This work has been funded in part with federal funds from the Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS), National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contract No. HHSN272201400006C.

כל החזירים בשימוש באוסף של נתונים הבאים היו מוגנים תחת הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אוהיו (מספר פרוטוקול שימוש בבעלי החיים 2009A0134-R1). 1. הכנת ויראלי תחבורה בינונית והמדגם בקבוקי אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 37 גרם של מוח לב עירוי עד 900 מיליליטר של מים מטוהרים ומערבבים היטב עם בר מערבבים ובוחש מגנטי תוך חימום עד 70 מעלות צלזיוס לפזר את האבקה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי המרק ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מגניב על גבי הספסל עד המרק מגיע לטמפרטורת חדר. במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר, על ידי ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי, 6.02 גרם של מלח נתרן פניצילין G ו -10 גרם של סולפט סטרפטומיצין לתוך 50 מיליליטר של מים מטוהרים בטמפרטורת חדר. מוסיף מים מטוהרים נוספים כדי להביא את הנפח הכולל עד 100 מיליליטר. סנן את הפתרון דרך קרום polyethersulfone 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מחיידקים להוסיף פניצילין המסונן ופתרון סטרפטומיצין למוח לב עירוי מרק התקרר ומערבבים היטב (בר מערבבים או בקבוק מערבולת ביד) כדי להפוך את מדיום תחבורת ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מחיידקים לבדוק את ה- pH של מדיום התחבורה הנגיפי; במידת צורך, להתאים את ה- pH 7.4 ± 0.2 באמצעות HCl או NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות אבטחת איכות במדיום התחבורה הנגיפית על ידי בדיקה לשפעת חלבון מטריקס וירוס על ידי RRT-PCR, כפי שתואר על ידי ג&#39;אנג והרמון. 22 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 מיליליטר של מדיום התחבורה הנגיפי לתוך בקבוקי פוליאתילן בצפיפות גבוהה סטרילי עם קיבולת 8 מיליליטר. תווית הבקבוקונים לשימוש בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הבקבוקונים מוכנים לשימוש בcryo-תיבות סטנדרטיים ב -20 ° C עד לגביית מדגם. </li></ol> 2. אוסף של באף מגבונים מחזירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המספר המתאים של בקבוקונים מייד לפני לטעום אוסף; בקבוקון אחד יהיה צורך לחזיר שנדגמו. מפשיר בחדרטמפרטורה אורכת כ 30-45 דקות. שמור את הבקבוקונים המופשרים לקרר בשקיות קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד מגן אישי מתאים דון כפי שהוכתב על ידי המצב (למשל סרבל, כיסויי אתחול, מונשמים, אטמי אוזניים, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את השטח לבעלי החיים. במידת הצורך, להגביל את החזיר לאזור קטן אבל לא לרסן. אל תעיר נחים בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים על זוג כפפות חד פעמיות בחינה. יש להיזהר שלא לזהם את הכפפות על ידי חזירי נגיעה, אנשים, או חפצים דוממים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביד בכפפה כדי להסיר 5.08 סנטימטרים סטרילי × 5.08 סנטימטר (2 ב. × 2 ב.) תחבושת כותנה מאריזתו. יש להשתמש פדה גזת סטרילי בכל ההזדמנות אפשרית. פדה גזה עטופה בנפרד הן נוחה יותר לשימוש מאשר אלו עטופים בשתי פודים גזה לכל חבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את תחבושת כותנה עם קצות האצבעות של יד אחת לחשוף כמה שיותר משטח אפשרי לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את התחבושת על פני החוטם של החזיר, לוקחטיפול נוסף להיכנס לnares החיצוני במידת האפשר. לאסוף הפרשות מהאף גלויות (כ 1 מיליליטר) עם אותו התחבושת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה היד, לקפל את התחבושת על עצמה כדי להקל על מיקום בבקבוקון המכיל בינוני תחבורת ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מצד השני, להסיר את הכובע מהבקבוקון והנח את רפידת הגזה המקופלת לתוך הבקבוקון. לסכם את הבקבוקון ולנער את הבקבוקון כדי להבטיח הערבוב של התחבושת ובינוני תחבורת ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכפפות ומקום בקיבול מתאים. לשנות כפפות בין כל חזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא מזהה הבקבוקון. מספר שיא זיהוי חזיר, גיל, מין, סימנים קליניים, והערות אחרות הכרחית על ידי חוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל הדגימות מייד לאחר איסוף. לשקול ביצוע aliquots של המדגם לפני ההקפאה כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. בהקדם האפשרי לאחר איסוף, למקם את הדגימות על קרח יבש לתחבורה למעבדה. אחסן את הבקבוקונים ב -80° C עד הבדיקה היא יזמה. </li></ol> 3. וירוס איתור של שפעת חומצות גרעין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר הדגימות באמבט חרוז יבש 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לסיים מפשיר את הדגימות על גבי הספסל בטמפרטורת חדר למשך 20-30 דקות. בנוסף בו זמנית של כמה בקבוקונים לחרוזים יגרמו האמבטיה כדי לחמם; יש להיזהר לא לחמם יותר מדי כמו לבקבוקונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר של מדיום תחבורה נגיפי 100 μl להפקת RNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתפוקה גבוהה (96 בפורמט צלחת היטב) פלטפורמת חרוז מגנטית לחילוץ RNA ממספר גדול של דגימות. 