( Fig. 3B ). <ol><li> Wenn die gewünschte Verletzungsverlagerung erreicht ist, notieren Sie den Gewebeabstand ( zB 8,451 mm, im Parameterbereich &quot;Bereich&quot;) (Abbildung 3B ). Definieren Sie die gewünschte Verschiebung (Verletzung) = Spitzenabstand (Nullpunkt) - Gewebeabstand (Bereich) (Abbildung 3B ). Wenn die gewünschte Verletzung ( z. B. 0,500 mm Gewebeverschiebung) erreicht ist (Abbildung 3B ), klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;SET INJURY&quot; unter der Zone &quot;SET INJURY LEVEL&quot;Legen Sie die Verletzung. </li></ol></li><li> Drehen Sie die Schraube 1 90 ° gegen den Uhrzeigersinn, um die Schraube zu entriegeln, schieben Sie die Aufprallspitze wieder in die Laserstrahltrajektorie (Abbildung 3C -1 , Richtung, die durch einen Pfeil angezeigt wird) und verriegeln Sie die Schraube 1, indem Sie sie um 90 ° im Uhrzeigersinn drehen. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen unter der roten Zone &quot;RUN EXPERIMENT&quot; (Abbildung 3C ), um die Auswirkung auszuführen. Die Parameterboxen unter dieser Zone zeigen die Verletzungszeit (en), die Kraft (mV), die Geschwindigkeit (m / s) und die Verletzungsverschiebung (mm) (Abbildung 3C ). </li><li> Nachdem alle Verletzungsdaten aufgezeichnet und gespeichert sind, entfernen Sie den U-förmigen Trog mit der Maus von der Bühne. Überprüfen Sie die Rückenmarksverletzung unter einem Operationsmikroskop (Abbildung 4C ). </li><li> Naht die paravertebralen Muskeln, oberflächliche Faszie und Haut mit kontinuierlicher Naht mit 3-0 Seide (Henry Schein, 776-SK). </li><li> Injizieren thE Tier mit 1 mL 0,9% Kochsalzlösung subkutan zur Hydratation und platziert es auf ein temperaturgesteuertes Pad, bis das volle Bewusstsein wiederhergestellt ist. Legen Sie die Maus in einen Käfig mit zugänglichem Essen und Wasser. </li><li> Für die postoperative Versorgung manuell die Blase ausdrücken, bis die spontane Blase zurückkehrt. Für Analgesie injizieren Buprenorphin (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 h / Tag für 2 Tage. Wenn Harnblaseninfektion auftritt, injizieren Sie Baytril (SQ, 5-10 mg / kg in 0,1 ml, 1 Dosis täglich) für 7-10 Tage. Wenn regionale / systemische Infektion auftritt, injizieren Sie Gentamycin (SQ, 5-8 mg / kg, verdünnt in 1 ml steriler Kochsalzlösung, alle 8-12 h) für 4 Tage. </li><li> Entfernen Sie die Nahtfäden bei 14 Tagen nach dem SCI. </li><li> Am 42. Tag nach der Verletzung werden die Mäuse durch Perfusion geopfert. Nach entsprechender Anästhesie als 1,2 werden sie mit 30 ml (0,01 M) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 30 ml 4% Paraformaldehyd in 0,01 M PBS perfundiert. Ein Zentimeter des Rückenmarks einschließlich der Läsion EposEnter wird gesammelt und verarbeitet für Schnitt und histologische Analyse. </li></ol>

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</ol>

Christopher B. Shields, MD hat das Eigentum an der Louisville Injury System Apparatus (LISA) produziert von Louisville Impactor System, LLC.

