This work has been funded in part with federal funds from the Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS), National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contract No. HHSN272201400006C.

כל החזירים בשימוש באוסף של נתונים הבאים היו מוגנים תחת הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אוהיו (מספר פרוטוקול שימוש בבעלי החיים 2009A0134-R1). 1. הכנת ויראלי תחבורה בינונית והמדגם בקבוקי אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 37 גרם של מוח לב עירוי עד 900 מיליליטר של מים מטוהרים ומערבבים היטב עם בר מערבבים ובוחש מגנטי תוך חימום עד 70 מעלות צלזיוס לפזר את האבקה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי המרק ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מגניב על גבי הספסל עד המרק מגיע לטמפרטורת חדר. במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר, על ידי ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי, 6.02 גרם של מלח נתרן פניצילין G ו -10 גרם של סולפט סטרפטומיצין לתוך 50 מיליליטר של מים מטוהרים בטמפרטורת חדר. מוסיף מים מטוהרים נוספים כדי להביא את הנפח הכולל עד 100 מיליליטר. סנן את הפתרון דרך קרום polyethersulfone 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מחיידקים להוסיף פניצילין המסונן ופתרון סטרפטומיצין למוח לב עירוי מרק התקרר ומערבבים היטב (בר מערבבים או בקבוק מערבולת ביד) כדי להפוך את מדיום תחבורת ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מחיידקים לבדוק את ה- pH של מדיום התחבורה הנגיפי; במידת צורך, להתאים את ה- pH 7.4 ± 0.2 באמצעות HCl או NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות אבטחת איכות במדיום התחבורה הנגיפית על ידי בדיקה לשפעת חלבון מטריקס וירוס על ידי RRT-PCR, כפי שתואר על ידי ג&#39;אנג והרמון. 22 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 מיליליטר של מדיום התחבורה הנגיפי לתוך בקבוקי פוליאתילן בצפיפות גבוהה סטרילי עם קיבולת 8 מיליליטר. תווית הבקבוקונים לשימוש בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הבקבוקונים מוכנים לשימוש בcryo-תיבות סטנדרטיים ב -20 ° C עד לגביית מדגם. </li></ol> 2. אוסף של באף מגבונים מחזירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המספר המתאים של בקבוקונים מייד לפני לטעום אוסף; בקבוקון אחד יהיה צורך לחזיר שנדגמו. מפשיר בחדרטמפרטורה אורכת כ 30-45 דקות. שמור את הבקבוקונים המופשרים לקרר בשקיות קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד מגן אישי מתאים דון כפי שהוכתב על ידי המצב (למשל סרבל, כיסויי אתחול, מונשמים, אטמי אוזניים, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את השטח לבעלי החיים. במידת הצורך, להגביל את החזיר לאזור קטן אבל לא לרסן. אל תעיר נחים בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים על זוג כפפות חד פעמיות בחינה. יש להיזהר שלא לזהם את הכפפות על ידי חזירי נגיעה, אנשים, או חפצים דוממים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביד בכפפה כדי להסיר 5.08 סנטימטרים סטרילי × 5.08 סנטימטר (2 ב. × 2 ב.) תחבושת כותנה מאריזתו. יש להשתמש פדה גזת סטרילי בכל ההזדמנות אפשרית. פדה גזה עטופה בנפרד הן נוחה יותר לשימוש מאשר אלו עטופים בשתי פודים גזה לכל חבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את תחבושת כותנה עם קצות האצבעות של יד אחת לחשוף כמה שיותר משטח אפשרי לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את התחבושת על פני החוטם של החזיר, לוקחטיפול נוסף להיכנס לnares החיצוני במידת האפשר. לאסוף הפרשות מהאף גלויות (כ 1 מיליליטר) עם אותו התחבושת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה היד, לקפל את התחבושת על עצמה כדי להקל על מיקום בבקבוקון המכיל בינוני תחבורת ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מצד השני, להסיר את הכובע מהבקבוקון והנח את רפידת הגזה המקופלת לתוך הבקבוקון. לסכם את הבקבוקון ולנער את הבקבוקון כדי להבטיח הערבוב של התחבושת ובינוני תחבורת ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכפפות ומקום בקיבול מתאים. לשנות כפפות בין כל חזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא מזהה הבקבוקון. מספר שיא זיהוי חזיר, גיל, מין, סימנים קליניים, והערות אחרות הכרחית על ידי חוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל הדגימות מייד לאחר איסוף. לשקול ביצוע aliquots של המדגם לפני ההקפאה כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. בהקדם האפשרי לאחר איסוף, למקם את הדגימות על קרח יבש לתחבורה למעבדה. אחסן את הבקבוקונים ב -80° C עד הבדיקה היא יזמה. </li></ol> 3. וירוס איתור של שפעת חומצות גרעין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר הדגימות באמבט חרוז יבש 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לסיים מפשיר את הדגימות על גבי הספסל בטמפרטורת חדר למשך 20-30 דקות. בנוסף בו זמנית של כמה בקבוקונים לחרוזים יגרמו האמבטיה כדי לחמם; יש להיזהר לא לחמם יותר מדי כמו לבקבוקונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר של מדיום תחבורה נגיפי 100 μl להפקת RNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתפוקה גבוהה (96 בפורמט צלחת היטב) פלטפורמת חרוז מגנטית לחילוץ RNA ממספר גדול של דגימות. 31 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במבחני PCR טרנסקריפטאז בזמן אמת לשפעת זיהוי המהיר וירוס. 31 </li></ol> 4. בידוד של וירוס שפעת ממגבונים באף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הדגימות כפי שתואר לעיל בסעיף 3.1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדגימות מופשרים עם סולפט גנטמיצין (1,000מיקרוגרם / מיליליטר), amphotericin B (22.5 מיקרוגרם / מיליליטר), וסולפט kanamycin (325 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן לכליות כלבי מדין-דארבי (MDCK) תאי האפיתל כפי שתואר לעיל. 32 </li></ol>