31 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במבחני PCR טרנסקריפטאז בזמן אמת לשפעת זיהוי המהיר וירוס. 31 </li></ol> 4. בידוד של וירוס שפעת ממגבונים באף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הדגימות כפי שתואר לעיל בסעיף 3.1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדגימות מופשרים עם סולפט גנטמיצין (1,000מיקרוגרם / מיליליטר), amphotericin B (22.5 מיקרוגרם / מיליליטר), וסולפט kanamycin (325 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן לכליות כלבי מדין-דארבי (MDCK) תאי האפיתל כפי שתואר לעיל. 32 </li></ol>

<ol>
	<li>Ma, W., Kahn, R. E., Richt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pig+as+a+mixing+vessel+for+influenza+viruses:+Human+and+veterinary+implications.">The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications.</a> J. Mol. Genet. Med. 3 (1), 158-166 (2008).</li><li>Nelson, M. I., Vincent, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+zoonosis+of+influenza+to+swine:+new+perspectives+on+the+human-animal+interface.">Reverse zoonosis of influenza to swine: new perspectives on the human-animal interface.</a> Trends Microbiol. 23, (2015).</li><li>Zhou, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+reassortment+of+avian,+swine,+and+human+influenza+A+viruses+in+American+pigs.">Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs.</a> J. Virol. 73 (10), 8851-8856 (1999).</li><li>Webby, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+swine+H3N2+influenza+viruses+in+the+United+States.">Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States.</a> J. Virol. 74 (18), 8243-8251 (2000).</li><li>Vincent, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+influenza+A+virus+in+swine+worldwide:+a+call+for+increased+surveillance+and+research.">Review of influenza A virus in swine worldwide: a call for increased surveillance and research.</a> Zoonoses Public Health. 61 (1), 4-17 (2014).</li><li>Karasin, A. I., Olsen, C. W., Anderson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+characterization+of+an+H1N2+influenza+virus+isolated+from+a+pig+in+Indiana.">Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (6), 2453-2456 (2000).</li><li>Zhou, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+H3N2+reassortant+influenza+A+viruses+in+North+American+pigs.">Emergence of H3N2 reassortant influenza A viruses in North American pigs.</a> Vet. Microbiol. 74 (1-2), 47-58 (2000).</li><li>Corzo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Surveillance+for+Influenza+A+Virus+among+Swine,+Midwestern+United+States,+2009-2011.">Active Surveillance for Influenza A Virus among Swine, Midwestern United States, 2009-2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 19 (6), 954-960 (2013).</li><li>Lorusso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+antigenic+characterization+of+H1+influenza+viruses+from+United+States+swine+from+2008.">Genetic and antigenic characterization of H1 influenza viruses from United States swine from 2008.</a> J. Gen. Virol. 92 (Pt 4), 919-930 (2011).</li><li>Loving, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+in+pigs+of+inactivated+and+live+attenuated+influenza+virus+vaccines+against+infection+and+transmission+of+an+emerging+H3N2+similar+to+the+2011-2012+H3N2v.">Efficacy in pigs of inactivated and live attenuated influenza virus vaccines against infection and transmission of an emerging H3N2 similar to the 2011-2012 H3N2v.</a> J. Virol. 87 (17), 9895-9903 (2013).