Im Jahr 1911 beschrieb Allen das erste Gewichtstropfenmodell mit einem festen Gewicht, um Verletzungen an den exponierten Rückenmarken von Hunden 12 zu induzieren. Ähnliche Gewichtstropfenmodelle wurden auf der Basis des Allen-Modells entwickelt, darunter der NYU / MASCIS-Impaktor 3 , 6 , 13 , 14 . Zusätzlich zum Gewichtstropfenmodell wurden weitere SCI-Geräte erstellt. Das OSU / ESCID 5 , 7- Modell verwendet einen Gewebeverdrängungsmechanismus, um die Verletzungsschwere zu steuern, und das IH-Modell 4 , 8 verwendet Kraft, um ein abgestuftes SCI zu erzeugen. In diesen Systemen wird die Wirbelstabilisierung durch Klemmen der Dornfortsätze rostral und kaudal zur Verletzungsstelle erreicht. Diese Geräte verwenden niedrige Verletzungsgeschwindigkeiten, speziell 0,33 - 0,9 m / s (NYU / MASCIS), 0,148 m / s (OSU / ESCID),Und 0,13 m / s (IH). Die Stabilisierung der rostralen und kaudalen Dornfortsätze kann die Wirbelsäulenflexibilität und die Wirbelsäulenbewegung während des Aufpralls hervorrufen, was die Verletzungsgenauigkeit beeinträchtigen kann. Die LISA-Methode versucht, die Mängel der bestehenden Modelle zu überwinden, insbesondere in Bezug auf die Wirbelsäuleninstabilität und die geringe Verletzungsgeschwindigkeit. Diese Methode verwendet bilaterale Facettenstabilisierung und vermeidet Bewegungsartefakte, die mit der Verletzung verbunden sind. Diese Vorrichtung nutzt eine Hochschlaggeschwindigkeit, die zwischen 0,5-2 m / s 11 , 15 eingestellt werden kann. Der Lasersensor ist weiter vorgerückt als der im ESCID-Modell verwendete Ling-Vibrator und misst präzise den Abstand von der Oberfläche des Rückenmarks, ohne dass ein Gewebekontakt erforderlich ist. Das Modell wurde ursprünglich entwickelt, um ein Ratten-SCI zu produzieren, und es wurde nun angepasst, um SCI auf Mäusen und an nichtmenschlichen Primaten 16 zu produzieren, mit Modifikationen. WirbelsäuleDie Abilisierung verringert die Variabilität bei allen experimentellen SCI-Methoden, insbesondere bei Gewebeverdrängungsmodellen. Der Laserentfernungssensor bestimmt die Größe der Gewebeverdrängung des Rückenmarks bei Atembewegungen. Es ist wichtig, dass der Punkt des Rückenmarks, auf dem der Laser fokussiert ist, der identische Punkt sein sollte, der vom Impaktor getroffen wird. Dieser Schritt wird während des Kalibrierungsschrittes ( Fig. 3 ) durchgeführt, wenn die Impaktorspitze und der Laserstrahl ausgerichtet sind. Eine mögliche Schwäche dieses Modells ist, dass die Größe der Gewebeverdrängung von der Duraloberfläche gemessen wird. Obwohl die Dicke der Dura einen vernachlässigbaren Unterschied zwischen den Tieren darstellt, kann eine signifikante Variabilität im Subarachnoidalraum mit Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) auftreten. Variabilität bei Verletzungsergebnissen kann auftreten, wenn eine sehr milde Kontusionsverletzung unter Verwendung einer kleinen Gewebeverdrängung erzeugt wird. Insgesamt ist die Konsistenz der Verletzung vor allem abhängigAuf die Genauigkeit der Gewebeverdrängung und auch auf die Geschwindigkeits- und Gewebekontaktzeit des Kolbens. Der Bereich der Gewebeverdrängung ist breit (Genauigkeit: 0-10 ± 0,005 mm). Basierend auf früheren Pilotdaten und veröffentlichten Informationen bei Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten ergibt eine Verschiebung von 20% des anteroposterioren Durchmessers des SC ein mildes SCI, eine Verdrängung von 30-40% ergibt eine moderate SCI und eine Verschiebung von&gt; 50% Produziert schwere SCI bei einer Geschwindigkeit von 1 m / s. Es gibt leichte Unterschiede je nach Tierart. Die Verweilzeit ist von 0 bis 5 s über ein Zeitrelais einstellbar. In unserer Studie wurde die Verweilzeit auf 300 ms eingestellt. Dies kann leicht angepasst werden, um die Verweilzeiten anderer SCI-Geräte, einschließlich der NYU- und IH-Modelle, zu replizieren. Zusammenfassend haben wir ein verschiebungsbasiertes Modell von Continuous SCI bei erwachsenen Mäusen entwickelt. Das Modell verwendet einen U-förmigen Stabilisator, um die bilateralen Wirbelsäulenfacetten zu stabilisieren, wodurch die Schnur vermieden wirdBewegungsartefakte, die mit der lasergeführten Messung der Kordoberfläche verbunden sind. Dieses Modell kann Hochgeschwindigkeitsschnurverletzungen von 0,5-2 m / s erzeugen. Der Lasersensor ist genauer als die herkömmliche Methode, um die Geschwindigkeit und den Abstand zur Aufprallfläche zu bestimmen. Das Modell kann auf allen Ebenen Verletzungen des Rückenmarks hervorrufen, von mild bis schwer. Wenn es modifiziert wird, kann dieses Gerät auch Verletzungen bei Ratten und großen Tieren wie nichtmenschlichen Primaten hervorrufen.

