Dieses Protokoll quantifiziert Lungenmetastasen, eine aggressive und häufige Ursache für brustkrebsbedingte Todesfälle, mit erhöhter Präzision und Effizienz in einem präklinischen Brustkrebsmodell. Im Vergleich zur ursprünglichen Technik liefert dieses Protokoll Forschern schnellere, konsistentere Ergebnisse. Es lindert menschliche Zählfehler durch einfach zu bedienende Computertechnologie.
Diese Technik kann absolut auf die präklinische Forschung ausgedehnt werden, die die Auswirkungen von Brustkrebstherapien auf Lungenmetastasen untersucht, indem sie es Forschern ermöglicht, eine verringerte metastasierende Belastung nach erfolgreicher Behandlung nachzuweisen. Beginnen Sie mit der Kennzeichnung eines 15 Milliliter konischen Rohrs für die Gewebeprobe. Dann fügen Sie 2,5 Milliliter Typ vier Kollagenase-Mischung und 30 Einheiten Elastase in das Rohr.
Bewegen Sie die Lunge auf einen sauberen 1X HBSS gut und wirbeln Sie sie mit Zangen, um das verbleibende Blut zu entfernen, und übertragen Sie sie dann auf eine leere 3,5-Zentimeter-Gewebekulturplatte. Die Lunge mit einer Schere zerkleinern, dann den Teller mit 2,5 MilliliterHBSS abspülen und die HBSS mit den Lungenstücken in ein präpariertes 15-Milliliter-Konusrohr mit Kollagenase und Elastase-Cocktail übertragen. Inkubieren Sie das Rohr für 75 Minuten bei vier Grad Celsius auf einer Wippe oder einem rotierenden Rad.
In der Zwischenzeit beschriften Sie ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr und eine 10 Zentimeter Gewebekulturplatte für jede Maus. Wenn Sie eine Verdünnung tun, beschriften Sie genügend Gewebekulturplatten für die Verdünnungen. Bringen Sie das Volumen der Röhre auf 10 Milliliter mit 1X HBSS, dann gießen Sie den Inhalt über ein 70 Mikrometer Zellsieb in die 50 Milliliter konische Röhre.
Verwenden Sie den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um die Probe vorsichtig durch das Sieb zu schleifen. Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Minuten bei 350 mal G und entsorgen Sie den Überstand, dann waschen Sie das Pellet zweimal mit 10 Milliliter 1X HBSS. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter 60 Mikromolar 6-Thioguanin komplette Kulturmedien, und platten Sie die Proben in den 10 Zentimeter Zellkulturplatten mit einem Verdünnungsschema, wenn gewünscht.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage. Gießen Sie Kulturmedien von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie fünf Milliliter unverdünntes Methanol zu jeder Platte hinzu und brüten für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass das Methanol so gewirbelt wird, dass es die gesamte Platte bedeckt.
Das Methanol von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter gießen und dann jede Platte mit fünf Millilitern destilliertem Wasser abspülen. Fügen Sie fünf Milliliter 0,03% Methylenblau pro Platte hinzu und inkubieren Sie es für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass die Methylenblaue Lösung so gewirbelt wird, dass sie die gesamte Platte bedeckt. Gießen Sie das Methylenblau in den entsprechenden Abfallbehälter und spülen Sie jede Platte mit fünf Millilitern destilliertem Wasser wieder aus.
Drehen Sie die Platte auf den Kopf und bdeaktivieren Sie sie gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Platte auf den Deckel und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Metastasierende Kolonien werden blau sein.
Sobald die Platten getrocknet sind, können sie bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit gelagert werden. Entfernen Sie die beschrifteten Deckel von den Platten, wobei Sie darauf achten, dass die Proben eindeutig identifiziert werden. Richten Sie alle gefärbten Lungenplatten auf einer sauberen, hellen Oberfläche aus.
Machen Sie ein Bild von der Sammlung von Platten in einem gut beleuchteten Bereich, um Reflexionen zu minimieren. Reflexionen in den Platten beeinflussen die Bildanalyse und sollten vermieden werden. Achten Sie genau auf die aufgenommenen Fotos und nehmen Sie mehrere Bilder aus verschiedenen Blickwinkeln auf.
