Name: optogenetic functional mri
Uploaded: 2016-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
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This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director's New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.

Ethik-Statement: Experimentelle Verfahren hier wurden von der Stanford University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt. 1. Vorbereiten Patchkabel und Zwinge Implantate Hinweis: Obwohl Patchkabel und Zwinge Implantate im Handel erhältlich sind, produzieren diese in-house Spezialität Designs ermöglicht und weniger kosten. <ol><li> einen Faserverbindungskabel zum Zuführen von Licht von dem Laser auf das Implantat im Gehirn, spalten zuerst die optische Faser auf die gewünschte Länge herzustellen. <ol><li> Unter Verwendung eines Faser-Spalter, beenden die optische Faser ein flaches Ende am Anschlusspunkt zu erzeugen. Wenn die Faser mit einem Mantel überzogen ist, abzustreifen die Jacke vorher mit einem faser Abisolierwerkzeug aus. </li><li> Abzuspalten das andere Ende der optischen Faser um die gewünschte Länge für das Kabel zu erzeugen, so dass das Kabel von der Lichtquelle an das Tier innerhalb der Bohrung zu erstrecken lang genug ist,der Scanner. </li></ol></li><li> Mischen, um eine kleine Menge an Epoxy-Klebstoff in einer 1: 1-Verhältnis auf ein Stück Aluminiumfolie kurz vor dem nächsten Schritt, wie die Epoxy-Kleber für die Verwendung nach dem Mischen 5 min zu viskos wird. </li><li> Mit einem kleinen Holzstäbchen vorsichtig Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser gelten, die innerhalb der konkaven Seite der Keramikring platziert werden und gelten dann einen kleinen Tropfen auf die Oberfläche der flachen Seite des Ringes. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellen, daß eine kleine Länge der Faser (&lt;0,5 mm) von der Flachseite der Keramikhülse vorsteht. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten. </li><li> Auf der Seite des LWL-Patchkabel, das mit der Laserlichtquelle verbinden wird, sanft Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser, die in der konkaven Seite der Zwinge des FC / PC-Anschluss platziert wird und dann geben Sie eine kleine Anwendung fallen auf die Oberfläche der flachen Seite der Ferrule. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellendaß eine kleine Länge der Faser (&lt;0,5 mm) ragt von der flachen Seite des Ringes. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten. </li><li> Polieren Sie das flache Ende der Ferrulen für beide Seiten des Kabels mit einer Polierscheibe mit von Pinzette mit sanften Druck auf die Hülse aufzubringen, während machen Figur-8 Drehungen auf Aluminiumoxid Läppen Blätter (von 3 &amp; mgr; m bis 1 &amp; mgr; m bis 0,3 &amp; mgr; m Körnung ). </li><li> Untersuchen Sie das flache Ende der Hülse mit einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des flachen Ende, einschließlich der LWL-Oberfläche selbst, frei von jeglicher Epoxid-Kleber ist; weiter Polieren wenn Epoxid-Kleber auf der Oberfläche bleibt. Stellen Sie sicher, dass die faseroptische Oberfläche nicht gebrochen oder gesäumt wurde. ACHTUNG: Stellen Sie sicher, Personal geeignete Klassen Training Lasersicherheit und Laserschutzbrille tragen, bevor Laser-Geräte Handhabung. </li><li> Schließen Sie das LWL-Patchkabel mit dem Laserlichtquelle durch den FC / PC-Anschluss und richten Sie die fiber Spitze auf den Brennpunkt des Kopplers. Messen Sie die Lichtübertragungsleistung der Faser mit einem Leistungsmesser, um eine angemessene Lichtleistung zu gewährleisten. Hinweis: Die folgenden Schritte zur Herstellung von Keramikringen mit Faseroptik für chronische Implantation in das Gehirn sind; Keramikringe sind hohl in der Mitte und tragen Glasfaser Licht, das von einem Patch-Kabel zu einer Region von Interesse (ROI) innerhalb des Gehirns zu liefern. </li><li> Unter Verwendung eines Faser-Spalter, beenden die optische Faser ein flaches Ende am Anschlusspunkt zu erzeugen. Wenn die Faser mit einem Mantel überzogen ist, abzustreifen die Jacke vorher mit einem faser Abisolierwerkzeug aus. </li><li> Abzuspalten das andere Ende der optischen Faser um die gewünschte Länge zur Implantation in das Gehirn zu erzeugen. Bestimmen die Länge der Faser einen stereotaktischen Atlas unter Verwendung der ROI innerhalb des Gehirns zu zielen. <ol><li> Zum Beispiel: dorsalen Hippocampus in rat Ziel, die 3,5 mm unterhalb Bregma ist, sicherzustellen, dass die Länge der Faser vom ferrul abstehendene beträgt 3,5 mm + 0,25 mm, einem Anteil von Schädeldicke und damit für Fehlermarge. Prüfen Sie daher, dass die endgültige Länge der Faser 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (Länge der Zwinge) = 14,25 mm. </li></ol></li><li> Mischen, um eine kleine Menge an Epoxy-Klebstoff in einer 1: 1-Verhältnis auf ein Stück Aluminiumfolie kurz vor dem nächsten Schritt (den Epoxykleber zu viskos zur Verwendung 5 min nach dem Mischen). </li><li> Mit einem kleinen Holzstäbchen vorsichtig Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser gelten, die innerhalb der konkaven Seite der Keramikring platziert werden und gelten dann einen kleinen Tropfen auf die Oberfläche der flachen Seite des Ringes. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellen, daß eine kleine Länge der Faser (&lt;0,5 mm) von der Flachseite der Keramikhülse vorsteht. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten. </li><li> Polieren Sie das flache Ende der Zwinge eine Polierscheibe mit von Pinzette mit sanften Druck auf die Hülse aufzubringen, während machen Figur-8-Rotations auf Aluminiumoxid Läppen Blätter (3 &amp; mgr; m bis 1 &amp; mgr; m bis 0,3 &amp; mgr; m grit). </li><li> Untersuchen Sie das flache Ende der Hülse mit einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des flachen Ende, einschließlich der LWL-Oberfläche selbst, frei von jeglicher Epoxid-Kleber ist; weiter Polieren wenn Epoxid-Kleber auf der Oberfläche bleibt. Stellen Sie sicher, dass die faseroptische Oberfläche nicht gebrochen oder gesäumt wurde. </li><li> Paar die polierte Zwinge mit einem Glasfaser-Patchkabel mit einer Zwinge Hülse und schließen Sie das Patchkabel an einer Laserlichtquelle. Messen Sie die Lichtübertragungsleistung an der Spitze der Faser mit einem Leistungsmesser, um eine angemessene Effizienz gewährleisten. </li><li> Ein Protokoll der Leistungsabgabe von der Zwinge Patch erforderlichen Kabel für jede Ferrule Implantat zur Ausgabe der gewünschte Leistungspegel an der Spitze der Faseroptik (2,5 mW in diesem Protokoll). Verwerfen Ferrulen mit einer Dämpfungsrate von über 50% und mit nicht kreisförmigen Ausgabemuster. </li></ol> 2. Stereotaktische Implantation Chirurgie und Virus Injection <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Verfahren die Verwendung von Tieren beinhalten, die von der lokalen IACUC zugelassen sind. Pflegen aseptischen Bedingungen während Überleben Operationen durch aseptische Verfahren folgen, einschließlich der Verwendung von sterilen Handschuhen, sterile Masken, sterile OP-Abdeckungen und sterilisierten chirurgischen Instrumenten. VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Chirurgen Persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Schutzbrille tragen vor Beginn des Verfahrens. Befolgen Sie die Anweisungen Standard Biosicherheit, wenn sie mit Adeno-assoziierter Vektor (AAV) arbeitet, kümmert sich um Spritzer zu vermeiden. Entsorgen Sie AAV Abfall in einem Behälter für biologischen. </li><li> Legen Sie eine Mikroliterspritze mit genügend AAV zur Injektion in das Tier plus extra zu berücksichtigen mögliche Volumenverluste (insgesamt 4 ul pro Tier), halten Sie die Spritze auf dem Eis vor dem Gebrauch. In diesem Protokoll AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP bei einem Titer von 4x10 12 vg / ml verwendet. Legen Sie das Tier unter Isoflurane Anästhesie mit einer Induktionskammer, verbunden mit einer Genauigkeit Isofluran Verdampfer Satz mit einem 3 - 4% mit einem Sauerstoffgasquelle. </li><li> Rasur den Kopf mit einem elektrischen Rasierer und führen Sie eine dreifache chirurgische Peeling auf der Haut mit Betadin und 70% Ethanol spülen. </li><li> Sobald das Tier in tiefer Narkose (prüfen Zehenreflex und Atemfrequenz) ist, zu immobilisieren den Schädel des Tieres in einem stereotaktischen Apparat mit intra-aural Positionierung Nieten und Zahnstange. Hinweis: Die gesamte Prozedur 1 nehmen - 2 Stunden, von Narkoseeinleitung zur Genesung. </li><li> Stellen Sie die Anästhesie auf ein angemessenes Niveau (1 - 3% Isofluran auf dem Verdampfer) und kontinuierlich zu überwachen die Vitalfunktionen des Tieres, die Anpassung der Anästhesie als notwendig, eine Atemfrequenz von ~ 40 Atemzüge / min zu halten. Verabreichen Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während sie unter Anästhesie. </li><li> Machen Sie einen 15 bis 20 mm Mittellinie Kopfhaut Schnitt mit einem Skalpell und einfahren, die Kopfhaut mit chirurgischen hemostats einmit dem Periost ttached. Referenz Lambda und Bregma die Bohrkrone über die Koordinaten für den ROI zu positionieren. </li><li> Bohren Sie ein kleines Kraniotomie (2 - 3 mm) über den ROI mit einem Zahnbohrer, kümmert sich nicht um das Gehirn zu durchstechen. Langsam Nadel auf die Mikroliterspritze durch die Kraniotomie an den ROI im Gehirn angebracht einfügen. </li><li> Mit einer Mikropumpensteuerung, injizieren 2 ul der Vektor-Lösung in den ROI. Verwenden, um eine Durchflussrate von 150 nl / min Gewebeschäden zu vermeiden. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, wartet 10 min, bevor die Spritze langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm / min zu entfernen. </li><li> Nach der Injektion trocken die Oberfläche des Schädels. Referenz lambda Bregma und Koordinaten zu bestätigen und dann die Ferrule Implantates an das Zieltiefe einsetzen (zum Beispiel: 3,5 mm unter Bregma für dorsalen Hippocampus) mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 mm / min. Montieren Sie die Zwinge Implantat auf den Schädel mit Zahnzement. Nachdem der Zahnzement verfestigt hat, dichten den Einschnitt mit Nähten (size 5-0 für Ratten) um den Zahnzement Kappe. </li><li> Nach der Operation, legen Sie das Tier in seinem Käfig einzeln mit der Hälfte des Käfigs auf einer Heizung für Anästhesie Erholung untergebracht. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Stellen Sie das Tier nicht in der Gesellschaft anderer Tiere, bis sie vollständig erholt hat. </li><li> Für postoperative Behandlung von Schmerzen, verabreichen Buprenorphin subkutan alle 12 Stunden bei einer Dosis von 0,05 mg / kg für 24 Stunden. Verabreichen Antibiotika-Pulver täglich über der Einschnittstelle für 3 Tage. </li><li> Entfernen der Nähte etwa zwei Wochen nach der Operation Schorfbildung zu verhindern. </li><li> Warten Sie 4 - 6 Wochen nach der Virusinjektion für eine ausreichende Expression von optogenetische Gene vor Durchführung von Experimenten. </li></ol> 3. optogenetische Functional MRI ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, um das permanente Magnetfeld eines Magnetresonanztomographen. Sichere equipmhno, einschließlich der Funktion, Lichtquelle, Ventilator, capnograph und Gastanks, ausreichend weit weg (zumindest jenseits der 5 Gauss Grenze) Generator. <ol><li> Legen Sie das Tier unter Gasnarkose mit einer Induktionskammer, verbunden mit einer Genauigkeit Isofluran Verdampfer Satz bei 5% mit einem Sauerstoffgasquelle. </li><li> Sobald das Tier in tiefer Narkose (Kontroll toe reflex und Atemfrequenz) ist, intubieren das Tier nach dem Protokoll in Rivard detailliert et al. (2006) die Überwachung der Kohlendioxid 26 durch Kapnografie zu ermöglichen. Hinweis: Intubation ist von entscheidender Bedeutung in der richtigen Ebenen der exspiratorische CO 2 während der Bildgebung zu halten. </li><li> Sichern Sie das Tier in den Scanner Wiege. Hinweis: In diesem Protokoll wurde die Wiege benutzerdefinierte produziert, aber solche Wiegen sind auch im Handel erhältlich. Die Ratte Wiege Funktionen das Tier innerhalb des Scanners für die Lieferung der Anästhesie zu sichern, erwärmte Luft und zur Einschränkung der Bewegung. </li><li> Liefern Sie eine Mischung aus Isofluran (Ranging 1,2 bis 1,5%) in etwa 60% Stickstoffoxid und 40% Sauerstoff über einen Schlauch durch die Docking-Station. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres sicher, um Bewegungsartefakte zu vermeiden, festgelegt ist. </li><li> Geben Sie erwärmte Luft durch den Schlauch in die Docking-Station und fügen Sie ein Rektalthermometers mit Schmierstoff Körpertemperatur zu überwachen. Verabreichen Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während sie unter Anästhesie. </li><li> Schließen Sie das LWL-Patchkabel an einer Laserlichtquelle und messen Sie den Ausgang an der Spitze der Zwinge des Patchkabel mit einem Leistungsmesser. </li><li> Einzustellen, um den entsprechenden Leistungspegel (bestimmt zuvor in Schritt 1.15) die gewünschte Ausgangs (2,5 mW in diesem Protokoll) an der Spitze der Faseroptik innerhalb des Gehirns implantiert zu erzeugen. Da übermäßige Leistung aus dem faseroptischen potentiell Gewebeschäden im Gehirn verursachen kann oder Gewebeerwärmung verursachen, die Signal-Artefakte erzeugen wird, nicht wesentlich erhöht die Leistung des Lasersüber die vorgesehene Ausgabe. </li><li> Verhindern Lichtleckage von dem Implantat mit einem Konus von schwarzem Isolierband und decken die Augen des Tieres. Paar das Glasfaserkabel an die Zwinge Implantat auf das Tier mit einer Ferrule Hülse. </li><li> Setzen Sie die Spule über den Kopf des Tieres. Legen Sie die Wiege mit Tier in die Bohrung des Scanners. Hinweis: In diesem Protokoll wird die Single-Loop-Sende-Empfangsspule wurde speziell hergestellt und vorge abgestimmt, um die optimale Funkfrequenz von Hirngewebe zu erhalten. </li><li> Überwachen Sie die Atemfrequenz und Körpertemperatur während des gesamten Prozesses, die Anpassung der Beatmungsgerät und Heizung nach Bedarf auf physiologische Werte in Grenzen halten (sicherzustellen , dass exspiratorische CO 2 ist 3 bis 4% durch Drehen der Knöpfe auf dem Beatmungsgerät Hubfrequenz und Lautstärke einzustellen , und dass Temperatur ist 37 ° C durch die Pfeile für die Temperatureinstellung klicken). </li><li> Wählen Sie eine Positionierung Sequenz Bild der Tierkopfposition. Wenn die bregen ist an der Iso-Zentrum nicht, das Tier Kopfposition einstellen und die Positionierung Scan wiederholen, bis das Gehirn an der Iso-Zentrum ist. Wählen Sie eine lineare Shim-Sequenz und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Inhomogenitäten des Magnetfeldes zu reduzieren beginnen. Hinweis: Unterlegbleche ein wichtiger Schritt ist, die direkt um die Integrität der fMRI-Daten beeinflussen. </li><li> Wählen Sie einen T2-gewichteten Sequenz und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Start T2-gewichteten hochauflösende koronalen anatomische Bilder vor dem fMRI zu erwerben auf die allgemeine Integrität des Gehirns zu überprüfen und die Lage der optischen Faser Implantat zu bestätigen. Hinweis: Diese Bilder können als Anatomie-Overlays für die ofMRI Scan-Serie verwendet werden. </li><li> Verbinden BNC-Kabel von der Auslöseöffnung des MRI-Scanner an den Funktionsgenerator, so dass die Laserlichtquelle entsprechend einer experimentellen Stimulation Paradigma angetrieben wird. Hinweis: In diesem Protokoll wird die Stimulation pAradigm 30 sec von Baseline um 20 Sekunden, gefolgt auf / 40 sec für sechs Minuten ab. </li><li> Wählen Sie ein Multi-Slice-Gradienten-Echo (GRE) Sequenz aufgerufen und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Start 35 mm x 35 mm (2D FOV) in der gleichen Ebene mit 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm räumliche Auflösung koronalen Scheiben zu erwerben. Hinweis: Die hier verwendete GRE-Sequenz hat eine Wiederholungszeit (TR) und Echozeit (TE) von TR / TE = 750/12 ms und 30 ° Kippwinkel. </li><li> Am Ende des Scans, entfernen Sie das Tier aus dem Scanner und zu überwachen, bis er aus der Narkose erwacht und kann Brustlage halten. </li></ol> 4. ofMRI Datenanalyse Hinweis: Die folgenden Schritte durchgeführt werden in MATLAB als in einer Publikation auf hohem Durchsatz ofMRI 27 beschrieben. <ol><li> Nachdem der rohen Abtastdaten an den Computer für die Analyse verwendet übertragen wurde, verwenden Gleitfenster Rekonstruktion des Bildes jedes TR zu aktualisieren, mitein Vier-Verschachtelungs-Spiral-Anzeige, 750 ms TR und 12 ms Echozeit 23 Scheiben pro Scan Serie zu erwerben. Statt herkömmlicher Rekonstruktion , wo neue fMRI Bilder nur rekonstruiert werden , nachdem alle Verschachtelungen für jede Scheibe erworben werden, rekonstruiert das Schiebefenster Rekonstruktionsverfahren Bilder nach dem Erwerb von jeweils interleaf 27. </li><li> Verarbeiten Sie die Rohdaten für die zweidimensionale Rasterung Rekonstruktion, Bewegungskorrektur und die Berechnung der Zeitreihe als zuvor 27 beschrieben. </li><li> Verwenden eines Schwellenkohärenzmethode aktiviert Voxel bestimmen , indem die prozentuale Modulation des BOLD Signal jedes Voxel relativ zu der Basisperiode gesammelt vor der Stimulation der Berechnung wie zuvor beschrieben 27. Berechnen Kohärenzwerte als die Größe der Fourier bei der Frequenz der wiederholten Stimulationszyklen durch die Summe der Quadrate aller Frequenzkomponenten 8 geteilt wandeln. </li><li> Unter Verwendung der Zeitreihendaten für jedes vOxel, mittlere Bewegungskorrigierten Bilder, die gehören zu aufeinanderfolgenden Abtastungen des gleichen Stimulations Paradigma zuerst. Dann auszurichten , um die durchschnittlichen 4D - Bilder zu einem gemeinsamen Koordinatenrahmen mit einem Sechs - Grad-of-freedom Starrkörpertransformation sowie isotropen Skalierung zum Vergleich innerhalb und zwischen den Tieren , wie zuvor beschrieben 27. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Bewegung des Motivs während der Bildgebung ist eine bedeutende Quelle von Artefakt, das zu Datenkorruption führen kann. Passender Befestigen des Tieres auf der Abbildungsaufnahmevorrichtung können solche Artefakte zu minimieren, wie entsprechende Anästhesiepegel beibehalten wird. Hier verwendeten wir Isofluran aber alternative Anästhetika, wie Medetomidin oder Ketamin und Xylazin, sollten ebenfalls berücksichtigt werden. Jedoch können die Stufen und die Wahl des Anästhetikums viele Parameter beeinflussen im Gehirn, einschließlich der BOLD - Antwort 28. Isofluran kann Veränderungen bewirken in der neuronalen Erregbarkeit 29. Andere Anästhetika können auch synaptische Inhibition 30 beeinflussen GABA. Somit ist die Wahl der Anästhesie wichtig bei der Durchführung ofMRI seine Fähigkeit gegeben neuronaler Aktivität beeinflussen. ofMRI in Abwesenheit von Anästhesie ist möglich, aber mit erhöhter Bewegung von dem Tier eine Herausforderung sein, die reduziert werden kann, wenn das Tier habituierten; so wach ofMRI Studien bisher durchgeführt haben einend würde die verwirrende Wirkung der Narkose auf das Gehirn 9,10 vermeiden. Nachbearbeitungsbewegungskorrekturalgorithmen kann stark verwendet werden, um die Auswirkungen der Bewegung zu mildern. Einige dieser Methoden existieren, einschließlich der inversen Gauss-Newton-Algorithmus in diesem Protokoll verwendet, der die Summe der Quadrate Kostenfunktion des Referenzbildes und der Bildkorrektur unter minimiert. Der Algorithmus ist nützlich , weil es schnelle und robuste Bewegungskorrektur ermöglicht, eine GPU parallele Plattform - Design unter Verwendung von Verarbeitungszeiten 27 zu reduzieren. Für die Datenrekonstruktion in diesem Protokoll eigens geschriebenen Software in einer MATLAB - Umgebung wurde für zweidimensionale Rasterung Rekonstruktion verwendet, wo Spiralproben im k-Raum rekonstruiert werden in gerasterte Bilder 31-33. Zeitreihendaten wurden durch die Berechnung der prozentualen Modulation des BOLD Signal jedes Voxel relativ zu der Basisperiode erzeugt vor der Stimulation gesammelt. Voxel, deren Zeitreihen wurden synchronisiert Blöcke von optogenetische Stimulation mit einem Kohärenz-Wert von 0,35 oder mehr wurden als aktivierte Voxel definiert; Diese Kohärenzwert entspricht einer weniger als 10 -9 P - Wert 8. Kohärenz - Werte wurden berechnet als die Größe der Fourier bei der Frequenz der wiederholten Stimulationszyklen durch die Summe der Quadrate aller Frequenzkomponenten 8,27 geteilt wandeln. Familywise Fehler kann mit der Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche gesteuert werden. Alternative Methoden der Analyse kann verwendet werden, einschließlich parametrischer statistischer Tests wie die allgemeine lineare Modelle (GLMs). Die Kohärenzverfahren erfordert weniger vorherige Kenntnis der HRF Vergleich zu dem herkömmlichen allgemeinen linearen Modell. Daher ist es vorteilhaft, wenn die Daten unter Verwendung ofMRI erkunden. Allerdings kann die Kohärenzmethode nur für Daten mit Block-Designs oder ausgewählte Event-Related Designs mit einem festen Interstimulus Intervall verwendet werden und nicht in ofMRI Daten mit anderen ereignis rela verwendet werden können,ted-Designs oder gemischte Entwürfe. Anschließend kann dynamische kausalen Modellierung (DCM) verwendet werden Wechselwirkungen zwischen Hirnregionen durch ofMRI identifiziert zu analysieren. DCM ist ein Bayes für die Analyse der funktionellen Konnektivität von Systemantworten auf experimentelle Eingänge während fMRI 34 entwickelte statistische Technik. Weitere technische Bedenken für ofMRI werden hier diskutiert. Implantate können beschädigt oder fallen werden, um die Entfernung des betroffenen Tieres aus der Studie führte. Re-Implantation Operationen werden nicht auf Grund der zusätzlichen Unsicherheit empfohlen von den gleichen ROI wie in der ursprünglichen Implantationschirurgie Targeting und wegen Fragen des Tierschutzes. Aufgrund der sehr viel Zeit und Ressourcen in jedem Tier Thema investiert, Berücksichtigung der Festigkeit des Materials ist ein wesentliches Anliegen, wenn für den Einsatz in ofMRI Studien eine geeignete Zahnzement wählen. Die Implantationschirurgie ist ein kritischer Faktor für die Lebensdauer des IMPLAN Maximierungt und einem Tier. Beispielsweise sichergestellt, dass der Schädel des Dentalzements vor dem Aufbringen und Anordnen einer ausreichenden Menge an Zement um den Keramikring Implantat trocken ist Stabilität auf potentielle monatelangen Zeitleiste des Tieres während der Studie gewährleisten. Zusätzlich können alternative Käfigausführungen erforscht und mit der lokalen Tierstation behandelt werden, um zu vermeiden, Käfige mit Drahtspitzen das Essen und Wasser zu halten, die oft in den Käfig hineinragen und bieten Möglichkeiten für das Tier, das Implantat zu beschädigen. Wichtig ist, dass die Zahnzement sorgfältig Artefakte zu reduzieren ausgewählt werden, die Bildgebung und alternative Zemente beeinflussen kann durch Auftragen auf ein Phantom und Bildgebung in einem Scanner vor der Verwendung in Tierversuchen getestet werden. Versuch und Irrtum mit verschiedenen Dentalzementen hat gezeigt, daß der Zement in diesem Protokoll verwendet relativ wenige Artefakte gibt. Eine andere technische Herausforderung ofMRI in der Durchführung ist die Genauigkeit der faseroptischen Anordnung an der vorgesehenen ROI, angesichts der extremely kleine Entfernungen , die zwischen den Kernen 35 im Gehirn vorhanden sein können. Nach