Die Autoren danken der Stiftung Leducq (Mitralklappe) und die Agence Nationale pour la Recherche (ANR gewähren Specistem) für die Finanzierung dieser Forschung.

1. Vorbereitung Tierverfahren Holen Sie die Genehmigung aus einem Tierethikkommission und folgen den Richtlinien des Instituts für die Arbeit mit dem Virus, HuESC und / oder iPSC (wenn zutreffend), sowie Maus Handhabung, den Erhalt Maus-Embryonen und die Durchführung Maus Chirurgie. Für den Zeit Paarungen, wird der Tag des Steckers als embryonalen Tag (E) 0,5 / 0,5 Tage post-coitum. <ol><li> Mikroinjektion Nadeln: Für ex utero Mikroinjektion, mit einer Pipette Puller / Schweißkantenformer, um eine 1 oder 10 um interne Spitzendurchmesser und eine scharfe und Kegelspitzenform, DNA oder Zellen injizieren bzw. bekommen ziehen Glaspipetten (1,2 mm Außendurchmesser Borosilikat-Kapillaren). Für Ultraschall-vermittelte Injektionen, Nutzung angepasst sterile Nadeln, die eine Außen / Innendurchmesser (OD / ID) von 1,14 mm/0.53 mm, mit einer 50/35 um OD / ID-Spitze haben. </li><li> Silicon-gefüllten Petrischalen: Bereiten Silizium, wie in der Anleitung beschrieben. Füllenein sauberes Glas 60 mm Durchmesser Petrischale mit einer Elastomerschicht von ca. 1 cm. Luftblasen vermeiden. </li><li> Instrumente: Halten Sie alle chirurgischen Instrumente steril vor und während des Verfahrens. </li><li> DNA-Präparation: In 3 ug DNA und 12 ul Opti-MEM in einem Rohr. In 3 ul Lipofectamine 2000 und 12 ul Opti-MEM in einem anderen Rohr. Inkubation für 5 min bei RT und beide Lösungen. Verwenden Sie sofort. </li><li> Zellpräparation: Eine Suspension von 10 6 Zellen / ml DMEM (Dulbecco-Eagle Medium, High Glucose und 50% Rattenserum). 50 ul Zellsuspension ist genug für 8-10 Embryonen. </li><li> Dye Zubereitung: Verwenden Sie das grün fluoreszierende CDCFDA-SE bei 25 mg / ml DMSO. Es werden 20 ul Aliquots und bei -20 ° C Verdünnt 1:100 / 1:200 in steriler Kochsalzlösung oder PBS vor dem Gebrauch. </li><li> Virus Zubereitung: Einen kommerziellen 3. Generation PGK-GFP-exprimierenden Lentiviren mit einem Titer von ~ 10 9 -10 10 transducing Einheiten / ml DMEM. Für die Herstellung von Lentiviren finden Tiscornia et al. 14. Persönliche Schutzausrüstung tragen und sicher zu verwenden und zu entsorgen Virus. </li></ol> 2. Sammlung von E9.5 und E10.5 Embryonen für Ex-vivo-Injection <ol><li> Euthanize eine schwangere Maus an embryonalen Tag 9,5 bzw. 10,5. </li><li> Sterilisieren der Brust und Bauch der Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt, um den Bauch zu öffnen und rufen Sie die Uterushorn bei RT in PBS und übertragen sie nach zwei Waschungen mit PBS auf eine silikongefüllte Petrischale mit M16-Medium. </li><li> Pin das Uterushorn mit Insektenstifte auf die Silikonschicht, so dass die vaskularisierte Seite des Uterus ist an der Unterseite. </li><li> Schneiden Sie die Oberfläche des Uterus mit einer feinen Pinzette, und eine Kappe der Decidua bei 1 mm unter der Oberfläche. </li><li> Abrufen vorsichtig das Embryo im Dottersack von Ausbreiten die Wände der Decidua. </li><li> Bewahren Sie die Embryonen bei 37 °, C in M16 Medium vor der Zellinjektion. Für die Injektion wird jedem Embryo auf der Siliconschale mit M16-Medium gefüllt, auf 37 ° C vorgewärmt über </li></ol> 3. DNA oder Zellinjektion unter einem Stereomikroskop <ol><li> Füllen Sie die Glaspipette von der Rückseite mit einer Hamilton-Spritze und schütteln Sie die Pipette, um Blasen an der Spitze zu entfernen. </li><li> Stellen Sie die Pipette auf die Mikroinjektion Halter; stellen Sie den Haltedruck bis 50 (DNA) oder 30 (Zellen) hPa, und der Einspritzdruck auf 150 (DNA) bis 300 (Zellen) hPa. Stellen Sie die Einspritzzeit auf 0,2 sec (DNA) oder 0.5 (Zellen). Diese Einstellungen kann sich je nach Art der Mikroinjektor und Pipetten variieren. </li><li> Pin der Embryo auf die Silikon unten durch den Dottersack, ohne den Embryo richtig. Beobachten Sie die Region des Herzens, und öffnen Sie den Sack gerade über diese Region. </li><li> In 4 Pins um den Embryo, jede Bewegung während der Zellinjektion zu verhindern. </li><li> Mit dem