</li><li>Vincent, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+inactivated+swine+influenza+virus+vaccines+against+the+2009+A/H1N1+influenza+virus+in+pigs.">Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs.</a> Vaccine. 28 (15), 2782-2787 (2010).</li><li>Smith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+evolutionary+genomics+of+the+2009+swine-origin+H1N1+influenza+A+epidemic.">Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic.</a> Nature. 459 (7250), 1122-1125 (2009).</li><li>Vijaykrishna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassortment+of+Pandemic+H1N1/2009+Influenza+A+Virus+in+Swine.">Reassortment of Pandemic H1N1/2009 Influenza A Virus in Swine.</a> Science. 328 (5985), 1529 (2010).</li><li>Ducatez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Reassortment+between+Pandemic+(H1N1)+2009+and+Endemic+Influenza+Viruses+in+Pigs,+United+States.">Multiple Reassortment between Pandemic (H1N1) 2009 and Endemic Influenza Viruses in Pigs, United States.</a> Emerg. Infect. Dis. 17 (9), 1624-1629 (2011).</li><li>Jhung, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+variant+influenza+A(H3N2)+virus+in+the+United+States.">Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States.</a> Clin. Infect. Dis. 57 (12), 1703-1712 (2013).</li><li>Vincent, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+influenza+A+virus+isolated+from+pigs+during+an+outbreak+of+respiratory+disease+in+swine+and+people+during+a+county+fair+in+the+United+States.">Characterization of an influenza A virus isolated from pigs during an outbreak of respiratory disease in swine and people during a county fair in the United States.</a> Vet. Microbiol. 137 (1-2), 51-59 (2009).</li><li>Killian, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Infection+of+Pigs+and+People+with+Triple-Reassortant+Swine+Influenza+Virus+H1N1+at+a+U.S.+County+Fair.">Simultaneous Infection of Pigs and People with Triple-Reassortant Swine Influenza Virus H1N1 at a U.S. County Fair.</a> Zoonoses Public Health. 60 (3), 196-201 (2013).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+influenza+A+(H3N2)+variant+virus+infection+among+attendees+of+an+agricultural+fair,+Pennsylvania,+USA,+2011.">Outbreak of influenza A (H3N2) variant virus infection among attendees of an agricultural fair, Pennsylvania, USA, 2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1937-1944 (2011).</li><li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evidence+for+interspecies+transmission+of+H3N2pM/H3N2v+influenza+A+viruses+at+an+Ohio+agricultural+fair,+July+2012.">Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair, July 2012.</a> Emerg. Microbes. Infect. 1 (10), e33 (2012).</li><li>Wells, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+influenza+virus+infections.+Transmission+from+ill+pigs+to+humans+at+a+Wisconsin+agricultural+fair+and+subsequent+probable+person-to-person+transmission.">Swine influenza virus infections. Transmission from ill pigs to humans at a Wisconsin agricultural fair and subsequent probable person-to-person transmission.</a> JAMA. 265 (4), 478-481 (1991).</li><li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine-to-human+transmission+of+influenza+A(H3N2)+virus+at+agricultural+fairs,+Ohio,+USA,+2012.">Swine-to-human transmission of influenza A(H3N2) virus at agricultural fairs, Ohio, USA, 2012.</a> Emerg. Infect. Dis. 20 (9), 1472-1480 (2012).</li><li>Bowman, A. S., Nolting, J. M., Nelson, S. W., Slemons, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+influenza+virus+A+infections+in+pigs+exhibited+at+agricultural+fairs,+Ohio,+USA,+2009-2011.">Subclinical influenza virus A infections in pigs exhibited at agricultural fairs, Ohio, USA, 2009-2011.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1945-1950 (2012).</li><li>Gray, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A(H1N1)pdm09+Virus+among+Healthy+Show+Pigs,+United+States.">Influenza A(H1N1)pdm09 Virus among Healthy Show Pigs, United States.</a> Emerg. Infect. Dis. 18 (9), 1519-1521 (2012).</li><li>Van Reeth, K., Brown, I. H., Olsen, C. W., Zimmerman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+40,+Influenza+virus.">Ch. 40, Influenza virus.