<ol><li>Ma, W., Kahn, R. E., Richt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pig+as+a+mixing+vessel+for+influenza+viruses%3A+Human+and+veterinary+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Genet.+Med%22%5BJournal%5D)">The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications.</a> J. Mol. Genet. Med. 3 (1), 158-166 (2008).</li>
<li>Nelson, M. I., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+zoonosis+of+influenza+to+swine%3A+new+perspectives+on+the+human-animal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reverse zoonosis of influenza to swine: new perspectives on the human-animal interface.</a> Trends Microbiol. 23, (2015).</li>
<li>Zhou, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+reassortment+of+avian%2C+swine%2C+and+human+influenza+A+viruses+in+American+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs.</a> J. Virol. 73 (10), 8851-8856 (1999).</li>
<li>Webby, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+swine+H3N2+influenza+viruses+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States.</a> J. Virol. 74 (18), 8243-8251 (2000).</li>
<li>Vincent, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+influenza+A+virus+in+swine+worldwide%3A+a+call+for+increased+surveillance+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Zoonoses+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Review of influenza A virus in swine worldwide: a call for increased surveillance and research.</a> Zoonoses Public Health. 61 (1), 4-17 (2014).</li>
<li>Karasin, A. I., Olsen, C. W., Anderson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+characterization+of+an+H1N2+influenza+virus+isolated+from+a+pig+in+Indiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (6), 2453-2456 (2000).</li>
<li>Zhou, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+H3N2+reassortant+influenza+A+viruses+in+North+American+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of H3N2 reassortant influenza A viruses in North American pigs.</a> Vet. Microbiol. 74 (1-2), 47-58 (2000).</li>
<li>Corzo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Surveillance+for+Influenza+A+Virus+among+Swine%2C+Midwestern+United+States%2C+2009-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Active Surveillance for Influenza A Virus among Swine, Midwestern United States, 2009-2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 19 (6), 954-960 (2013).</li>
<li>Lorusso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+antigenic+characterization+of+H1+influenza+viruses+from+United+States+swine+from+2008%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic and antigenic characterization of H1 influenza viruses from United States swine from 2008.</a> J. Gen. Virol. 92 (Pt 4), 919-930 (2011).</li>
<li>Loving, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+in+pigs+of+inactivated+and+live+attenuated+influenza+virus+vaccines+against+infection+and+transmission+of+an+emerging+H3N2+similar+to+the+2011-2012+H3N2v%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficacy in pigs of inactivated and live attenuated influenza virus vaccines against infection and transmission of an emerging H3N2 similar to the 2011-2012 H3N2v.</a> J. Virol. 87 (17), 9895-9903 (2013).</li>
<li>Vincent, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+inactivated+swine+influenza+virus+vaccines+against+the+2009+A%2FH1N1+influenza+virus+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs.</a> Vaccine. 28 (15), 2782-2787 (2010).</li>
<li>Smith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolutionary+genomics+of+the+2009+swine-origin+H1N1+influenza+A+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic.</a> Nature. 459 (7250), 1122-1125 (2009).</li>
<li>Vijaykrishna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassortment+of+Pandemic+H1N1%2F2009+Influenza+A+Virus+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reassortment of Pandemic H1N1/2009 Influenza A Virus in Swine.</a> Science. 328 (5985), 1529(2010).</li>
<li>Ducatez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Reassortment+between+Pandemic+%28H1N1%29+2009+and+Endemic+Influenza+Viruses+in+Pigs%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Multiple Reassortment between Pandemic (H1N1) 2009 and Endemic Influenza Viruses in Pigs, United States.</a> Emerg. Infect. Dis. 17 (9), 1624-1629 (2011).</li>
<li>Jhung, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+variant+influenza+A%28H3N2%29+virus+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States.</a> Clin. Infect. Dis. 57 (12), 1703-1712 (2013).</li>
<li>Vincent, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+influenza+A+virus+isolated+from+pigs+during+an+outbreak+of+respiratory+disease+in+swine+and+people+during+a+county+fair+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an influenza A virus isolated from pigs during an outbreak of respiratory disease in swine and people during a county fair in the United States.</a> Vet. Microbiol. 137 (1-2), 51-59 (2009).</li>
<li>Killian, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Infection+of+Pigs+and+People+with+Triple-Reassortant+Swine+Influenza+Virus+H1N1+at+a+U.S.+County+Fair%5BTitle%5D)+AND+%22Zoonoses+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Infection of Pigs and People with Triple-Reassortant Swine Influenza Virus H1N1 at a U.S. County Fair.</a> Zoonoses Public Health. 60 (3), 196-201 (2013).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+influenza+A+%28H3N2%29+variant+virus+infection+among+attendees+of+an+agricultural+fair%2C+Pennsylvania%2C+USA%2C+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Outbreak of influenza A (H3N2) variant virus infection among attendees of an agricultural fair, Pennsylvania, USA, 2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1937-1944 (2011).</li>
<li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+interspecies+transmission+of+H3N2pM%2FH3N2v+influenza+A+viruses+at+an+Ohio+agricultural+fair%2C+July+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair, July 2012.</a> Emerg. Microbes. Infect. 1 (10), e33(2012).</li>