Die häufigste Rückenmarksverletzung (SCI), die beim Menschen auftritt, ist ein kontaktiver SCI 1 . Um die Mechanismen der Verletzung und die verschiedenen therapeutischen Strategien nach SCI zu untersuchen, ist ein präzises, konsistentes und reproduzierbares, konsequentes SCI-Modell bei Nagetieren erforderlich. Bei der experimentellen SCI-Forschung wurden 2 , 3 , 4 , 5 , 6 viele Rückenmarksverletzungsmodelle mit verschiedenen Verletzungserzeugungsmechanismen verwendet. Drei konsequente SCI-Modelle - speziell die Toleranz-basierte New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) Impaktor 3 , 6 , die Ohio State University (OSU) Impaktor / elektromagnetische SCI-Gerät (ESCID) 5 , 7 , einD der Infinite Horizon (IH) Impaktor 4 , 8 - sind weithin im SCI-Forschungsgebiet akzeptiert. Der NYU / MASCIS-Impaktor oder ein Äquivalent produziert Verletzungen, indem er ein festes Gewicht von verschiedenen Höhen auf das Ziel-Rückenmark ablegt, um mehrere Verletzungsschweregrade 3 , 6 zu erzeugen. Die OSU / ESCID verursacht Verletzungen durch Verursachung der Gewebeverdrängung 5 , 7 . Der IH-Impaktor erzeugt eine Verletzung durch unterschiedliche Kräfte auf das Rückenmark 4 , 8 . Jeder Impaktor verwendet eine andere Geschwindigkeit, die ein wichtiger Parameter ist, der die Verletzungsergebnisse beeinflusst. Das NYU / MASCIS Gerät erzeugt Geschwindigkeiten von 0,33-0,9 m / s. Das IH-Gerät hat eine maximale Geschwindigkeit von 0,13 m / s 4 . Der OSU / ESCID-Impaktor hat eine feste Geschwindigkeit von 0,148 m / s 5 . Bemerkenswert, die Geschwindigkeiten derSe Modelle sind niedriger als die in klinischen Geschwindigkeiten, die in der Regel 1,0 m / s 9 . Hier stellen wir eine neuartige Verschiebungs-basierte Continuity-SCI-Vorrichtung vor, die Louisville Injury System Apparatus (LISA) genannt wird, um SCI bei Mäusen mit einer hohen Aufprallgeschwindigkeit 10 zu erzeugen. Dieses System umfasst einen Wirbelstabilisator, der den Wirbel am Verletzungsort fest stabilisiert und so die Produktion eines konstanten, reproduzierbaren SCI ermöglicht. Der Lasersensor des Gerätes sorgt für die genaue Bestimmung der Gewebeverdrängung und die daraus resultierende Schwere des SCI. Die Geschwindigkeit des Stößels an der Berührungsstelle mit dem Rückenmark kann von 0,5 bis 2 m / s eingestellt werden. Diese Verletzungsparameter replizieren die traumatischen SCI genau klinisch.

