Dies ist eine alternative und einfach zu bedienende Methode zur Lieferung von Genen von Interesse an befruchtete Mauseier mittels Laserperforation der Zona pellucida und lentiviralgen Genabgabe. Die laserunterstützte Perforation des Mausspenderverfahrens kann auch auf befruchtete Eier anderer Arten anwendbar sein, um den Eintritt anderer Arten von Viren oder Transfektionsreagenzien zu erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie keine speziellen Fähigkeiten für die Mikromanipulation und Mikroinjektion der befruchteten Mauseier erfordert.
Der Nachweis des befruchteten Bio-Ei-Isolationsverfahrens wird Page Myers sein, ein Forscher aus der Abteilung Vergleichende Medizin am NIEHS. 16 bis 24 Stunden nach der Paarung, isolieren Sie die Eierstöcke und Eizellen von weiblichen Mäusen mit Vaginalsteckern, nach Standardprotokollen. Wenn alle Gewebe gesammelt sind, reißen Sie die Ampulla jedes Eierstocks auseinander, und geben Sie die befruchteten Eier, umgeben von Haufenzellen, frei und übertragen Sie die Eier in cumulösen Zellen in eine 35-Millimeter-Schale, die eine x Hyaluronidase in frischem M2-Medium enthält, für eine drei- bis fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Pipette die Eier ein paar Mal, um die Cumulous-Zellen freizugeben, und übertragen Sie die Eier auf eine neue 35-Millimeter-Schale mit M2-Medium, mit Pipetten, um das Enzym abzuwaschen. Als nächstes übertragen Sie die gewaschenen Eier in eine 35-Millimeter-Schale mit Kalium-Simplex-optimiertem Medium oder KSOM und Pipette, um das restliche M2-Medium und Hyaluronidase abzuwaschen. Dann übertragen Sie die Eier auf 35 Millimeter Gewebekultur behandelt Platten mit 50 Mikroliter KSOM und zwei Milliliter Dimethylpolysiloxan für eine zweistündige Gleichgewicht bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und Sauerstoff und 90% Stickstoff gesät.
Während sich die Eier im Inkubator befinden, richten Sie den XYClone-Laser gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie sie. Wenn die Eier fertig sind, legen Sie die erste Fallplatte auf die Lasermikroskop-Stufe und fokussieren Sie die Zona pellucida manuell. Nachdem Sie bestätigt haben, dass das Laser-LED-Licht durch das Objektiv sichtbar ist, bewegen Sie die Mikroskopstufe, um die Zona mit dem LED-Laser anzuvisieren, und verwenden Sie die Computersoftware, um den XYClone-Laser auf 250 Mikrosekunden einzustellen.
Passen Sie die LED-Lichtgröße an die entsprechenden Abmessungen an, und perforieren Sie die Zona pellucida jedes Ei dreimal mit dem Laser, um drei 10-Mikrometer-Löcher zu erzeugen. Es ist wichtig, die Perforation schnell durchzuführen, aber sorgfältig, da die befruchteten Eier nicht länger als 15 Minuten außerhalb des Inkubators halten können. Dann geben Sie die perforierten Eier für weitere zwei Stunden an den Brutkasten zurück.
Behandeln Sie am Ende der zweiten Inkubation den 50-Mikroliter-KSOM-Tropfen mit zwei Mikrolitern konzentriertem Lentivirus ohne Mischen. Und die Eier für vier Tage in den Brutkasten zurückbringen. Wenn sich die Eier zu Blastozysten entwickelt haben, verwenden Sie ein nicht-chirurgisches Embryotransfergerät, um etwa 10-15 Embryonen in etwa zwei Mikroliter KSOM zu deponieren.
17 Tage nach dem Embryotransfer die schwangere Maus auf natürliche Weise zur Welt bringen oder die Neonate nach Kaiserschnitt sammeln lassen. Dann sammeln Sie Gewebe von den Welpen für die Genotypisierung, um die Rate der Transgenese zu bestimmen. Isolierte und transduzierte mausbefruchtete Eientwicklung kann täglich unter dem Mikroskop überprüft werden.
60 bis 70% der gesunden, unbehandelten Embryonen entwickeln sich innerhalb von drei bis vier Tagen zu Blastozysten. Während sich etwa 47 % der laserperforierten, transduzierten Embryonen zu Blastozysten entwickeln, von denen 85 % das übertragene Gen von Interesse ausdrücken. Das Ausrichten des Lasers, um die Zona zu verdünnen, anstatt ein Loch zu schaffen, ermöglicht es den sich entwickelnden Embryonen, von einer intakten, verkapselnden Zona pellucida zu profitieren, während sie für die lentivirale Transduktion freibleibend bleiben.
Die Transduktion mit einem rekombinanten Lentivirus, das copepodes GFP aus einem Dehnungsfaktor 1A-Promotor ausdrückt, induziert mehrere lentivirale Integrationen und eine hohe Expression von GFP unter einer blauen LED-Lampe. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Fähigkeit von Lentiviren, sich in das Wirtsgenom zu integrieren, sie zu einem leistungsstarken Werkzeug für eine stabile Genabgabe macht, aber die zufällige Integration kann auch Insertionsmutationen einleiten. Diese Technik könnte es Forschern auf dem Gebiet der Genetik ermöglichen, schnell transgene Tiermodelle für die Erforschung von Krankheiten für die In-vivo-Proteinproduktion oder für funktionelle Genstudien zu entwickeln.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Immunhistochemie an isolierten Gewebeproben von transduzierten Welpen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den Standort und das Ausmaß der Genexpression in verschiedenen Geweben von Interesse zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren extrem gefährlich sein kann. Befolgen Sie daher bitte Ihre institutionellen Richtlinien für die Arbeit mit Lentiviren.
Tragen Sie persönliche Schutzkleidung und dekontaminieren Sie alle Abfälle vor der Entsorgung.