</a> Diseases of Swine. , 557-571 (2012).</li><li>Culhane, M. R., Detmer, S. E., Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+21,+Sample+types,+collection,+and+transport+for+influenza+A+viruses+of+swine.">Ch. 21, Sample types, collection, and transport for influenza A viruses of swine.</a> Methods in Molecular Biology. Animal Influenza Virus, 259-263 (2014).</li><li>Sheldon, C. C., Sonsthagen, T., Topel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Restraint for Veterinary Professionals. , (2006).</li><li>Detmer, S. E., Patnayak, D. P., Jiang, Y., Gramer, M. R., Goyal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Influenza+A+virus+in+porcine+oral+fluid+samples.">Detection of Influenza A virus in porcine oral fluid samples.</a> J. Vet. Diagn. Invest. 23 (2), 241-247 (2011).</li><li>Goodell, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability+of+detecting+influenza+A+virus+subtypes+H1N1+and+H3N2+in+individual+pig+nasal+swabs+and+pen-based+oral+fluid+specimens+over+time.">Probability of detecting influenza A virus subtypes H1N1 and H3N2 in individual pig nasal swabs and pen-based oral fluid specimens over time.</a> Vet. Microbiol. 166 (3-4), 3-4 (2013).</li><li>Romagosa, A., Gramer, M., Joo, H. S., Torremorell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+oral+fluids+for+detecting+influenza+A+virus+in+populations+of+vaccinated+and+non-vaccinated+pigs.">Sensitivity of oral fluids for detecting influenza A virus in populations of vaccinated and non-vaccinated pigs.</a> Influenza Other Respir. Viruses. 6 (2), 110-118 (2012).</li><li>Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+snout+wipe+samples+for+influenza+A+virus+surveillance+in+exhibition+swine+populations.">Utility of snout wipe samples for influenza A virus surveillance in exhibition swine populations.</a> Influenza Other Respir. Viruses. 8 (5), 574-579 (2014).</li><li>Zhang, J., Harmon, K. M., Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+23,+RNA+extraction+from+swine+samples+and+detection+of+influenza+A+virus+in+swine+by+real-time+RT-PCR.">Ch. 23, RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR.</a> Animal Influenza Virus. , 277-293 (2014).</li><li>Zhang, J., Gauger, P. C., Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+22,+Isolation+of+swine+influenza+virus+in+cell+cultures+and+embryonated+chicken+eggs.">Ch. 22, Isolation of swine influenza virus in cell cultures and embryonated chicken eggs.</a> Animal Influenza Virus. , 265-276 (2014).</li><li>Bowman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inability+to+Screen+Exhibition+Swine+for+Influenza+A+Virus+Using+Body+Temperature.">The Inability to Screen Exhibition Swine for Influenza A Virus Using Body Temperature.</a> Zoonoses Public Health. , (2015).</li><li>Prickett, J. R., Kim, W., Simer, R., Yoon, K. J., Zimmerman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral-fluid+samples+for+surveillance+of+commercial+growing+pigs+for+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+and+porcine+circovirus+type+2+infections.">Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections.</a> J. Swine Health Prod. 16 (2), 86-91 (2008).</li><li>Prickett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+infection+in+porcine+oral+fluid+samples:+a+longitudinal+study+under+experimental+conditions.">Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions.</a> J. Vet. Diagn. Invest. 20 (2), 156-163 (2008).</li><li>Pepin, B., Liu, F. F., Main, R., Ramirez, A., Zimmerman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+oral+fluid+from+individually+housed+sows.">Collection of oral fluid from individually housed sows.</a> J. Swine Health Prod. 23 (1), 35-37 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

איסוף דגימות מחזירים באמצעות מטליות האף-הטה פוליאסטר הוכיח שימושי בניהול מעקב IAV; עם זאת, השימוש בנוהל ספוגית האף מעכב את מאמצי מעקב עקב השימוש הנדרש של מלכודת לאיפוק. מגבוני האף מייצגים עידון של טכניקות דגימת חזירים הנוכחיות כדי למזער את הלחץ על אנשים וחזירים במהלך ?...