<table><tbody><tr><td>Ketamine (7.2 mg/mL)/Xylazine (0.475 mg/mL)/Acepromazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947</td><td>Anesthetic agent</td></tr><tr><td>Buprenorphine(0.03 mg/mL)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-9756</td><td>Pain relief agent</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>antibiotic agent</td></tr><tr><td>Purdue Products Betadine Surgerical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>for sterilizing skin</td></tr><tr><td>Dukal Gauze Sponges</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>for sterilizing skin</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>for sterilizing skin</td></tr><tr><td>1 mL NORM-JECT</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>D-78532</td><td>for anethesia/pain relief/antibiotic agent injection</td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>TERUMO</td><td>REF SS-10L</td><td>for saline injection</td></tr><tr><td>Artificial Tears Eye Ointment</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261</td><td>provent eyes from dry</td></tr><tr><td>Antiobiotic Ointment</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-877-0876</td><td>provent surgery cut from infection</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>1006015</td><td>stop bleeding</td></tr><tr><td>Instrument Sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>for sterilizing surgery tool</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>grasp tissue</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>skin cut</td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Fisher Scientific</td><td>10015-00</td><td>skin cut</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td>stop bleeding</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomy</td></tr><tr><td>Agricola Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td>keep the surgery view open</td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14040-10</td><td>for muscle seperated from spine</td></tr><tr><td>Sterile sutures</td><td>Fine Science Tools</td><td>12051-10</td><td>skin closure</td></tr><tr><td>Mouse Vertebral stabilizer</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Stabilize and expose the vertebra</td></tr><tr><td>LISA</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Produce an experimental contusion injury of the spinal cord in mice</td></tr></tbody></table>

a tissue displacement-based contusive spinal cord injury model in mice

Die Erzeugung einer konsistenten und reproduzierbaren kontinentalen Rückenmarksverletzung (SCI) ist entscheidend für die Minimierung von Verhaltens- und histologischen Variabilitäten zwischen Versuchstieren. Mehrere konsequente SCI-Modelle wurden entwickelt, um Verletzungen mit verschiedenen Mechanismen zu produzieren. Die Schwere des SCI basiert auf der Höhe, dass ein gegebenes Gewicht fallen gelassen wird, die Verletzungskraft oder die Rückenmarksverschiebung. In der aktuellen Studie stellen wir ein neuartiges Maus-Continuous-SCI-Gerät vor, das Louisville Injury System Apparatus (LISA) Impaktor, das ein verdrängtes SCI mit hoher Verletzungsgeschwindigkeit und Genauigkeit erzeugen kann. Dieses System nutzt Laserentfernungssensoren kombiniert mit fortschrittlicher Software, um abgestufte und hochreproduzierbare Verletzungen zu erzeugen. Wir führten bei den Mäusen einen Continuous SCI bei der vierten Thoraxvertebral (T10) Ebene durch, um das Schritt-für-Schritt-Verfahren zu demonstrieren. Das Modell kann auch auf die Hals- und Lendenwirbelsäule angewendet werden.