<li>Wells, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+influenza+virus+infections.+Transmission+from+ill+pigs+to+humans+at+a+Wisconsin+agricultural+fair+and+subsequent+probable+person-to-person+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Swine influenza virus infections. Transmission from ill pigs to humans at a Wisconsin agricultural fair and subsequent probable person-to-person transmission.</a> JAMA. 265 (4), 478-481 (1991).</li>
<li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine-to-human+transmission+of+influenza+A%28H3N2%29+virus+at+agricultural+fairs%2C+Ohio%2C+USA%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Swine-to-human transmission of influenza A(H3N2) virus at agricultural fairs, Ohio, USA, 2012.</a> Emerg. Infect. Dis. 20 (9), 1472-1480 (2012).</li>
<li>Bowman, A. S., Nolting, J. M., Nelson, S. W., Slemons, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclinical+influenza+virus+A+infections+in+pigs+exhibited+at+agricultural+fairs%2C+Ohio%2C+USA%2C+2009-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Subclinical influenza virus A infections in pigs exhibited at agricultural fairs, Ohio, USA, 2009-2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1945-1950 (2012).</li>
<li>Gray, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A%28H1N1%29pdm09+Virus+among+Healthy+Show+Pigs%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Influenza A(H1N1)pdm09 Virus among Healthy Show Pigs, United States.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (9), 1519-1521 (2012).</li>
<li>Van Reeth, K., Brown, I. H., Olsen, C. W. Ch. 40, Influenza virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Reeth%2C+K+%22Diseases+of+Swine%22">Diseases of Swine</a>. Zimmerman, J. J. , Wiley-Blackwell. 557-571 (2012).</li>
<li>Culhane, M. R., Detmer, S. E. Ch. 21, Sample types, collection, and transport for influenza A viruses of swine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCulhane%2C+MR+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Spackman, E. Animal Influenza Virus, Methods in Molecular Biology; 1161. 259-263 (2014).</li>
<li>Sheldon, C. C., Sonsthagen, T., Topel, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheldon%2C+CC+%22Animal+Restraint+for+Veterinary+Professionals%22">Animal Restraint for Veterinary Professionals</a>. , Mosby. (2006).</li>
<li>Detmer, S. E., Patnayak, D. P., Jiang, Y., Gramer, M. R., Goyal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Influenza+A+virus+in+porcine+oral+fluid+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Diagn.+Invest%22%5BJournal%5D)">Detection of Influenza A virus in porcine oral fluid samples.</a> J. Vet. Diagn. Invest. 23 (2), 241-247 (2011).</li>
<li>Goodell, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probability+of+detecting+influenza+A+virus+subtypes+H1N1+and+H3N2+in+individual+pig+nasal+swabs+and+pen-based+oral+fluid+specimens+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Probability of detecting influenza A virus subtypes H1N1 and H3N2 in individual pig nasal swabs and pen-based oral fluid specimens over time.</a> Vet. Microbiol. 166 (3-4), 3-4 (2013).</li>
<li>Romagosa, A., Gramer, M., Joo, H. S., Torremorell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+oral+fluids+for+detecting+influenza+A+virus+in+populations+of+vaccinated+and+non-vaccinated+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir.+Viruses%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of oral fluids for detecting influenza A virus in populations of vaccinated and non-vaccinated pigs.</a> Influenza Other Respir. Viruses. 6 (2), 110-118 (2012).</li>
<li>Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+snout+wipe+samples+for+influenza+A+virus+surveillance+in+exhibition+swine+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir.+Viruses%22%5BJournal%5D)">Utility of snout wipe samples for influenza A virus surveillance in exhibition swine populations.</a> Influenza Other Respir. Viruses. 8 (5), 574-579 (2014).</li>
<li>Zhang, J., Harmon, K. M. Ch. 23, RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+J+%22Animal+Influenza+Virus%22">Animal Influenza Virus</a>. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 277-293 (2014).</li>
<li>Zhang, J., Gauger, P. C. Ch. 22, Isolation of swine influenza virus in cell cultures and embryonated chicken eggs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+J+%22Animal+Influenza+Virus%22">Animal Influenza Virus</a>. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 265-276 (2014).</li>
<li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inability+to+Screen+Exhibition+Swine+for+Influenza+A+Virus+Using+Body+Temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Zoonoses+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The Inability to Screen Exhibition Swine for Influenza A Virus Using Body Temperature.</a> Zoonoses Public Health. , (2015).</li>
<li>Prickett, J. R., Kim, W., Simer, R., Yoon, K. J., Zimmerman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral-fluid+samples+for+surveillance+of+commercial+growing+pigs+for+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+and+porcine+circovirus+type+2+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Swine+Health+Prod%22%5BJournal%5D)">Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections.</a> J. Swine Health Prod. 16 (2), 86-91 (2008).</li>
<li>Prickett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+infection+in+porcine+oral+fluid+samples%3A+a+longitudinal+study+under+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Diagn.+Invest%22%5BJournal%5D)">Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions.</a> J. Vet. Diagn. Invest. 20 (2), 156-163 (2008).</li>
<li>Pepin, B., Liu, F. F., Main, R., Ramirez, A., Zimmerman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+oral+fluid+from+individually+housed+sows%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Swine+Health+Prod%22%5BJournal%5D)">Collection of oral fluid from individually housed sows.</a> J. Swine Health Prod. 23 (1), 35-37 (2015).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

