We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

Hinweis: Für diese Studie Lungen mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) vom distalen Lungengewebe isoliert wurden entweder auf der Grundlage ihrer Expression von Zelloberflächenmarker (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 hoch, EpCAM neg) 14,15, mit Explantation out-Wachstum 16, oder unter Verwendung von enzymatischen Abbau 17. Haft LR-MSCs wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und kein Glutamin, 15% FBS, 1x Antibiotikum / Antimykotikum, und 2 mM Glutamin (nachstehend vollständige Medien) und bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. LR-MSCs wurden 3-4 mal passagiert, um eine Population von Zellen mit relativ homogenen Wachstumseigenschaften für den Migrationstest sicherzustellen. 1. Vorbereiten einer konfluenten Monolayer <ol><li> Um MSCs von Standard-100 mm Kulturschalen zu lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml 37 ° C vorgewärmten PBS, saugen Sie den PBS und fügen Sie 4 ml Trypsin (0,25%). Inkubieren 3-5 min in einem 37 ° C Inkubator. Saugen Sie das cells in eine konische Röhre fügen gleichen Volumen von komplettem Medium und Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren gelassen. Hinweis: Längere Inkubation in Trypsin kann die Zelloberflächenrezeptoren verändern und möglicherweise beeinflussen Migration. </li><li> Saugen Sie Medien und resuspendieren Zellen in frischem Vollmedium. Zählen von Zellen, ohne toten Zellen mit Trypanblau-Ausschluss und Platte 500.000 mesenchymalen Stromazellen in 4 ml komplettem Medium auf einer 60 mm Zellkulturschale. Anmerkung: Abhängig von der Quelle der Zellen, können die Tests erforderlich sein, um die optimale Anzahl der benötigten Zellen zu bestimmen. </li><li> Inkubieren Zellen bis Platten sind 90% konfluent für eine optimale Zellhaftung und Proliferation, in der Regel 48 bis 72 Stunden für MSCs. Hinweis: 100% Zusammenfluss ist nicht zu empfehlen, da viele verankerungsabhängigen Zellen Erfahrung Kontakthemmung, die ihre Migrationsfähigkeit verändern können. Platten mit weniger als 80% Konfluenz in unbrauchbare Fotos führen, da der Bildanalyse-Software wird Spalt interpretierens zwischen den Zellen als Teil des Umfangs des Kratzers (siehe Figur 1D). </li><li> Nachdem die Zellen 90% Konfluenz erreicht, schädigen die Zellen gegebenenfalls für die Anwendung. Um Zellschäden nach Einwirkung von löslichen Zigarettenrauch Extrakt (CSE) zu bewerten, zu erzeugen, 100% CSE durch Ziehen der Rauch von 1 University of Kentucky Forschungs Zigarette (3R4F) über 25 ml Komplettmedium in einer Saugflasche mehr als 2 min 18. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in 4 ml 1-4% CSE in komplettem Medium verdünnt. Nach der Inkubation, waschen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml warmem sterilem PBS, bevor Sie mit 4 ml frisches Vollmedium. Hinweis: schädlichen Zellen mit hohen Konzentrationen von Zigarettenrauch-Extrakt (&gt; 5%) kann Fluss wesentlich zu verringern. </li></ol> 2. Erstellen der Scratch <ol><li> In einer sterilen Umgebung, nehmen Sie den Deckel von der 60-mm-Platte von beschädigten MSCs und legte eine gerade Kante (zum Beispiel eine sterilisierte Kunststofflineal) across der obere Rand der Platte. , Ohne dass die Medien, eine sterile 200 ul Pipettenspitze von der sterilen Lineal geführt, um 03.59 Uhr parallel Kratzer über die Platte ca. 5 mm voneinander entfernten und 50 mm Länge zu machen. Hinweis: Eine gerade Kante der Betrag der Dreh Anpassungen an der Platte benötigt wird, wenn es auf dem Mikroskoptisch minimiert. Es ist zwingend notwendig, dass die Kratzer vollständig vertikal (oder horizontal) auf dem Bildschirm angezeigt. Erzeugen mehrerer Kratzer auf einer 60 mm Platte nicht die Mikroumgebung in einer Weise, die die Zellmigration (Daten nicht dargestellt) beeinflusst zu verändern, kann jedoch eine Überlegung für andere Zelltypen sein. Die Verwendung kleinerer Vertiefungen wird nicht empfohlen, da die Variabilität der wachsenden Zellen dicht an der Kante des Bohrlochs wird ausgeprägter und kann einheitlich Erzeugung von Kratzern zu beeinflussen. </li><li> Saugen Sie die Medien und vorsichtig waschen die Platten mit 2 ml vorgewärmten komplette Medien um Zellen aus dem Zentrum von dem Kratzer anhaftet und zu Zelle zu entfernens, die durch das Kratzen gelockert wurden. Ersetzen durch 4 ml frisches Vollmedium. </li><li> Mit einem sterilen Permanentmarker kennzeichnen jeden Kratzer 1-4 auf der Unterseite der Platte an der Stelle, die nicht mit der Abbildung der Kratzer stören. Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Bilder von dem gleichen Grund auf, verglichen vor und nach der Migration, da kann eine Variation in der Kratzbreite sein. </li></ol> 3. Unter Erste Bilder des Scratch Anmerkung: Falls die Scratch Test beruht auf mehreren Platten durchgeführt, ist es empfehlenswert, dass die ersten Bilder aller Kratzer auf einer einzigen Platte ergriffen werden, bevor Kratzer auf der nächsten Platte hergestellt. <ol><li> Verwenden eines invertierten Phasenkontrastmikroskops mit einer Kamera, die Bilder für die Analyse benötigt generieren. </li><li> Positionieren Sie die Kulturplatte auf dem Mikroskop, und verwenden Sie die Low-Power-Objektiv (10x) zu lokalisieren kratz # 1. Wenn sich Kondensation auf dem Deckel des Kulturplatte behindert eine klare image der Zellen, mit einem beheizten Bühnen auf 37 ° C. </li><li> Keeping the scratch vollständig horizontalen und in der Mitte des Sichtfeldes, erhalten so viele Bilder wie nötig, um 90% der Länge der Kratzer zu umfassen. Erhalten von Bildern von verschiedenen Abschnitten der Kratzer mit keiner Überlappung zwischen den Bildern. Anmerkung: Die Lichtbrechung an den Rändern des Kulturschale überbelichtet die Bilder, so dass sie nicht analysiert werden. Daher keine Bilder nehmen Sie aus dem ersten und letzten 5% der Länge der Kratzer ist. </li><li> Bilder von jedem Kratzer Speichern in einem separaten Ordner. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 für Kratzer 2, 3, und 4. </li><li> Return-Platten in den Inkubator unmittelbar nach der anfänglichen Bildgebung. Lassen Zellen wandern für 4-7 Std. Hinweis: 7 h ist optimal, wenn die Beurteilung MSCs mit CSE beschädigt. Inkubation von Zellen, die für mehr als 7 Stunden wird nicht empfohlen, weil die Zellproliferation als verwirrende Variable für die Zellmigration handeln (siehe Optional Anmerkung 8.2 unten). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analysieren Initial Scratch Bilder <ol><li> Laden Sie ImageJ und die Wundheilung Werkzeug-Plugin installieren (siehe die Tabelle der Materialien / Ausrüstung). </li><li> Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ, klicken Sie dann auf &quot;Process&quot; und &quot;Konturen finden&quot;, um die Zellen rund um den Grund auf für die Wundheilung Tool, um die Kratzfläche (2B) berechnen zu markieren. Klicken Sie dann auf &quot;Bild&quot;, &quot;Anpassen&quot;, &quot;Color Threshold&quot; und im Dropdown-Menü mit &quot;Threshold Color&quot; den Wert ändern &quot;B &amp; W&quot;. </li><li> Im Menü &quot;Farbschwelle&quot;, stellen die beiden Helligkeitsschwelle bewegen, bis die optimale Kontrast zwischen dem Kratzer und Zellfront erreicht wird. Um sich für die größte Reichweite bei dem Versuch, Kontrast im Bild zu erstellen, bewegen Sie den unteren Schieberegler ganz nach rechts (komplett schwarzes Bild), und stellen Sie dann den oberen Schieberegler, um maximalen Kontrast erzeugen kann. </li><li> Langsam stellen Sie den oberen brightness Schieberegler von links nach rechts, bis das Bild sauber zeigt die Kontur des Kratz (2C). Sobald die Kanten der Kratz identifiziert worden sind, klicken Sie auf &quot;Weitere Optionen&quot; in der ImageJ-Toolbar, wählen &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; im Dropdown-Menü, und drücken Sie die Taste &quot;M&quot; (das wird in der ImageJ Symbolleiste angezeigt werden), um den Entwurfsbereich markieren und gibt die berechnete Fläche in einem Ergebnisse Pop-Out-Fenster (2D). </li><li> Kopieren Sie alle Nummern aus dem Ergebnisfenster (2E) in einer Excel-Tabelle. Achten Sie darauf, Daten einzelner Kratzer zu trennen. </li></ol> 5. Unter Schlussbilder des Scratch <ol><li> Nachdem die Zellen migriert (4-7 h), wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4. Bild die Platten in der gleichen Reihenfolge, wie sie zerkratzt wurden, so dass die Zellen auf jeder Platte haben gleich viel Zeit für die Migration hatte. Anmerkung: Die Zellen können zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden, abhängig von ihrer Sensivität sowohl Temperatur und pH-Änderungen. Alternativ können Live Cell Imaging verwendet, um die Zellen zu folgen in Echtzeit, wie sie zu migrieren. </li></ol> 6. Analysieren von Final Scratch Bilder <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,5 für Final Scratch Bilder. </li></ol> 7. Berechnung des Scratch Bereich zur Migrations Quantifizieren <ol><li> Berechnen Sie den Mittelwert vor der Migration Bereich durch Mittelung der Anfangsbereich Werte der jeweiligen Kratzer. </li><li> Berechnen die Gesamtmenge der Migration durch Subtrahieren der endgültigen Migrationsbereich für jedes Bild, die in Schritt 6 berechnet aus dem Durchschnitt vor der Migration Bereich (Schritt 7.1). Erstellen Sie eine Liste von Werten für jeden Kratzer, die die Veränderung der Migration. </li><li> Bündeln