dem Abschluss können die Implantation Operationen, T2-gewichteten anatomischen Scans verwendet werden, die korrekte Platzierung zu bestimmen, indem auf eine Gehirnatlas überlagert. Die Fähigkeit des Chirurgen und Praxis, diese Operationen durchführen kann die korrekte Platzierung Raten zu verbessern. Die Spezifität und die Expression des Opsin an der beabsichtigten ROI kann dem Opsin zur Visualisierung getaggt durch Perfusion das Tier und Fixieren des Gehirns, unter Verwendung von Immunhistochemie oder die endogene Fluoreszenz eines Reporter-Proteins am Ende der Studie verifiziert werden. Diese Reporterproteine ​​können auch mit anderen Proteinen kolokalisiert werden , um sicherzustellen , dass das Opsin in den gewünschten neuralen Zelltypen 1,8,15,25 exprimiert wird. Wie bereits erwähnt, können Artefakte entstehen , wenn 22 ofMRI aufgrund von Gewebeerwärmung von Lichtabgabe durchgeführt wird . Die Erwärmung des Gewebes bewirkt Veränderung der Relaxationszeiten, was zu falschen BOLD-Signal. Um sicherzustellen, dass die acvierung aus Licht Stimulation während ofMRI ist nicht auf dieses Artefakts, Opsin-negativen Kontrollen sollten mit Steuer Fluorophor Vektoren (wie beispielsweise AAV-CaMKIIa-EYFP) unterzogen ofMRI injiziert, in denen entweder Kochsalzlösung injizierten Tieren oder Tieren durchgeführt werden. Darüber hinaus sind nur gut ausgebaute LWL-Implantate mit guter Lichtübertragungseffizienz sollte die Notwendigkeit verwendet werden, zu entfernen hohen Laserleistungen zu verwenden. ofMRI Studien haben in die falsche Aktivierung aufgrund Gewebeerwärmung durchgeführt wurde ein Problem 1,6-8,10,11 nicht gewesen. In Bezug auf die Wahl des Vektors die erforderlichen optogenetische Gene in Nervenzellen für die Expression, AAV nicht zu verursachen Krankheit beim Menschen bekannt und sind daher eine bequeme Möglichkeit, angesichts der niedrigeren Biosicherheitsstufe einzuführen erforderlich, um diese Mittel zu verwenden (BSL-1). Darüber hinaus führen eine Vielzahl von Vektor-Kerne AAV mit verschiedenen optogenetische Gene auf Lager verpackt und mit mehreren Serotypen. Der Serotyp von AAV muss b gewählt werdenasierend auf der Zellpopulation Ziel soll eine optimale Expression Ebenen 36,37 gewährleisten. Lentiviren kann auch erfordern jedoch eine höhere Biosicherheitsstufe verwendet werden. Die Zeitdauer für eine ausreichende Expression der optogenetische Gene erforderlich ist variabel in Abhängigkeit von der spezifischen Tiermodell, auf dem insbesondere AAV verwendet und auf die spezifische experimentelle Paradigma verwendet. In diesem Protokoll Sprague Dawley Ratten nach 11 Wochen alt sind, verwendet und optogenetische Studien beginnen vier bis sechs Wochen nach der Virusinjektion. Transgene Mäuse können auch in optogenetische Studien verwendet werden. Es ist notwendig, Modellversuche durchzuführen, die bestimmte Menge an Zeit für eine ausreichende Expression der Opsinen erforderlich zu bestimmen. Die Stimulation Paradigmen können variieren von der verwendeten spezifischen Opsin abhängig. In diesem Protokoll AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP verwendet wird und die Stimulation Paradigma ist 20 s an / 40 sec ab. Bei Verwendung eines SSFO, variiert die Stimulation Paradigma, weil die SSFO nur einen kurzen Lichtimpuls erfordert ac zu seintiviert und dann ein kurzer Lichtimpuls bei einer anderen Wellenlänge beendet werden. Ein weiterer kritischer Punkt bei der Durchführung von ofMRI mit dem LWL-Patchkabel während optogenetische Stimulation Lichtaustritt aus der Zwinge Implantat-Grenzfläche verhindert eine verwirrende Gehirn Signal mit Ursprung aus visueller Stimulation zu verhindern, auch wenn das Tier betäubt wird. Kegel von schwarzem Isolierband kann verwendet werden, um das Licht von den Ringen zu blockieren und die Augen des Tieres zu decken. Wichtig ist , müssen physiologische Werte einschließlich expiratory CO 2 und die Körpertemperatur des Subjektes korrekt während der gesamten Dauer des Abbildungs ​​aufrechterhalten werden. 4% und die Körpertemperatur bei 37 ° C - exspiratorische CO 2 sollte zwischen 3 gehalten werden. Darüber hinaus reduzieren die Shim-Sequenzen so viel Inhomogenität wie möglich im Magnetfeld vor dem Start ofMRI bestimmt scannt stark die Qualität der resultierenden BOLD-Daten. Steuerung dieser Faktorenkritisch ist zuverlässig ofMRI Daten in der Herstellung. In diesem Protokoll DPSS-Laser sind als Lichtquelle für optogenetische Stimulation verwendet. Da Laserlicht kohärent ist, mehr als genug Leistung kann leicht durch das faseroptische geliefert. LED-Lichtquellen zu Glasfaser gekoppelt sind von kommerziellen Anbietern erhältlich, haben aber den Nachteil einer verringerten Leistung der Lichtdurchlässigkeit. Die Laserlichtquelle erfordert Ausrichtung zu jedem speziellen Glasfaser-Patchkabel, aber mit der Praxis kann die Ausrichtung innerhalb von Sekunden bis Minuten erreicht werden. Zukünftige Anwendungen von ofMRI umfassen die Verwendung der nächsten Generation Opsinen wie rotverschoben Opsinen zu ermöglichen nicht-invasive Stimulation während der Bildgebung. Zusätzlich könnte die Implantation von MRI-kompatiblen EEG oder ähnliche Aufzeichnungselektroden zusammen mit der faseroptischen Implantat zur Erfassung von hoher zeitlicher Auflösung Daten zusätzlich zu den hohen räumlichen Auflösung von MRI-Daten zu ermöglichen. ofMRI mit electrophysiollogische Aufnahme umfangreiche Informationen über die funktionelle Konnektivität des Gehirns bieten könnte. die Kraft der ofMRI Zusammenfassend macht die gesamte Gehirn in Reaktion auf die Stimulation von spezifischen Zellpopulationen zu überwachen, die durch genetische oder anatomischen Identität definiert ofMRI ein wichtiges Werkzeug bei der Untersuchung von neurologischen Erkrankungen und der connectomics des gesunden Gehirns zu verwenden.