איסוף דגימות מחזירים באמצעות מטליות האף-הטה פוליאסטר הוכיח שימושי בניהול מעקב IAV; עם זאת, השימוש בנוהל ספוגית האף מעכב את מאמצי מעקב עקב השימוש הנדרש של מלכודת לאיפוק. מגבוני האף מייצגים עידון של טכניקות דגימת חזירים הנוכחיות כדי למזער את הלחץ על אנשים וחזירים במהלך איסוף דגימה. בעוד השיטה פותחה ולמאומתת בהגדרות חזירים תערוכה, זה יכול להיות מיושם בקלות למצבים אחרים שבם זיהוי אנטה-מורטם של IAV בחזירים יש צורך (כלומר חזירים מסחריים, שווקי בעלי החיים חיים, מחקר ביו-רפואי, וכו &#39;) כפי שצוין לעיל, הנהג העיקרי של טכניקת דגימה זו היה אוכלוסיית החזירים תערוכה. במהלך ירידים חקלאיים, בעלי החזירים להתחרות להרוויח פרסים ומוניטין פיננסיים בהתבסס על הרכב הכולל של החזיר. עדויות אנקדוטיות מצביעות על כך שאם חזיר לא מוצג היטב, owners יכול לייחס אותו לרמת הלחץ של החזיר באיפוק ובאיסוף דגימה. מגבוני האף שימושיים למאמצי מעקב שכוללים בעלי חיים בודדים דגימה בהגדרות שדורשות מתח נמוך של בעלי חיים. היכולת להימנע snaring וחזירים בעליל מצערים בעת ביצוע האף לנגב טכניקה השתפרה קבלה ציבורית של מאמצי מעקב IAV בחזירי תערוכה. 33 טבע המתח הנמוך של האף לנגב שיטה גם עושה את זה גם מתאים למשקים חזירים מסחריים. יתר על כן, אף למחוק שיטה יכולה לסייע בהפחתת עלויות מכיוון שהיא דורשת פחות כוח אדם, ואינו מחייבת הכשרה מיוחדת. בנוסף לאף מטליות, צורה אחרת נפוץ של זיהוי הפתוגן בחזירים מסחריים כרוכה מאפשרת חזירים שהם שוכנו יחד ללעוס חבל כותנה שהושמה בעטם. הם להפקיד נוזלים דרך הפה שניתן לאסוף מהחבל. 27,34,35 produ אוסף נוזל בעל פהתוצאות CES, המבוססות על דגימות שנאספו מקבוצה של בעלי חיים ויש לו מגבלות ללימודי שכיחות הפתוגן או העברת. בנוסף, בידוד IAV מנוזלים דרך הפה היה עני. 29 נוזלים שבעל פה היו בשימוש במשך חזירים בודדים אבל את הזמן הנדרש כדי לתלות את החבלים ולחזירים כדי להרוות את החבלים יכולים להיות לא יעילים במשאבי כוח אדם. 36 שימוש במגבוני האף מאפשר ל הערכה מהירה של בעלי חיים בודדים. היכולת הן לזהות ולבודד IAV ממגבוני האף מספקת יתרון בולט על פני נוזלים דרך הפה. כמו שיטות דגימה אחרות, מגבוני האף עשויים להיות יעילים ביותר בשפיכת ויראלי שיא. יש כמה מגבלות הקשורות לאף לנגב שיטה שיש לשקול לפני יישום הנוהל. חזירים הם בעלי חיים סקרנים ששורש עם חרטומיהם. לעתים קרובות יש שנאסף על האף לנגב, בהשוואה למטליות האף