<html> נגיפי שפעת (IAV) גורמים למחלות בדרכי הנשימה במינים רבים, כוללים ציפורים מקומיות, חזירים, ובני אדם. בשל reassortment של האבולוציה הנגיפית המהירה הגנום IAV המפולח יכול להתרחש וזני IAV חדשים לעתים קרובות להופיע. חזירים הם מינים שיכולים לשמש ככלי לערבוב reassortment של IAVS ממיני מארח מרובים. 1 כרגע יש שלושה תת-סוגים עיקריים של IAV מחזור נפוץ בקרב חזירים בצפון אמריקה (H1N1, H1N2, H3N2), אבל יש לי היכרויות IAV מרובות מבני האדם הוביל לגיוון IAV הנרחב בתוך תת אלה. 2 אבולוציה מהירה של IAVS הדבקת חזירים הייתה ברורה מאז 1998 כאשר reassortant משולש IAV המכיל קטעי גן מוירוסים אנושיים, עופות וחזירים 3 הפכו נפוצים בקרב חזירים בארצות הברית. 4 הגן הפנימי קטעים שמIAV reassortant המשולש יישארו נפוצים מאוד בקרב IAVS הדבקת חזירים כיום. 5 &quot;&gt; ברחבי העולם, IAV הוא גורם משמעותי למחלות בדרכי הנשימה בחזירים שבסימנים קליניים אופייניים כוללים חום, אנורקסיה, עייפות, שיעול, נשימה מאומצת, התעטשות, נזלת ועלייה במשקל ירוד. IAV יכול להיות יקר במיוחד לזרוע חוות שבי רבייה כישלון בשל חום וחזירונים נולדו חלשים-induced IAV תועד. 6,7 בתוך ארצות הברית, IAV מזוהה בדרך כלל בעדרי חזירים מסחריים ומגוון הנרחב אנטיגני וגנומי ופיתוח המתמשך בין החזירים הדבקת IAV עכב שליטה של זה וירוס. 8-11 חששות לבריאות ציבור על הופעתה של מתח IAV מגיפה כתוצאה מreassortment בחזירים מומשו בשנת 2009 כאשר IAV חזירים שושלת מכיל קטעים מגן השושלת המשולשת reassortant צפון אמריקה חזירים ושושלת חזירים כמו עופות האירו גרם למגפה בעולם בבני אדם. 12 (pdm09 A (H1N1)) הנגיף מאזreassorted עם חזירים אנדמיים IAV זני 13,14 וחלק מהזנים חדש reassorted אלה הועבר בחזרה לבני אדם. 15 התדירות של אירועים והופעתה של זנים חדשים IAV עם פוטנציאל מגיפה עושה מעקב פעיל של מחזורי וירוסי IAV בחזירים הכרחיים reassortment, במיוחד בממשק החזירים-אדם. ממשק החזירים-אדם הוא חשוב להעברת interspecies דו-כיוונית של IAV. אדם לחזירי שידור מתרחש בייצור חזירים מסחרי אחראי לכמות גדולה של גיוון IAV כיום קיים באוכלוסיית החזירים. ירידים חקלאיים הם ההגדרות הגדולות ביותר לcomingling של אנשים וחזירים בארצות הברית וידועים באתרים להעברת zoonotic של IAV. 15-21 בשנת 2012, במהלך פרוץ גרסת H3N2 IAV, 93% מהמקרים מדווחים נוכחות ב הוגן חקלאית בימים שקדם לתחילתה של מחלה. 15 ניתוח הגנוםשל בידודים נגיפיים מחזירי תערוכה לעומת מבודדים אנושי אישר העברת zoonotic. חזירים 21 תערוכה נגוע בIAV לעתים קרובות לא מראה סימנים קליניים של מחלה, 21-23 המציינים את הצורך בבדיקות אבחון ישירים. דגימה של חזירים חולים בעליל לבד לא לזהות בהצלחה שכיחות IAV בחזירים ולא ניתן לסמוך על לזהות זנים חדשים של IAV מתעוררים בקרב חזירים. מעקב פעיל הוא הכרחי לצורך זיהוי של זנים המתעוררים מIAV בחזירים ולהעריך האיום שלהם עבור שני חזירים ובריאות הציבור. רוב פעילויות מעקב IAV הן מרצון ולכן יש צורך בשיטות זעיר-מפריעות. שלושה הליכי גביית מדגם גדולים אנטה-מורטם לIAV הדבקת חזירים הם: מטליות האף, נוזלים דרך הפה, ומגבוני האף. המלצות נוכחיים לדגימת חזירים בודדים כדי לזהות רשימת IAV החדרת סינטטי הסיבים הטו מטליות לנחיריים כשיטת המועדפתלאסוף הפרשות מהאף ותאי האפיתל. 24,25 בגלל חזירים עלולים לנסות להימנע מהליך זה, צוות של אנשים מיומנים חייבים לרסן את החזירים באופן ידני או עם מלכודת תלוי בגודל של החיה. 26 תהליך האיפוק הוא מייגע ל כוח אדם, ומלחיץ עבור החזירים. בנוסף, חזירים תערוכה לעתים קרובות מעורבים בתחרויות מרובות ביריד כך התפיסה של מתח הוסיף על בעלי חיים תחרות יכולה לעשות בעלים עמידים למאמצי המעקב. בהסתברויות של זיהוי IAV החל 80-100% בIAV עדרים נגועים, נוזלים אוראליים הפכו חלופה פופולרית לאף מטליות לזיהוי המולקולרי של IAV באוכלוסיות של חזירים. 27,28 בנוסף, נוזלים דרך הפה עשוי לספק חלון רחב יותר של זיהוי IAV מ מטליות האף בעקבות זיהום ראשוני. עם זאת, בידוד IAV מנוזלים דרך הפה היה בעייתי עם רק 50% מניסיונות בידוד נגיף וכתוצאה מכך IAV התאוששות. 29 שימוש במגבוני האף במקום מטליות האף במהלך מעקב IAV בחזירים מתגבר על המגבלות שתוארו לעיל. מגבוני האף אינו דורשים שימוש במלכודת הרחקה וניתן לבצעו ללא הדגיש בעלי החיים או עדים של ההליך. יש צורך בהכשרה טכנית מינימאלית כדי לאסוף מגבוני האף, המאפשר אנשי מקצוע שאינה וטרינרית, לרבות בעלי חזירים, כדי לאסוף את דגימות המעקב. מגבוני האף הושוו בעבר למטליות האף לזיהוי והבידוד של וירוס שפעת 30 והפרוטוקול מפורט לשיטה לא פולשנית של דגימה מתואר להלן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BBL Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:360px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">211059</td>