Nachdem Sie die Platten fotografiert haben, schneiden Sie das Bild zu, um die Deckel oder irgendetwas im Hintergrund auszuschließen. Öffnen Sie das Bild in Fidschi ImageJ, und ändern Sie es in Schwarzweiß, indem Sie auf Bild, Anpassen und Farbschwelle klicken. Wählen Sie dann Die Standardeinstellung für die Schwellenwertmethode, Schwarzweiß für die Schwellenwertfarbe und das Labor für den Farbraum aus.
Stellen Sie sicher, dass das dunkle Hintergrundfeld nicht ausgewählt ist. Das Bild sollte nun schwarz und weiß sein. Schwarz stellt den hellen Hintergrund dar, und Weiß stellt die blauen metastasierenden Kolonien dar.
Verwenden Sie das Kreiswerkzeug, um den zu analysierenden Bereich auszuwählen. Zeichnen Sie einen Kreis, der für alle Platten verwendet werden soll, um sicherzustellen, dass jede Platte für die gleiche Größe analysiert wird. Wählen Sie eine Größe aus, die den analysierten Bereich auf den Platten maximiert und gleichzeitig das Hintergrundrauschen minimiert, das am Rand der Platten angezeigt wird.
Die Größe wird in der Symbolleiste angezeigt, während sie gezeichnet wird. Analysieren Sie den ausgewählten Kreis, um den Prozentsatz der weißen Fläche zu bestimmen. Klicken Sie auf Analysieren und Analysieren von Partikeln, und wählen Sie dann Null bis Unendlichkeit für die Größe, null bis eins für die Zirkularität und nichts für die Anzeige.
Aktivieren Sie das zusammengefasste Kästchen und klicken Sie auf okay. Verschieben Sie den Kreis zur nächsten Platte im Bild, indem Sie ihn in der Mitte greifen und die Analyse wiederholen. Kopieren Sie das Ergebnis, und fügen Sie es in eine Kalkulationstabelle ein.
Der Prozentbereich, d. h. der Prozentsatz der ausgewählten Fläche, die weiß ist, stellt die metastasierende Belastung dar. Sobald alle Platten und Bilder analysiert wurden, durchschnittlich e0einer eisern die prozentualen Ergebnisse zwischen den verschiedenen Bildern für jede Platte, um Inkonsistenzen zwischen den Bildern zu verringern. Die Fidschi ImageJ-Analyse wurde mit manueller Zählung und histopathologischer Analyse verglichen.
Wenn drei separate Forscher metastasierende Kolonien manuell zählten, waren die Ergebnisse zwischen den Zählern inkonsistent. Die Ergebnisse von Fiji ImageJ waren konsistent zwischen den Zählern für jedes der drei Bilder. Die Ergebnisse der drei Bilder und der drei Zähler wurden für jede Lungenplatte kombiniert.
Die Ergebnisse wurden für jede Platte gemittelt, um die Variationen zwischen den Bildern zu berücksichtigen, die konsistente Ergebnisse zwischen den Zählern lieferten. Bei der Rangfolge der Platten von den meisten bis zu den am wenigsten metastasierenden, manuelle Zählung auf der konfluentsten Platte vereinbart, aber alle folgenden Ränge waren inkonsistent. Die Ränge aus den durchschnittlichen Fidschi ImageJ Ergebnissen waren viel konsistenter zwischen den Zählern.
Um zu demonstrieren, wie wichtig es ist, Reflexionen in den Bildern zu vermeiden, wird ein Bild mit der Reflexion einer Hand und der anschließenden Fidschi ImageJ-Analyse zusammen mit einem Bild derselben Platte ohne Reflexion gezeigt. Dunkle Flecken von einer schmutzigen Hintergrundoberfläche oder ein Blutprobenrückstand auf den Platten können sich auch negativ auf die Fidschi ImageJ-Analyse auswirken. Diese Blutplatte hat nur zwei metastasierende Kolonien, aber die dunklen Rückstände veranlassten Fidschi ImageJ, es als 31,6% metastasiert zu betrachten.
Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, Bilder sorgfältig auf Reflexion zu untersuchen, verwenden Sie den gleichen Größenkreis für jede Platte im Bild, und durchschnittlich die Ergebnisse für jede Platte zwischen mindestens drei separaten Bildern.