פסולת יותר, בגלל הסביבה הלחה, המלוכלכתלנגב אנשי קשר בצד החיצוני של חוטם החזיר. הקשר בין האף לנגב מצע והחזיר מוגבל למשטח חיצוני יותר של הדרך נשימה מאף מטליות, מצב שלעתים קרובות תוצאות בתצהיר לא מכוון של פסולת סביבתית (כלומר מצעים, הזנה, זבל, וכו &#39;) על האף מגבונים. מזהמים סביבתיים אלה יכולים לעכב PCR או לגרום לרעילות תאית במהלך ניסיונות בידוד נגיפיים. הניקיון של מיקום דגימה ורמות סביבתית פסולת ייתכן שיהיה הצורך להעריך לפני שנמשיך עם האף לנגב פרוטוקולים. המופע של זיהום הסביבתי של מגבוני האף גם אומר שIAV מזוהה עם שיטה זו לא יכולה הייתה לשפוך על ידי בעלי החיים שנבדקו, אלא היה נוכח בסביבה. בעוד היכולת לייחס IAV לבודד לבעלי חיים מסוימים לא יכולה להיות דאגה לפעילויות מעקב או אבחון עדר בסיס, זה עשוי להיות מגבלה לשקול לTR מעבדה מבוססתמחקרי ansmission. נושא נוסף שיש לטפל לפני הבחירה בשיטה זו היא שטח האחסון והתחבורה עלה כי מספר גדול של האף לנגב דגימות תדרוש. הבקבוקונים המשמשים למגבונים הם הרבה יותר גדולים מבקבוקוני אחסון 2 מיליליטר קריוגני הסטנדרטי המשמשים לאחסון ספוגית האף וייקחו כשלושה עד ארבעה פעמים יותר מקום במקפיא לאחסון ארוך טווח והחלל קריר לתחבורה בחזרה למעבדה. אחסון דגימות לתקופות ממושכות של זמן בטמפרטורת חדר, תחת קירור, או הדגימות מפשירה-הקפאה כל התוצאה בירידה של כדאיות וירוס. טיפול נוסף צריך להילקח בעת הפשרת דגימות אלה. בגלל הגזה סופגת הרבה של מדיום התחבורה הנגיפי, דגימות להתחמם יתר על המידה במהירות באמבט חרוז יבש. בטעות התחממות יתר הדגימות במהלך תהליך ההפשרה יכולה גם לגרום לירידה של כדאיות וירוס. כמו כן, בשל ירידה בהתאוששות IAV במבחנה מcomp המגבוניםהנגר למטליות, מומלץ שאף המגבונים לא ניתן להשתמש במצבים הדורשים רגישות גבוהה להתאוששות וירוס קיימא. 30 שימוש מוצלח של מעקב IAV בחזירים על ידי האף לנגב שיטה יכולה לגרום בקלות רבה יותר של דגימה, קבלה מוגברת של מאמצי מעקב, ופחות לחץ על בעלי החיים. בעתיד, זה עשוי להיות שימושי עבור דגימת חזירים בכניסה ליריד או לבדיקת מתח הנמוך של חזירים בודדים בעדרי חזירים מסחריים. שיטה זו יכולה להיחקר לשימוש לזיהוי פתוגנים אחרים של דרכי הנשימה בחזירים. משום חזירים לשחק תפקיד קריטי בהופעה של זני IAV רומן, המשיך מעקב פעיל לIAV בחזירים הוא קריטי. ככזה, שיטה זו יכולה לסייע בחקירת האיתור ואפידמיולוגיים של זנים המתהווים של IAVS רומן.