Mikromanipulator (auf manuell eingestellt), slowly-Position der Pipettenspitze in einem Winkel von 45 ° über dem Herzbeutel, nur über dem Bereich des Herzens, die injiziert werden soll (Fig. 1). </li><li> Bewegen der Pipette in der Region von Interesse und die Injektion auslösen. Nehmen Sie die Pipette so schnell wie möglich. Stellen Sie sicher, das Herz richtig nach DNA / Zellinjektion zu schlagen. </li></ol> 4. Embryo, Isoliert Herz und Explantation Kultur <ol><li> Kultur die E9.5-Embryonen in 25% M2 Medium und 75% Rattenserum, Penicillin / Streptomycin, bei 37 ° C vorgewärmt und mit 40% O 2 sauerstoffhaltigen ergänzt. </li><li> 2 ml Kulturmedium in einem 25 ml Glasrohr, sanft fügen Sie den Embryo, und sauerstoff mit 40% O 2 vor dem Aufschrauben der Kappe auf dem Rohr. Inkubieren bis zu 36 Stunden bei 37 ° C unter Rotieren oder Schütteln (30 U / min). </li><li> Bei der gewünschten Zeitpunkt (zB 24 Std.), sezieren die Herzen vorsichtig mit einer feinen Pinzette, ohne sie zu berühren die Herzen, indem Sie zuerst decapitating die Embryonen; das Herz ist einfach zu Verbrauch durch Herausziehen mit der distalen Ausflusstrakt. </li><li> Kultur der isolierten Herzen für einen anderen 36-48 h in DMEM mit 50% FCS auf einer Matrigel-beschichteten Einsatz in einer 12-Well-Platte gesetzt. Siehe Dyer &amp; Patterson (2013) für ein verbessertes Protokoll von Herz Kultur 15. </li><li> Machen Sie keine Explantation der Region von Interesse. Als ein Beispiel, sezieren die atrioventrikuläre Kanal (AVC) und Kultur, die sie für 48 Stunden auf Kollagen Typ-1-Gel-16. </li></ol> 5. Ultraschall-gesteuerte Injektion in der Herz-I n utero <ol><li> Aufbau der Ultraschallgerät und Mikroinjektor: <ol><li> Verwenden Sie die hochauflösenden Ultraschallsystem mit einem 40-MHz-Wandler und die Mikroinjektion Setup auf einer Schiene. </li><li> Stellen Sie das Injektionsvolumen auf der Mikroinjektor bei 69 nl pro Injektion. Siehe Mikroinjektion im Handbuch des Herstellers für die Programmierung der Mikroinjektor. </li></ol></li><li> Herstellung des microinjection Einrichtung und Injektion: <ol><li> Stellen Sie ein Glas in der Mikropipette Mikroinjektor. Um eine effiziente Injektion erste Schicht durch Ansaugen bis zum Maximalvolumen gewährleisten die Innenseite der Pipette mit Mineralöl. Dann wieder auswerfen das Öl, so dass 1-2 mm von Öl in der Nadel. </li><li> Saugen Sie den Injektions, bis die maximale Lautstärke erreicht ist. Achten Sie darauf, dass die Oberflächen mit der Nadelspitze zu berühren, da dies die Spitze stumpf und machen Injektion schwieriger. </li><li> Zur Stabilisierung des Uterushorns, die die Embryonen während der Injektion mit einem modifizierten Petri-Schale mit einem Loch in der Mitte (2,5 cm Durchmesser), die durch eine dünne Silikonmembran mit einem kleinen Spalt in der Mitte geschnitten bedeckt, und positionieren sie über der Inzisionsstelle . Stabilisierung der Petrischale auf der Maus Handhabungstabelle durch Positionieren 3-4 Klumpen von Ton unter den Rändern der Schale. </li></ol></li><li> Injektionsverfahren: <ol><li> Rasieren Sie den Bauch einer schwangeren Maus (an der gewünschten embryonalen Stadium) vor anesthesia um Haare zu entfernen. Behandeln Sie den Bauch mit einem chemischen Haarentfernungsmittel, um restliche Haare zu entfernen und zu sterilisieren mit 70% Ethanol. </li><li> Anesthetize eine schwangere Maus mit Sauerstoff / Isofluran über eine Gesichtsmaske. Verwenden 3-5% Isofluran in 100% Sauerstoff für die anfängliche Anästhesie, während der Rest des Verfahrens, gefolgt von 1-1,5%. Stellen Sie sicher, dass die Maus ausreichend sanft kneifen die Pfoten und / oder Schwanz betäubt. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Maus Handhabung Tabelle (eingestellt auf 37 ° C erwärmen) und decken die Augen mit Schmierstoff zu Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. </li><li> Bewerben Elektroden-Gel auf den Elektroden und kleben Sie die Pfoten an den Elektroden, die Herzfrequenz, Atemfrequenz und EKG-Monitor. Positionieren Sie eine rektale Thermometer auf Körpertemperatur zu überwachen. </li><li> Überprüfen Sie zunächst, dass die Maus schwanger durch die Visualisierung und das Zählen der Embryonen durch Ultraschall ist. Bewerben Ultraschall-Gel auf den Bauch und positionieren Sie den Scankopf über der Blase. Für Konsistenz, visualisieren die erste Blase,und zählen Embryonen in der linken und rechten Uterushörner, ausgehend von der Position der Blase. Stellen Sie sicher, dass embryonale Herzen sind normalerweise schlagen. </li><li> Wenn die Maus schwanger ist, positionieren Sie den Petrischale über der Zukunft Einschnittstelle mit Ton. Drücken Sie die Schale leicht auf den Bauch, so dass das Gericht ist in direktem Kontakt. </li><li> Entfernen Sie die Schale und den Bauch wieder zu sterilisieren. Machen Sie eine 1,5-2 cm ventralen Mittellinie Schnitt von etwa 0,75 bis 1 cm über der Vagina, um den Bauch und Bauchfell zu öffnen. Verletzung innerer Organe zu vermeiden. </li><li> Exteriorisieren den linken oder rechten Uterushorn mit einer Pinzette, ziehen sanft es durch die Silizium-Membran der Schale, und stabilisieren das Gericht auf der Ton wieder. Verhindern umfangreichen Ziehen oder Manipulation, da dies Blutungen Uteringefäße und vorzeitigen Tod des weiblichen und / oder Embryonen führen. </li><li> Zählen Sie die Embryonen wieder angemessene Aufzeichnungen, von denen Embryonen injiziert zu gewährleisten. </li><li> Bewerben Ultraschall-Gel auf der uterine Hörner auf Bild, um das Herz und die Austrocknung zu verhindern. </li><li> Bild die erste Embryo injiziert werden. Überprüfen normalen Schlagen des embryonalen Herzens und Aufzeichnungen der Schädel-Schwanz-und Links-Rechts-Orientierung des Embryos. Falls erforderlich, die Position des Uterushorn leicht auf die richtige Ausrichtung zu gewährleisten. Wenn dies erweist sich als schwierig, fahren Sie mit der nächsten Embryo. </li><li> Punktion des Uterus sorgfältig mit dem Mikroinjektionsnadel, die Nadel in einem Winkel von 45 ° über dem Embryo zu positionieren, leicht außerhalb des Herzbeutels (3). Für die Kennzeichnung von epikardialen Zellen, Bild das Herz im Vierkammerblick und die Position der Nadel, so dass es auf die atrioventrikuläre Nut (Abbildung 3) zeigt. Wenn der Winkel eingestellt werden muss, ziehen Sie die Nadel und neu zu positionieren. Sie den Winkel mit der Nadel in die Gebärmutter nicht einstellen, da sich hierdurch die Nadel brechen. Vermeiden Stechen anderen Geweben, wie Gliedmaßen oder Plazenta. </li><li> Bewegen Sie die Nadelauf den Herzwand und durchstechen Sie es mit einem sanften, aber schnellen Bewegung. In der Regel wird es einigen Widerstand, aber bewegt die Nadel zu schnell kann sich der Nadelspitze, um das Herz selbst punktieren. Die Spitze sollte in die Perikardhöhle der atrioventrikulären Furche beenden. Im Fall von perikardialen Blutungen, Blutzellen wird als weißer schneeartige Muster sichtbar. Wenn dies der Fall ist, beenden Sie das Einspritzen des Embryos und nun zu einem anderen Embryo. </li><li> Injizieren Sie die Injektions. Spritzen Sie maximal 700 nl in den Herzraum, um nachteilige Auswirkungen auf die Herzen Entwicklung zu verhindern. Überwachen Sie den richtigen Einspritz durch leichte zeitliche Schwellung der Herzbeutel. </li><li> Nach der Injektion, ziehen Sie die Nadel heraus und bestätigen, dass Injektions noch ausgeworfen wird, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht durch Gewebefragmente verstopft sein. </li><li> Positionieren Sie den Umgang Tabelle für Bild und injizieren das nächste Embryo. Halten Sie die Anzahl der injizierten Embryonen auf maximal 3-4 (in einem Gebärmutterhorn) zu verhindernAnästhesie verlängert, um die Kontrolle Embryonen in der gegenüberliegenden Uterushorn zu ermöglichen und um sicherzustellen, dass das Verfahren nicht stören Embryonalentwicklung. </li><li> Nach der Injektion die gewünschte Anzahl der Embryonen, überschüssige Ultraschall-Gel und sanft legen Sie das Uterushorn zurück in den Unterleib in die richtige Position. </li><li> Schließen des mütterlichen Bauch unter Verwendung einer Schicht des Fadens für das Bauchfell-und Bauchmuskulatur, und eine zweite Schicht des Fadens für die Haut. </li><li> Spritzen Sie die Maus mit der ersten Dosis von Schmerzmitteln. Verwenden Sie eine Injektion von 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin 15 min vor Ende der Anästhesie und drei weitere Injektionen mit 12-Stunden-Intervallen. </li><li> Brechen Anästhesie und überwachen die Maus für ausreichende Erholung von dem Eingriff. Haus die schwangere Maus im Einzelkäfig für die gewünschte Dauer des Follow-up. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li><li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials.">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li><li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li><li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells.">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li><li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken.">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells.">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+the+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse.">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die oben beschriebenen intrakardialen Injektion ex vivo-Protokolle sind für die myokardiale Funktion für mindestens 48 h im mittleren Stadium (E9.5-E11.5) Maus-Embryonen erhalten. Diese Injektions Ansätze ermöglichen räumlich gezielte Injektion von DNA oder Zellen. Die wenigen Beispiele in den Figuren 1-3 gezeigt nachweisen Konzept für die Abgrenzung ex vivo und in vivo molekularen Mechanismen der Entwicklungsprozesse, die in eingeschränkter Herz Regionen, wie EMT der e...

Vor mehr als einem Jahrzehnt haben menschliche embryonale Stammzellen (HuESCs) aus menschlichen Blastozysten 1 abgeleitet. Seitdem haben sich diese Zellen zum Gegenstand einer wichtigen Forschungsgebiet, das unerfüllte Fragen in der menschlichen Entwicklungsbiologie befasst. HuESCs haben ferner vorgesehen Hoffnungen in der regenerativen Medizin. In den letzten Jahren wurden menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus patientenspezifische Körperzellen erzeugt worden ist, die Bereitstellung von Modellen Erbkrankheit 2. Viele Protokolle für die In-vitro-Differenzierung von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen zu verschiedenen Zelllinien, einschließlich Herz-Abstammungslinien 3, wurden berichtet. Die differenzierten Zellen werden oft durch Analyse von RNA und Protein-Expression, Immunfärbung und / oder in-vitro-Funktionstests phänotypisiert. Allerdings haben pluripotente Stammzelle Derivate in einem richtigen embryonalen Umgebung, um zu testen, ob sie die cel vollständig erwerben platziert werdenl Schicksal ihrer embryonalen Gegenstück, und ob sie den echten in vivo Funktion als Reaktion auf regionale Hinweise zu rekapitulieren. Während Tissue Engineering ist vielversprechend, ist es noch nicht bieten alle bekannten und unbekannten Signale der richtigen In-vivo-Entwicklung embryonalem Gewebe 4,5. Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren in Embryos, einschließlich Maus-Embryonen wurden wichtige Informationen über die Herkunft der embryonalen Zelllinien während der Herzentwicklung 6 gebracht. Beispielsweise Farbstoffinjektion in die Perikardhöhle von Maus-Embryonen ex vivo, gefolgt von in vitro-Kultur von isolierten Herzen, wurde zur epikardialen Zellen und deren Nachkommen 7 beschriftet. Allerdings Farbstoff und retroviralen Zell Kennzeichnung wurden meist auf frühe Mausembryonen mit noch schwach entwickelten Organen oder Hühnerembryonen, die leichter zugänglich sind 8 angewendet. Eine Ausnahme ist das Gehirn, die einfacher in E zum Ziel istmbryos 9,10. Ein solcher Ansatz ist noch nicht zu der embryonalen Mäuseherzen schlagen angewendet. Um mit Farbstoffen oder Virus ergänzen direkte Markierung und Linienverfolgung in weiter fortgeschrittenen Stadium Maus-Embryonen und erwachsenen Mäusen durchzuführen, hat sich die Zellmarkierung Ansatz mit der Analyse von transgenen Mäusen mit Hilfe des Cre / lox-Technologie kombiniert. Das Cre / Lox-Ansatz jedoch 11 verfügt über einige Einschränkungen aufgrund der räumlich-zeitlichen Spezifität der genomischen regulatorischen Regionen verwendet, um die Expression der Rekombinase zu fahren, und die Effizienz des Cre / Lox Rekombination 12. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht vollständig die spezifischen Fragen der Zellmigration gesteuert erfasst Zellschicksal ehen, da es nur eine Vorstufe zu kennzeichnen nach der Aktivierung der regulatorischen Region zur Cre-Expression zu fahren. Es kann auch nicht an menschlichen Embryonen zu offensichtlichen ethischen Probleme gelten. Angesichts dieser Einschränkungen, haben wir eine Reihe von neuen protocols, um eine Vielzahl von Zellmarkierungsmittel, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Viren, Modulatoren der Genexpression wie shRNA und DNA-basierte Zellmarkierung Vektoren oder Zellen der Maus Embryo E9.5 und späteren Stadien der Entwicklung in den Zielregionen der injizieren Herz. Die DNA / Zellinjektionen mit einem Stereomikroskop und eine einfache Mikroinjektionsvorrichtung kombiniert mit ex vivo Embryokultur bis zu 48 h, oder isolierte Herz-oder embryonale Explantatkultur für 48-72 Std. Wir haben auch ein Ultraschall-vermittelte Mikroinjektion Protokoll in embryonalen Maus-Herzen in utero zu melden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Entwicklung von Embryonen 13 und ermöglicht Langzeit-Follow-up der Injektate und / oder markierten Zellen. Wir fanden, dass diese Ansätze die Erhaltung der Funktion des Organs und liefern eine repräsentative Umgebung als in-vitro-Tests der Stammzellpotential. Es bietet auch die Möglichkeit, Migration folgenvon markierten und / oder injizierten Zellen, ihr Schicksal zu überwachen. Letztendlich sollten diese ein besseres Verständnis der regionalen Gewebemusterbildung und biologische Schlüsselprozesse ergeben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

Testen das Schicksal der embryonalen oder pluripotenten Stammzellen-Derivate in in-vitro-Protokolle hat zu kontroversen Ergebnissen, die nicht ihre in vivo Potential nicht unbedingt geführt. Vorzugsweise sollten diese Zellen in einer geeigneten Umgebung embryonalen um ihre definitive Phänotyp erwerben platziert werden. Zudem hat Zelllinie Tracing Studien in der Maus nach der Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren meist auf frühzeitig Maus-Embryonen mit noch schwach entwickelten Organe geblieben. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Standard-und Ultraschall-vermittelten Mikroinjektion Protokolle verschiedener Mittel in den Zielregionen des Herzens in Maus-Embryonen an E9.5 und späteren Entwicklungsstadien zu injizieren. Embryonale Explantat oder Embryonen werden dann kultiviert oder links, um in utero weiter zu entwickeln. Diese Mittel umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Virus, shRNA oder Stammzellen abgeleiteten Vorläuferzellen. Unsere Ansätze ermöglichen die Erhaltung der funktion der Orgel während der Überwachung der Migration und das Schicksal von markierten und / oder injizierten Zellen. Diese Technologien können auf andere Organe ausgedehnt werden und wird sehr hilfreich sein, wichtige biologische Fragestellungen in der Biologie der Entwicklung zu befassen.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Injektionsprotokolle können Zellen markiert und / oder in die embryonalen Maus-Herz injiziert werden. Als Proof of Concept, werden mehrere Beispiele gezeigt, in dem die Injektionsprotokoll und die Ex-vivo-AVC Explantation, isoliert Herz, oder ganze Embryokultur wurden kombiniert (Abbildung 1). Figur 1 zeigt die Herstellung des Embryos vor der Zellinjektion. Die E9.5 Embryo aus seiner Dezidua entfernt, währen...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts at JoVE.com

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  Aix-Marseille University.  Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung. 

Serie: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Forschung

Biologie

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Trennung von embryonalen Maus-Facial Ektoderm und Mesenchym

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...