Diese Vorrichtung besteht aus fünf Hauptkomponenten: (1) einem Körper mit einer Impaktorspitze (Abbildung 1C ), (2) einem Computer mit Software (Abbildung 1B ), (3) einem elektrischen Steuerkasten (Abbildung 1B ), (4) a Wirbelstabilisator (Abbildung 2A ) und (5) Druckluft für das pneumatische Steuersystem (Abbildung 1A ). Um eine präzise Gewebeverdrängung zu induzieren, beruht das System auf einem Lasersensor, um den Abstand zwischen der vollständig ausgedehnten Kolbenspitze und der zielgerichteten Rückenmarksfläche zu messen. Die Software berücksichtigt die 4-mm-Dicke der Spitze aufgrund der Tatsache, dass der Laserstrahl nur die reflektierende Oberfläche des Impaktors erreicht (Abbildung 2B und Abbildung 3A -1 ). Es gibt zwei Positionen, an denen die Kolbenspitze platziert werden kann: (1) iN der Weg des Laserstrahls ( Fig. 3A- 1 ) oder (2) in einer seitlichen Position weg von dem Laserstrahl ( Fig. 3B- 1 ). Wenn sich der Kolben im Laserstrahlengang befindet (Abbildung 3A -1 ), misst er den Abstand von der Impaktorspitze und überwacht die Geschwindigkeit der Impaktorspitze während der Bewegung zwischen Aus- und Rückzug. Wenn sich der Kolben in der seitlichen Position weg von dem Laserstrahlengang befindet ( Fig. 3B- 1 ), wird der Abstand zwischen dem Laser und dem Rückenmark gemessen. Die Stabilisierung des T10-Wirbels mit unserem Wirbelstabilisator ist ein integraler Bestandteil des Verfahrens (Abbildung 2A ) 10 , 11 . Zuverlässige Distanzmessungen mit dem Lasersensor sind abhängig von der sDie Tabilität des Ziels, die verzerrt werden kann, wenn Bewegung vorhanden ist. Um die Genauigkeit und Konsistenz dieses Systems zu bestimmen, wurden 8 Mäuse 0,5-mm-Verdrängungsverletzungen ausgesetzt. Diese Tiere zeigten eine Verschiebungsvariabilität von ± 0,001 mm (± SD), was darauf hinweist, dass das System hochgenau und reproduzierbar ist. Fig. 4 zeigt die immobilisierten Zielwirbel in dem Stabilisator ( Fig. 4A ) und dem freiliegenden T10-Rückenmark vor ( Fig. 4B ) und nach ( Fig. 4C ) unter einem chirurgischen Mikroskop. Der Druck der Druckluft steuert die Geschwindigkeit des Impaktors zum Zeitpunkt der Verletzung. Unsere Daten zeigen, dass die Aufprallgeschwindigkeit bei einem Druck von 138 kPa 0,81 ± 0,0345 m / s (Mittelwert ± SD) beträgt. Der Drehknopf ( Bild 1B ) am Steuergerät steuertDie Dauer des Kofferkontaktes (Verweilzeit) nach der Verletzung und kann zwischen 0 und 5.000 ms eingestellt werden. Die Trinkgeldzeit in den meisten Experimenten liegt bei 0,32 ± 0,0177 s (Mittelwert ± SD) (Abbildung 5 ). Mit dieser Vorrichtung können mit Gewebeverschiebungen von 0 mm (Scheinkontrolle), 0,2 mm (leichte Verletzung), 0,5 mm (mäßige Verletzung) und 0,8 mm (schwere Verletzungen) bei erwachsenen Mäusen schwerwiegende Verletzungen auftreten (Abbildung 6 ). <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig1.jpg" /> Abbildung 1: Das Louisville Injury System Apparatus (LISA). ( A ) Das System besteht aus einem Impaktor, einem Kontrollsystem und einer Druckluftquelle. ( B ) Das Steuerungssystem umfasst eine Steuerbox und einen Laptop-Computer. Die Software und die Steuertasten der Steuerbox erlauben es dem Benutzer zu etablierenVerletzungsparameter ( C ) Der Lasersensor ist die Schlüsselkomponente des Gerätes und misst die Position des Verletzungsziels, den Abstand vom Rückenmark zum Sensor und die Verletzungsgeschwindigkeit. Die schnelle Abwärtsbewegung der Aufprallspitze erfolgt durch Druckluft. Die Lage der Verletzung und die Schwere der Gewebeverdrängung werden durch Mikrodrivers eingestellt, die die Bewegung in drei Dimensionen steuern. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig2.jpg" /> Abbildung 2: Der Stabilisator und der Maushalter. ( A ) Der Wirbelsäulenstabilisator besteht aus einem U-förmigen Trog und zwei Metallarmen, um den Mauswirbel zu halten. ( B ) Der Stabilisator wird dann auf der Aufprallvorrichtung montiert. TDie rote Linie zeigt den Laserstrahlengang an. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig3.jpg" /> Abbildung 3: Methode zur Herstellung eines Continuous SCI. ( A - C ) Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) mit drei Verletzungsparametern / Zonen wird angezeigt. ( A , A-1 ) Die grüne Zone (SET ZERO LEVEL) kalibriert den Abstand der Kolbenspitze. Die rote Linie zeigt den Laserstrahlengang an. ( B , B-1 ) Die blaue Zone wird verwendet, um die Verletzungsstufe einzustellen (SET INJURY LEVEL). Der Impaktor wird angehoben und seitlich zur rechten Seite bewegt, damit der Laserstrahl die Rückenfläche des Rückenmarks erreichen kann, um den Nullpegel einzustellen. Die rote Linie zeigt den Laser b an<html> Eam pfad ( C , C-1 ) Vor dem Aufprall wird die Spitze auf den Laserstrahlengang zurückbewegt, um die Verletzung (RUN) auszuführen. Die Verletzungsparameter befinden sich unter der roten Zone (RUN EXPERIMENT). Die rote Linie zeigt den Laserstrahlengang an. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig4.jpg" /> Abbildung 4: Verletzungsbelastung und Bewertung. ( A ) Die Metallarme des Wirbelsäulenstabilisators stabilisieren den T10-Wirbel. ( B ) T10 Laminektomie, um das Rückenmark zu entlarven, mit den dorsalen Gefäßen deutlich gesehen. ( C ) Die schlagbedingte Kontusion (Pfeil) auf der Rückenfläche des Rückenmarks bestätigt die Verletzung. Maßstab = 2 mm.G4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig5.jpg" /> Abbildung 5: Verletzungsparameter. Konsequente Verletzungsparameter umfassen Gewebeverdrängung (mm), Verletzungsgeschwindigkeit (m / s) und Spitzenverweilzeit (en). N = 8, Mittelwert ± SD. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig6.jpg" /> Abbildung 6: Histologische Bewertung. Repräsentative Querschnitte von Rückenmarken, die mit Cresylviolett und Eosin gefärbt sind, zeigen verschiebungsschwere abhängige Verletzungen nach ( A ) Schein (0 mm), ( B ) mild (0,2 mm), ( C </stronG&gt;) mäßig (0,5 mm) und ( D ) schwere (0,8 mm) anfängliche SCIs bei T10 mit dem LISA-Gerät. Bilder wurden im Verletzungs-Epizentrum aufgenommen. Maßstab = 500 μm <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Wir führen ein Gewebeverdrängungs-basiertes Continal-Rückenmarksverletzungsmodell ein, das bei erwachsenen Mäusen eine konsistente Verletzung des Rückenmarks verursachen kann.