<html> נגיפי שפעת (IAV) גורמים למחלות בדרכי הנשימה במינים רבים, כוללים ציפורים מקומיות, חזירים, ובני אדם. בשל reassortment של האבולוציה הנגיפית המהירה הגנום IAV המפולח יכול להתרחש וזני IAV חדשים לעתים קרובות להופיע. חזירים הם מינים שיכולים לשמש ככלי לערבוב reassortment של IAVS ממיני מארח מרובים. 1 כרגע יש שלושה תת-סוגים עיקריים של IAV מחזור נפוץ בקרב חזירים בצפון אמריקה (H1N1, H1N2, H3N2), אבל יש לי היכרויות IAV מרובות מבני האדם הוביל לגיוון IAV הנרחב בתוך תת אלה. 2 אבולוציה מהירה של IAVS הדבקת חזירים הייתה ברורה מאז 1998 כאשר reassortant משולש IAV המכיל קטעי גן מוירוסים אנושיים, עופות וחזירים 3 הפכו נפוצים בקרב חזירים בארצות הברית. 4 הגן הפנימי קטעים שמIAV reassortant המשולש יישארו נפוצים מאוד בקרב IAVS הדבקת חזירים כיום. 5 &quot;&gt; ברחבי העולם, IAV הוא גורם משמעותי למחלות בדרכי הנשימה בחזירים שבסימנים קליניים אופייניים כוללים חום, אנורקסיה, עייפות, שיעול, נשימה מאומצת, התעטשות, נזלת ועלייה במשקל ירוד. IAV יכול להיות יקר במיוחד לזרוע חוות שבי רבייה כישלון בשל חום וחזירונים נולדו חלשים-induced IAV תועד. 6,7 בתוך ארצות הברית, IAV מזוהה בדרך כלל בעדרי חזירים מסחריים ומגוון הנרחב אנטיגני וגנומי ופיתוח המתמשך בין החזירים הדבקת IAV עכב שליטה של זה וירוס. 8-11 חששות לבריאות ציבור על הופעתה של מתח IAV מגיפה כתוצאה מreassortment בחזירים מומשו בשנת 2009 כאשר IAV חזירים שושלת מכיל קטעים מגן השושלת המשולשת reassortant צפון אמריקה חזירים ושושלת חזירים כמו עופות האירו גרם למגפה בעולם בבני אדם. 12 (pdm09 A (H1N1)) הנגיף מאזreassorted עם חזירים אנדמיים IAV זני 13,14 וחלק מהזנים חדש reassorted אלה הועבר בחזרה לבני אדם. 15 התדירות של אירועים והופעתה של זנים חדשים IAV עם פוטנציאל מגיפה עושה מעקב פעיל של מחזורי וירוסי IAV בחזירים הכרחיים reassortment, במיוחד בממשק החזירים-אדם. ממשק החזירים-אדם הוא חשוב להעברת interspecies דו-כיוונית של IAV. אדם לחזירי שידור מתרחש בייצור חזירים מסחרי אחראי לכמות גדולה של גיוון IAV כיום קיים באוכלוסיית החזירים. ירידים חקלאיים הם ההגדרות הגדולות ביותר לcomingling של אנשים וחזירים בארצות הברית וידועים באתרים להעברת zoonotic של IAV. 15-21 בשנת 