Optogenetische funktionelle Magnetresonanztomographie (ofMRI) ist eine neue Technik, die die räumliche Auflösung der Hochfeld - fMRI mit der Präzision der optogenetische Stimulation typspezifische Kartierung funktioneller neuronaler Schaltkreise und deren Dynamik in der gesamten kombiniert 1-11,38, so dass Zell Gehirn. Optogenetik ermöglicht für bestimmte Zelltypen für die Stimulation durch die Einführung der lichtempfindlichen Transmembranleitfähigkeitskanäle, genannt Opsinen ausgerichtet werden. Spezifische Elemente der neuronalen Schaltkreise sind genetisch modifiziert , dass diese Kanäle zum Ausdruck bringen, so dass Millisekunden-Zeitskala Modulation der Aktivität im intakten Gehirn 15.01. fMRI bietet eine nicht-invasive Methode des Gehirns der globalen Dynamik auf optogenetische Stimulation spezifischer neuronaler Schaltkreise durch Messung der Blut-Sauerstoff-Niveau abhängig (BOLD - Signal) Bestimmung 16-18, die eine indirekte Messung der neuronalen Aktivität zur Verfügung stellt. Die Kombination dieser beiden Techniken, optogenetische funktionelle Magnetresonanztomographie (ofMRI) bezeichnet wird, ist vorteilhaft gegenüber anderen Methoden zur Erfassung der Hirnaktivität während der Stimulation wie Elektrophysiologie, weil sie einen Blick auf das gesamte Gehirn bei relativ hoher räumlicher Auflösung zur Verfügung stellen kann. Dies ermöglicht die Erkennung von neuronaler Aktivität in Reaktion auf gezielte Stimulation in großer Entfernung von dem Ort der Stimulation ohne die Notwendigkeit für eine Implantation invasiver Aufzeichnungselektroden 1-11. ofMRI ist vorteilhaft gegenüber dem traditionellen Verfahren zur Durchführung einer elektrischen Stimulation während fMRI, die unterschiedliche Zelltypen in der Nähe der Elektrode zu rekrutieren und damit den kausalen Einfluss jeder 19 Einwohner verwechseln. Außerdem werden die Elektroden zur elektrischen Stimulation und der erzeugte Strom Artefakte während der MR - Bildgebung 20 erzeugen kann. Tatsächlich ermöglicht ofMRI die Beobachtung des Einflusses auf die globale Hirnaktivität aus der spezifischen modulatiauf einer breiten Vielfalt von Zelltypen durch die Verwendung von fortschrittlichen genetischen Targeting Techniken wie das Cre-Lox-System in transgenen Tieren oder die Verwendung von Promotoren. Kombinatorische optische Steuerung mit ganzem Gehirn Überwachung ist mit ofMRI durch die Verwendung von sowohl NpHR zu hemmen und ChR2 spezifischen Zelltypen zu erregen. Die optogenetische Toolkits für den Einsatz in ofMRI verbessert sich ebenfalls schnell im Laufe der Zeit mit der Einführung von Opsinen mit erhöhter Lichtempfindlichkeit oder eine verbesserte Kinetik stabilisierter Stufenfunktion Opsinen (SSFOs) oder rotverschoben Opsinen, die die Anforderung für implantierte Faser negieren können Optik, ermöglicht nicht-invasive Stimulation während der Bildgebung 21. Diese Möglichkeiten sind nicht mit elektrischer Stimulation zur Verfügung. Jedoch resultierende Signal Artefakte aus Gewebeerwärmung durch Lichtabgabe im Gehirn wurden 22 gemeldet, wo temperaturbedingte Modifikation von Relaxationszeiten hat sich gezeigt , Pseu herzustellentun Aktivierung. Forscher ofMRI Durchführung deshalb sollten sich bewusst dieses Potenzial verwechseln sein. Mit der richtigen Einstellung und Kontrollen kann das Problem angegangen werden. Zusätzlich relativ geringe zeitliche Auflösung der hämodynamischen Antwort in fMRI Messung kann ein limitierender Faktor für bestimmte Anwendungen dieser Technik sein. Dieses Protokoll beschreibt zunächst den Aufbau der Lichtwellenleiter - Implantate , die Lieferung von spezifischen Wellenlängen von Licht tief in das Gehirn in vivo ermöglichen. Das Protokoll beschreibt dann die Lieferung des Opsin-kodierenden viralen Vektor auf einen präzisen Hirnregion stereotaktischen Chirurgie verwendet wird. Als nächstes wird das Protokoll beschreibt den Prozess der Whole-Brain funktionellen MRT bei gleichzeitiger Lichtstimulation. Schließlich beschreibt das Protokoll grundlegende Datenanalyse der erfassten Daten. Zu beachten ist, beschrieben die Optogenetik hier erfordern eine chronische Implantat zur Lichtabgabe. Jedoch sind die Lichtwellenleiter-Implantate stabil und bio-kompatible, so dass für Längs Abtastung und Untersuchung von neuronalen Schaltkreise über einen Zeitraum von mehreren Monaten 23,24. Zusammengefasst sind die präzise Stimulation und Whole-Brain-Überwachung Fähigkeit von ofMRI entscheidenden Faktoren bei der Herstellung eines leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der connectomics des Gehirns ofMRI. Darüber hinaus kann es neue Einblicke in die Mechanismen der neurologischen Erkrankungen 25 liefern , wenn sie mit verschiedenen Tiermodellen gekoppelt. Tatsächlich hat ofMRI verwendet, um die Netzwerkaktivität verschiedener hippokampalen Subregionen mit Anfällen 8 verbunden zu erläutern. Deshalb interessiert Laboratorien Systemebene neurowissenschaftlichen Fragen zu beantworten wird diese Technik von Bedeutung finden.