Ein Tissue Displacement-basierte Contusive Spinal Cord Verletzung Modell in Mäusen

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

a-tissue-displacement-based-contusive-spinal-cord-injury-model-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Aufrufe.  Indiana University School of Medicine.  Wir führen ein Gewebeverdrängungs-basiertes Continal-Rückenmarksverletzungsmodell ein, das bei erwachsenen Mäusen eine konsistente Verletzung des Rückenmarks verursachen kann. 

Serie: A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Ein Modell von gequetscht Einseitige Cervical Spinal Cord Injury Mit dem Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Forschung

Medizin

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Use of genetically modified mice enhances our understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders such as a spinal cord injury (SCI). Freehand manual control used to produce a laceration model of SCI creates inconsistent injuries often associated with a crush or contusion component and, therefore, a novel technique was developed. Our model of cervical laceration SCI has resolved inherent difficulties with the freehand method by incorporating 1) cervical vertebral stabilization by vertebral facet fixation, 2) enhanced spinal cord exposure, and 3) creation of a reproducible laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm in depth without associated contusion. Compared to the standard methods of creating a SCI laceration such as freehand use of a scalpel or scissors, our method has produced a consistent lesion. This method is useful for studies on axonal regeneration of corticospinal, rubrospinal, and dorsal ascending tracts.

A novel technique to create a reproducible in vivo model of cervical spinal cord laceration injury in the mouse is described. This technique is based on spine stabilization by fixation of the cervical facets and laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm.

Controlled Cervical Laceration Verletzungen in Mäuse

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Gequetscht Modell von Rückenmarksverletzungen

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The calibrated forceps model of compression injury is a convenient, low cost, and very reproducible animal model for SCI. We used a pair of modified forceps in accordance with the method published by Plemel et al. (2008) to laterally compress the spinal cord to a distance of 0.35 mm. In this video, we will demonstrate a dorsal laminectomy to expose the spinal cord, followed by compression of the spinal cord with the modified forceps. In the video, we will also address issues related to the care of paraplegic laboratory animals. This injury model produces mice that exhibit impairment in sensation, as well as impaired hindlimb locomotor function. Furthermore, this method of injury produces consistent aberrations in the pathology of the SCI, as determined by immunohistochemical methods. After watching this video, viewers should be able to determine the necessary supplies and methods for producing SCI of various severities in the mouse for studies on SCI and/or treatments designed to mitigate impairment after injury.

Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.

Calibrated Zange Modell Spinal Cord Injury Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Neurowissenschaften

Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, thereby improving the reproducibility of the experiments.
These methods need two requirements to be fulfilled: clarity of the surgical anatomical pathway and simplicity and convenience of the laboratory device. Crucially for the operator, a clear anatomical pathway provides minimally invasive exposure, which avoids additional damage to the experimental animal during the surgical procedures and allows the animal to maintain a consistent and stable anatomical morphology during the experiment.
In this study, the use of a novel integrated platform called the SCI coaxial platform for spinal cord injury in small animals to expose the T9 level spinal cord in a minimally invasive way and stabilize and immobilize the vertebra of mice using a vertebral stabilizer is researched, and, finally, a coaxial gravity impactor is used to contuse the spinal cord of mice to approach different degrees of T9 spinal cord injury. Finally, histological results are provided as a reference for the readers.