2012, במהלך פרוץ גרסת H3N2 IAV, 93% מהמקרים מדווחים נוכחות ב הוגן חקלאית בימים שקדם לתחילתה של מחלה. 15 ניתוח הגנוםשל בידודים נגיפיים מחזירי תערוכה לעומת מבודדים אנושי אישר העברת zoonotic. חזירים 21 תערוכה נגוע בIAV לעתים קרובות לא מראה סימנים קליניים של מחלה, 21-23 המציינים את הצורך בבדיקות אבחון ישירים. דגימה של חזירים חולים בעליל לבד לא לזהות בהצלחה שכיחות IAV בחזירים ולא ניתן לסמוך על לזהות זנים חדשים של IAV מתעוררים בקרב חזירים. מעקב פעיל הוא הכרחי לצורך זיהוי של זנים המתעוררים מIAV בחזירים ולהעריך האיום שלהם עבור שני חזירים ובריאות הציבור. רוב פעילויות מעקב IAV הן מרצון ולכן יש צורך בשיטות זעיר-מפריעות. שלושה הליכי גביית מדגם גדולים אנטה-מורטם לIAV הדבקת חזירים הם: מטליות האף, נוזלים דרך הפה, ומגבוני האף. המלצות נוכחיים לדגימת חזירים בודדים כדי לזהות רשימת IAV החדרת סינטטי הסיבים הטו מטליות לנחיריים כשיטת המועדפתלאסוף הפרשות מהאף ותאי האפיתל. 24,25 בגלל חזירים עלולים לנסות להימנע מהליך זה, צוות של אנשים מיומנים חייבים לרסן את החזירים באופן ידני או עם מלכודת תלוי בגודל של החיה. 26 תהליך האיפוק הוא מייגע ל כוח אדם, ומלחיץ עבור החזירים. בנוסף, חזירים תערוכה לעתים קרובות מעורבים בתחרויות מרובות ביריד כך התפיסה של מתח הוסיף על בעלי חיים תחרות יכולה לעשות בעלים עמידים למאמצי המעקב. בהסתברויות של זיהוי IAV החל 80-100% בIAV עדרים נגועים, נוזלים אוראליים הפכו חלופה פופולרית לאף מטליות לזיהוי המולקולרי של IAV באוכלוסיות של חזירים. 27,28 בנוסף, נוזלים דרך הפה עשוי לספק חלון רחב יותר של זיהוי IAV מ מטליות האף בעקבות זיהום ראשוני. עם זאת, בידוד IAV מנוזלים דרך הפה היה בעייתי עם רק 50% מניסיונות בידוד נגיף וכתוצאה מכך IAV התאוששות. 29 שימוש במגבוני האף במקום מטליות האף במהלך מעקב IAV בחזירים מתגבר על המגבלות שתוארו לעיל. מגבוני האף אינו דורשים שימוש במלכודת הרחקה וניתן לבצעו ללא הדגיש בעלי החיים או עדים של ההליך. יש צורך בהכשרה טכנית מינימאלית כדי לאסוף מגבוני האף, המאפשר אנשי מקצוע שאינה וטרינרית, לרבות בעלי חזירים, כדי לאסוף את דגימות המעקב. מגבוני האף הושוו בעבר למטליות האף לזיהוי והבידוד של וירוס שפעת 30 והפרוטוקול מפורט לשיטה לא פולשנית של דגימה מתואר להלן.