<table><tbody><tr><td>7 Tesla scanner</td><td>Agilent Technologies</td><td>Discovery MR901 System</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rats</td><td>Charles River</td><td>Crl:SD</td><td>11 weeks old</td></tr><tr><td>fiber cleaver</td><td>Fujikura</td><td>CT-05</td><td></td></tr><tr><td>multimode optical fiber</td><td>Thor Labs</td><td>AFS105/125Y</td><td></td></tr><tr><td>fiber stripper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thor Labs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>ceramic split sleeve</td><td>Precision Fiber Products</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr><tr><td>epoxy glue</td><td>Thor Labs</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>cotton-tipped applicators</td><td>Stoelting Co.</td><td>50975</td><td></td></tr><tr><td>multimode ceramic zirconia ferrules</td><td>Precision Fiber Products</td><td>MM-FER2002</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC multimode connector</td><td>Thor Labs</td><td>30128C3</td><td></td></tr><tr><td>fiber optic polishing disk</td><td>Precision Fiber Products</td><td>M1-80754</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 0.3 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG03P</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 1 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG1P</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 3 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG3P</td><td></td></tr><tr><td>binocular biological microscope 40X-1,000X</td><td>Amscope</td><td>B100</td><td></td></tr><tr><td>laser safety glasses</td><td>Kentek</td><td>KXL-62W01</td><td></td></tr><tr><td>473 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0473</td><td></td></tr><tr><td>594 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0594</td><td></td></tr><tr><td>Allen hex wrench set</td><td></td><td></td><td>2.0 mm (5/64&quot;) for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser</td></tr><tr><td>power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm</td><td>Thor Labs</td><td>PM121D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothesia)</td><td>Henry Schein&amp;nbsp;</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane vaporizer with induction chamber</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 100 &amp;micro;l syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>function generator</td><td>A.M.P.I.&amp;nbsp;</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>small animal stereotax</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Model 683 small animal ventilator&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>550000</td><td></td></tr><tr><td>Type 340 capnograph&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733809</td><td></td></tr><tr><td>dental drill (rotary micromotor kit)</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic ointment (Artificial Tears)</td><td>Rugby</td><td>00536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>instrument sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>Germinator 500</td><td>glass bead sterilizer</td></tr><tr><td>antibiotic powder</td><td>Pfizer</td><td>NEO-PREDEF</td><td>neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride</td></tr><tr><td>buprenorphine painkiller</td><td>Hospira</td><td>NDC:0409-2012</td><td>schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock</td></tr></tbody></table>