Minimally invasive techniques and a simple laboratory device improve the reproducibility of the spinal cord injury model by reducing operative damage to the experimental animals and allowing anatomical morphology maintenance. The method is worthwhile because the reliable results and reproducible procedure facilitate investigations of the mechanisms of disease reparation.

Etablierung eines Maus-Kontusionsmodells für Rückenmarksverletzungen basierend auf einer minimal-invasiven Technik

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, ...

Establishment of Central Cord Syndrome Model in C57BL/6J Mouse

Animal models of central cord syndrome (CCS) could substantially benefit preclinical research. Identifiable anatomical pathways can give minimally invasive exposure approaches and reduce extra injury to experimental animals during operation, enabling the maintenance of consistent and stable anatomical morphology during experiments to minimize behavioral and histological differences between individuals to improve the reproducibility of experiments. In this study, the C6 level spinal cord was exposed using a spinal cord injury coaxial platform (SCICP) and combination with a minimally invasive technique. With the assistance of a vertebral stabilizator, we fixed the vertebrae and compressed the spinal cords of C57BL/6J mice with 5 g/mm2 and 10 g/mm2 weights with SCICP to induce different degrees of C6 spinal cord injury. In line with the previous description of CCS, the results reveal that the lesion in this model is concentrated in the gray matter around the central cord, enabling further research into CCS. Finally, histological results are provided as a reference for the readers.

The present protocol simulating central cord syndrome (CCS) in mice has improved repeatability and minimized operation damage to the experimental animals, avoiding disrupting the anatomical structure excessively. The strategy in this study is advantageous because it allows for research into injury mechanisms by producing consistent results.

Etablierung des Modells des Zentralschnursyndroms in der C57BL/6J-Maus

Animal models of central cord syndrome (CCS) could substantially benefit preclinical research. Identifiable anatomical pathways can give minimally ...

Ein Gerät zur Prellung von Rückenmarksverletzungen für genaue Mausmodelle

Automated Impactor for Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Spinal cord injury (SCI) due to traumatic injuries such as car accidents and falls is associated with permanent spinal cord dysfunction. Creation of contusion models of spinal cord injury by impacting the spinal cord results in similar pathologies to most spinal cord injuries in clinical practice. Accurate, reproducible, and convenient animal models of spinal cord injury are essential for studying spinal cord injury. We present a novel automated spinal cord injury contusion device for mice, the Guangzhou Jinan University smart spinal cord injury system, that can produce spinal cord injury contusion models with accuracy, reproducibility, and convenience. The system accurately produces models of varying degrees of spinal cord injury via laser distance sensors combined with an automated mobile platform and advanced software. We used this system to create three levels of spinal cord injury mice models, determined their Basso mouse scale (BMS) scores, and performed behavioral as well as staining assays to demonstrate its accuracy and reproducibility. We show each step of the development of the injury models using this device, forming a standardized procedure. This method produces reproducible spinal cord injury contusion mice models and reduces human manipulation factors via convenient handling procedures. The developed animal model is reliable for studying spinal cord injury mechanisms and associated treatment approaches.

Autor im Rampenlicht: Einblick in Innovationen in der Forschung zu Rückenmarksverletzungen

Presented here is a novel automated spinal cord injury contusion device for mice, which can accurately produce spinal cord injury contusion models with varying degrees.

Automatisierter Impaktor für das Modell einer kontusiven Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Spinal cord injury (SCI) due to traumatic injuries such as car accidents and falls is associated with permanent spinal cord dysfunction. Creation of ...

Ein Tissue Displacement-basierte Contusive Spinal Cord Verletzung Modell in Mäusen

Zusammenfassung

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Etablierung eines Maus-Kontusionsmodells für Rückenmarksverletzungen basierend auf einer minimal-invasiven Technik

Etablierung des Modells des Zentralschnursyndroms in der C57BL/6J-Maus

Automatisierter Impaktor für das Modell einer kontusiven Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Automatisierter Impaktor für das Modell einer kontusiven Rückenmarksverletzung bei Mäusen