<table><tbody><tr><td>BBL Brain Heart Infusion</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G Sodium Salt</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>021194537</td><td>1500 u/mg</td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>AMRESCO LLC</td><td>0382</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Solution</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Amphotericin B Solution</td><td>Fisher</td><td>S 24 25</td><td>250 ug/ml</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Teknova</td><td>K2105</td><td>5000 ug/ml</td></tr><tr><td>TPP Rapid Filtermax System</td><td>TPP Techno Plastic Products AG&amp;nbsp;</td><td>99150</td><td></td></tr><tr><td>Nalgen Diagnostic Bottles</td><td>Thermo Scientific</td><td>342002-9025</td><td>HDPE with white PP closure</td></tr><tr><td>Dermacea Gauze Sponge, 8 ply</td><td>Covidien</td><td>441211</td><td>5.08 cm &amp;times; 5.08 cm (2 in. &amp;times; 2 in)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nitrile Exam Gloves</td><td>Saftey Choice</td><td>19-170-010 (A-D)</td><td></td></tr></tbody></table>

nasal wipes for influenza a virus detection and isolation from swine

מעקב לנגיפי שפעת בחזירים הוא קריטי לבריאות אדם ובעלי החיים, כי שפעת וירוס במהירות מתפתח באוכלוסיות חזירים וזנים חדשים צצים ללא הרף. חזירים יכולים להיות נגוע על ידי שושלות שונות של נגיף שפעת שהופכים אותם מארחים חשובים להופעה והתחזוקה של שפעת רומן זני וירוס. דגימת חזירים בהגדרות מגוונות כגון חוות מסחריות חזירים, ירידים חקלאיים, ושווקי החי חשוב לספק תמונה מקיפה של מחזור כיום זני IAV. הטכניקה הנוכחית הזהב סטנדרטי אנטה-מורטם הדגימה (כלומר אוסף של מטליות האף) היא עבודה אינטנסיבית מכיוון שהיא דורשת איפוק פיזי של החזירים. מגבוני האף כרוכים משפשפים את פיסת הבד על פני החוטם של החזיר עם מינימאלי ללא ריסון של בעלי החיים. האף לנגב הליך הוא פשוט לביצוע ואינו דורש כוח אדם עם וטרינרים מקצועיים או הכשרת טיפול בבעלי חיים. While מעט פחות רגיש ממטליות האף, שיעורי זיהוי וירוסים ובידוד מספיקים כדי להפוך את האף מגבוני חלופה לדגימת חזירים בודדים כאשר שיטות דגימה נמוך מתח נדרשות. פרוטוקול ההליך מתאר את הצעדים הדרושים כדי לאסוף האף קיימא למחוק מחזיר בודד.

שימוש מוצלח בשיטה זו מניבה RRT-PCR תוצאות ש, מלווה בשימוש בבקרה פנימית במהלך הפקת RNA וRRT-PCR, דגימות תכנית לא הכילו מעכבי PCR מכל פסולת סביבתית הרימה במהלך דגימה. לאחר חיסון מדגם, בארות בידוד וירוס צריכה להיות חופשיות של פסולת סביבתית גלויה מהמדגם. יש הסכמה סבירה בין תוצאות RRT-PCR ותוצאות בידוד נגיף מתוך ההבנה שPCR לעתים קרובות מניב שיעור חיובי גבוה יותר מאשר IAV בידוד נגיף בגלל PCR מזהה חומצת גרעין נגיפית, לא וירוס קיימא בהכרח. תוצאות מראות כי מגבוני האף הם אלטרנטיבה שימושית לאף מטליות, אשר טכניקת הדגימה סטנדרטי זהב הנוכחית לIAV. אדוארדס et al. בוצע השוואה של מגבוני חוטם ומטליות האף שנאספו מחזירים בירידים חקלאיים בארצות הברית במהלך שנת 2013. במחקר זה, חזירי נדגמו עם שני האף<html> מטליות ומגבוני האף והדגימות היו מבחן במקביל RRT-PCR ובידוד נגיף. אדוארדס et al. דיווח ההתאמה לשניהם זיהוי ובידוד של IAV ידי RRT-PCR ובידוד נגיף בתאים בתרבית הודגמה על ידי ההשוואה של ספוגית האף לזווג 553 ואף למחוק דגימות. 30 דגימות נבדקו אלה, 93.5% (517/553) תוצאות בדיקת RRT-PCR היו בהסכם (טבלת 1) ו92.4% (511/553) היו בהסכם שימוש בידוד נגיף בתאי MDCK (טבלה 2). 21 רגישות RRT-PCR המשוער למגבוני האף לעומת ספוגיות האף היה 92.9% ורגישות בידוד IAV המשוערות למגבוני האף לעומת ספוגיות האף היו 82.9%. אדוארדס et al., ציין בעבר כי מגבוני האף שהיו חיוביים הן על ידי RRT-PCR ובידוד נגיף בממוצע ערך נמוך CT (24.32) מ מגבוני האף שהיו חיוביים בRRT-PCR אבל שליליים לבידוד נגיף (CT = 31.96). 21 &quot;Jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53313/53313table1.png" /> טבלת 1: זיהוי RRT-PCR של שפעת וירוס ממטליות האף ומגבוני חוטם שנאספו מחזירים בירידי מחוז 29 (מאדוארדס ואח &#39;(2014) שירות של חוטם לנגב דגימות לשפעת מעקב וירוס באוכלוסיות חזירים תערוכת השפעת ו.. נשימה אחר וירוסי 8 (5), 574-579. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/53313/53313table2.png" /> טבלה 2: בידוד של וירוס שפעת ממטליות האף ומגבוני חוטם שנאספו מחזירים בירידי מחוז 29 (מאדוארדס ואח &#39;(2014) שירות של חוטם לנגב דגימות לשפעת מעקב וירוס באוכלוסיות חזירים תערוכת שפעת ווירוסים בדרכי הנשימה אחרות.. 8 (5), 574-579.)

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine at JoVE.com

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

nasal-wipes-for-influenza-a-virus-detection-and-isolation-from-swine

Universidad Científica del Sur

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.4K Views.  The Ohio State University. The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses. 

Video: Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

זיהוי של וירוסים Bioaerosols באמצעות אניון Exchange שרף

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Environment

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...