optogenetic functional mri

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

<html> Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen repräsentative Daten , die sich von 20 Hz (15 ms Pulsbreite, 473 nm, 30% Einschaltdauer) optogenetische Stimulation des motorischen Kortex. Ein Stimulations Paradigma von 30 Sekunden von Baseline, gefolgt von 20 s an / 40 sec ab sechs min verwendet wurde. Frühere Studien haben gezeigt , dass dieses Paradigma robust BOLD - Signal von optogenetische Stimulation 1,8 erzeugt. Abbildung 1 zeigt die aktivierten Voxel sowohl am lokalen Standort der Stimulation (motorischen Kortex) erfasst und im Thalamus, als Folge der weitreichenden synaptischen Verbindungen zwischen diesen Regionen. 2 zeigt , dass zeitliche Informationen aus HRFs entnommen werden, da die Thalamus - Reaktion (untere Anfangssteigung) im Vergleich zum motorischen Kortex Reaktion nach optogenetische Stimulation verzögert. p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Die Aktivierung Karte von BOLD Signal induziert durch optogenetische Stimulation von CaMKIIa-exprimierenden Zellen in Motor Cortex. Coherence Werte der aktiven Voxel, wie die identifizierten deutlich synchronisiert wiederholte Stimulationen werden überlagert dargestellt auf einem T2-gewichteten koronalen anatomischen Scheibe. Die gesammelten Daten über sechs Minuten, 30 Sekunden Zeit (Anfangs 30 sec Baseline und sechs Stimulationszyklen von 20 s an / 40 sec off mit 473-nm-Licht, 20 Hz, 15 ms Pulsbreite) werden in eine Aktivierungskarte kondensiert. Sequential Scheiben sind 0,5 mm voneinander entfernt und die Lage des faseroptischen Implantat wird durch das Dreieck bezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53346/53346fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. Die hämodynamische Antwortfunktion. (links) Die prozentuale Modulation des BOLD - Signals relativ zu den Ausgangsdaten zur aktiven Voxel in motorischen Kortex und Thalamus während optogenetische Stimulation des motorischen Kortex (sechs Stimulationszyklen von 20 s an / 40 sec off gezeigt mit 473-nm-Licht, 20 Hz, 15 ms Pulsbreite). Grau schattiert Fehlerbalken bezeichnen Standardfehler über aktivierten Voxel innerhalb ROI. (Rechts) Zeit gemittelten Antworten werden durch die hämodynamischen Antwortfunktionen (HRF) gegeben. Der Thalamus HRF zeigt ein verzögertes Ansprechen in Bezug auf die Motorkortex stimuliert. Blaue Balken zeigen Perioden von 473 nm Photostimulation. Grau schattiert Fehlerbalken bezeichnen Standardfehler über sechs Zyklen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Optogenetic Functional MRI

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Optogenetische Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Aufrufe.  Stanford University. This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Serie: Optogenetic Functional MRI

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and molecular approaches allow the investigation of either different stimuli on few neurons, or one stimulus in large parts of the brain, blood oxygenation level dependent (BOLD) functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) allows combining both advantages, i.e. compare the neural activation induced by different stimuli in the entire brain at once. fMRI in songbirds is challenging because of the small size of their brains and because their bones and especially their skull comprise numerous air cavities, inducing important susceptibility artifacts. Gradient-echo (GE) BOLD fMRI has been successfully applied to songbirds 1-5 (for a review, see 6). These studies focused on the primary and secondary auditory brain areas, which are regions free of susceptibility artifacts. However, because processes of interest may occur beyond these regions, whole brain BOLD fMRI is required using an MRI sequence less susceptible to these artifacts. This can be achieved by using spin-echo (SE) BOLD fMRI 7,8 . In this article, we describe how to use this technique in zebra finches (Taeniopygia guttata), which are small songbirds with a bodyweight of 15-25 g extensively studied in behavioral neurosciences of birdsong. The main topic of fMRI studies on songbirds is song perception and song learning. The auditory nature of the stimuli combined with the weak BOLD sensitivity of SE (compared to GE) based fMRI sequences makes the implementation of this technique very challenging.

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

This article shows an optimized procedure for imaging of the neural substrates of auditory stimulation in the songbird brain using functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI). It describes the preparation of the sound stimuli, the positioning of the subject and the acquisition and subsequent analysis of the fMRI data.

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) mit Auditive Stimulation in Singvögel

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Forschung

Verhalten

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Weiterentwicklung des Visual Cortex Mapping für eine verbesserte Bewertung von Sehstörungen

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) of the Visual Cortex with Wide-View Retinotopic Stimulation

High-resolution retinotopic blood oxygenation level-dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) with a wide-view presentation can be used to functionally map the peripheral and central visual cortex. This method for measuring functional changes of the visual brain allows for functional mapping of the occipital lobe, stimulating &gt;100&#176; (&plusmn;50&#176;) or more of the visual field, compared to standard fMRI visual presentation setups which usually cover &lt;30&#176; of the visual field. A simple wide-view stimulation system for BOLD fMRI can be set up using common MR-compatible projectors by placing a large mirror or screen close to the subject's face and using only the posterior half of a standard head coil to provide a wide-viewing angle without obstructing their vision. The wide-view retinotopic fMRI map can then be imaged using various retinotopic stimulation paradigms, and the data can be analyzed to determine the functional activity of visual cortical regions corresponding to central and peripheral vision. This method provides a practical, easy-to-implement visual presentation system that can be used to evaluate changes in the peripheral and central visual cortex due to eye diseases such as glaucoma and the vision loss that may accompany them.

Autor im Rampenlicht: Einblicke in die Forschung des visuellen Kortex durch Wide-View-fMRT-Mapping 

We have developed techniques for mapping the visual cortex function utilizing more of the visual field than is commonly used. This approach has the potential to enhance the evaluation of vision disorders and eye diseases.

Funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) der Sehrinde mit retinotopischer Stimulation

High-resolution retinotopic blood oxygenation level-dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) with a wide-view presentation can be ...

Optogenetische Functional MRI

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) mit Auditive Stimulation in Singvögel

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

Funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) der Sehrinde mit retinotopischer Stimulation

Funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) der Sehrinde mit retinotopischer Stimulation

Funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) der Sehrinde mit retinotopischer Stimulation