			<td style="width:356px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin G Sodium Salt</td>
			<td style="width:360px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:119px;">021194537</td>
			<td>1500 u/mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin Sulfate</td>
			<td style="width:360px;">AMRESCO LLC</td>
			<td style="width:119px;">0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Solution</td>
			<td style="width:360px;">Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td>50 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B Solution</td>
			<td style="width:360px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S 24 25</td>
			<td>250 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td style="width:360px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">K2105</td>
			<td>5000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TPP Rapid Filtermax System</td>
			<td style="width:360px;">TPP Techno Plastic Products AG&#160;</td>
			<td style="width:119px;">99150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nalgen Diagnostic Bottles</td>
			<td style="width:360px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">342002-9025</td>
			<td>HDPE with white PP closure</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Dermacea Gauze Sponge, 8 ply</td>
			<td style="width:360px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441211</td>
			<td>5.08 cm &#215; 5.08 cm (2 in. &#215; 2 in)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nitrile Exam Gloves</td>
			<td style="width:360px;">Saftey Choice</td>
			<td style="width:119px;">19-170-010 (A-D)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal wipes for influenza a virus detection and isolation from swine

מעקב לנגיפי שפעת בחזירים הוא קריטי לבריאות אדם ובעלי החיים, כי שפעת וירוס במהירות מתפתח באוכלוסיות חזירים וזנים חדשים צצים ללא הרף. חזירים יכולים להיות נגוע על ידי שושלות שונות של נגיף שפעת שהופכים אותם מארחים חשובים להופעה והתחזוקה של שפעת רומן זני וירוס. דגימת חזירים בהגדרות מגוונות כגון חוות מסחריות חזירים, ירידים חקלאיים, ושווקי החי חשוב לספק תמונה מקיפה של מחזור כיום זני IAV. הטכניקה הנוכחית הזהב סטנדרטי אנטה-מורטם הדגימה (כלומר אוסף של מטליות האף) היא עבודה אינטנסיבית מכיוון שהיא דורשת איפוק פיזי של החזירים. מגבוני האף כרוכים משפשפים את פיסת הבד על פני החוטם של החזיר עם מינימאלי ללא ריסון של בעלי החיים. האף לנגב הליך הוא פשוט לביצוע ואינו דורש כוח אדם עם וטרינרים מקצועיים או הכשרת טיפול בבעלי חיים. While מעט פחות רגיש ממטליות האף, שיעורי זיהוי וירוסים ובידוד מספיקים כדי להפוך את האף מגבוני חלופה לדגימת חזירים בודדים כאשר שיטות דגימה נמוך מתח נדרשות. פרוטוקול ההליך מתאר את הצעדים הדרושים כדי לאסוף האף קיימא למחוק מחזיר בודד.

שימוש מוצלח בשיטה זו מניבה RRT-PCR תוצאות ש, מלווה בשימוש בבקרה פנימית במהלך הפקת RNA וRRT-PCR, דגימות תכנית לא הכילו מעכבי PCR מכל פסולת סביבתית הרימה במהלך דגימה. לאחר חיסון מדגם, בארות בידוד וירוס צריכה להיות חופשיות של פסולת סביבתית גלויה מהמדגם. יש הסכמה סבירה בין תוצאות RRT...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine at JoVE.com

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

nasal-wipes-for-influenza-a-virus-detection-and-isolation-from-swine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  The Ohio State University. The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses. 

Video: Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...