die Daten aus mehreren Kratzer innerhalb des gleichen Testgruppe (dh alle Platten und alle Kratzer auf Zellen auf 0% CSE ausgesetzt ist). Verwenden Sie eine Varianzanalyse-Test, um die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu analysieren. </li><li> Wenn die Zellen langsam migrierenund eine längere Inkubationszeit nach dem Kratzen (größer als 10-12 Stunden), führen eine BrDU oder EdU Inkorporationstest 19 zu bestimmen, ob Zellen zuvor irgendeine Proliferation während des Zeitraums, in dem der Migrationstest auftritt. Wählen Sie einen Migrationstest Zeit zu erheblichen Zellproliferation zu vermeiden. </li></ol> 8. Optional <ol><li> Zu beurteilen, ob eine signifikante Zellalterung infolge des Kratzverfahren auftritt, führen Sie einen Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase-Assay auf einer Testplatte zu vorbestimmten Zeiten nach dem Kratzen 19. </li></ol>

<ol>
	<li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative,+facile,+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay.">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li><li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li><li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+or+stromal+cells:+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices.">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li><li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates.">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex/focal+Adhesion-Independent+Mechanism.">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li><li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts.">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing:+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays.">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li><li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li><li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates.">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li><li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy.">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li><li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction.">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li><li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival,+Persistence,+Paracrine+Expression,+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung.">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li><li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-,+muscle-,+and+adipose-derived+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).</li><li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD.">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li><li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitativ stabile, standardisierte Verfahren durchzuführen und zu analysieren Kratztests. Einfache kratz Tests werden routinemäßig in vielen verschiedenen Bereichen der Studie verwendet werden, um Zellmigration zu untersuchen. Jedoch traditionell die Scratch-Test hat ein standardisiertes Set-up und Quantifizierung Protokoll, das auf Fragen im Zusammenhang mit der Reproduzierbarkeit 7,10 geführt hat gefehlt. Viele der Änderungen und Optimierungen zur Verbesser...

Zellmigration ist hoch koordinierter und entscheidend für viele physiologische Prozesse, wie beispielsweise der Gewebeentwicklung, Reparatur und Regeneration sowie pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Arteriosklerose 1. Ein Verständnis der Zellmigration ist besonders relevant für Emerging Therapien eingesetzt, um beschädigte Gewebe zu reparieren und zu behandeln pathologischen Zuständen, einschließlich Zelltransplantation Technologien und künstliche Gewebe Pfropfen 2. Angesichts der gegenwärtigen Interesse an der Rolle von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) bei der Vermittlung der Reparatur von Gewebe 3, Quantifizierung der Migrationsfähigkeit dieser Zellen unter Verwendung eines Assays, die streng quantifizierbare, anpassungsfähig und kosteneffektiv ist von Interesse ist. Wichtig ist, dass ein solcher Test, relativ geringfügige Änderungen in der zellulären Migrationsfähigkeit nach Beschädigung ausreichend empfindlich sein. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Grund auf Assays, trans-und Migrationsassays (Boyden chBernsteine), micropillar Arrays und Zellsperrzone Assays besitzen eine Reihe von Einschränkungen in der Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und Kosten-Nutzen-1,4,5. Die hier beschriebene optimierte Kratz Test zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbar und bildbasierten Analysemöglichkeiten, Wirtschaftlichkeit und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen. Scratch-Assays sind in mehreren Kapazitäten verwendet worden, um die Zellmigration und Proliferation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen 5 zu beurteilen. Der Test beinhaltet Aussäen der bezeichneten Zellen, wächst sie in oder in der Nähe Zusammenfluss abgeschlossen ist, und ein Verkratzen der resultierenden Monoschicht mit einer sterilen Nadel oder Pipettenspitze 6. Analyse wird am häufigsten durch Vergleichen der Breite des Kratzers über mehrere Zeitpunkte an zufällig ausgewählten Stellen 7-9 durchgeführt. Trotz seiner prominenten Gebrauch wird der Kratztest durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Quantifizierung verwechselt. VariabilitätGeneration des Scratch nicht verändert nur die Mikroumgebung der Zellen, sondern kann auch die Zellmigration zu verhindern, indem die Plattenoberfläche und die zugrunde liegenden extrazellulären Matrix 5 zu beschädigen. Assays werden häufig mehr als 7 bis 12 h durchgeführt, jedoch für die Zelllinien Anzeige langsamer Migration und längere Testzeiten wird die Proliferation eine verwirrende Variable 7,10. Schließlich kann seneszenten Zellen durch den Ritzvorgang erzeugten Faktoren, die mit der extrazellulären Signalisierung benötigt, um die Lücke in der Monoschicht 1 schließen stören zugeben. Optimierung des Kratztest erfordert die Schaffung eines konsistenten Lücke, die nicht mit Oberflächeneigenschaften nicht beeinträchtigt, die Minimierung Assay Zeitlänge und verhindert unerwünschten Zelltod während der Manipulation. Der Anschlag basierenden Assay ist eine Optimierung der Zellausschlusszone Assay. Dieses Assay wendet einen Anschlag in der Mitte der Vertiefung, die das Zellwachstum schließt platziert, aber erlaubt den Zellen, um den zentralen Sperrzone plattiert werden.Um die Migration zu bewerten, wird der Anschlag entfernt und der sich ergebende Sperrzone stellt eine Oberfläche zur Migration auftritt. Allerdings ist dieser Test schwierig gestalten oder anzupassen 10 und für einige Anwendungen kann diese Technik auch zu kostspielig. Im Gegensatz zu Kratzassays und deren Derivaten, trans-well Migrationsassays (oder Boyden-Kammer-Assays) beurteilt Migration durch Quantifizieren der Anzahl von Zellen, die von einer Kammer zu bewegen, durch eine mikroporöse Filtermembran, in eine Kammer, die chemotaktische Mittel 8,11, 12. Diese Technik hat einen Nutzen für adhärente Zellen, wie MSCs begrenzt, da nach der Migration durch die poröse Membran, Zellen haften an der Membranseite auf die chemotaktische Mittel ausgesetzt wird, und kann schwer genau zu quantifizieren. Während der Test ist in der Lage, einige dreidimensionale Migrationsmuster zu untersuchen, die eingeschränkten Zelltypen, für die sie in der Lage, genau zu quantifizieren Zellmigrationsgrenzwert seine Nützlichkeit ist 10. Eine weitere Alternative zur Kratzassays verwendet einen Mikrosäulenarray, das zelluläre Motilität durch einen dreidimensionalen Raum misst unter Verwendung der Fähigkeit der Zellen, sich zu verformen und die Migration in das Array als Surrogat. Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomeren über einen präzisen Form gehärtet und mit Ozon behandelt und Fibronektin erzeugt ein homogenes und nicht-abbaubare Mikroumgebung. Mikrosäulenabstand kann bei Bedarf auch um die Fähigkeit der Zellen, um das Array 4 geben abzuschätzen variiert werden. Die Form wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung von Siliziumwafern geschaffen, um eine negative Version des hohen Aspektverhältnisses Array 13 zu schaffen. Während der Assay wird durch seine Anpassbarkeit verstärkt, um die Fähigkeit dreidimensionalen Migration, und die Analyse durch die direkte Visualisierung von wandernden Zellen zu modellieren, die Schwierigkeit bei der Schaffung von Mikrosäulenanordnungen wirtschaftlich behindert ihre weitverbreitete Verwendung. Die in diesem Protokoll beschriebenen optimierte Kratz Assay stellt ein effizientes, cost günstiges Verfahren zum Erzeugen konsistenter Kratzer, die durch frei verfügbaren Software analysiert werden können. Statt einfacher Breite Messungen über die Kratz vor und nach der Zellmigration hergestellt, ermöglicht die Software dem Anwender insgesamt kratz Bereiche vor und nach der Migration zu ermitteln. Dieser Fortschritt schränkt das Problem zu versuchen, festzustellen, wo die Kratz die Breitenmessungen sollten getroffen werden, und ob die Breite des Kratz einheitlich entlang ihrer Gesamtlänge. Außerdem ist eine sorgfältige Optimierung der Zellzahlen, die Zellkonfluenz und der Art und dem Grad der Beschädigung an den Zellen zugefügt, um eine weitere Optimierung der Assay erörtert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Die Scratch-Assays hier präsentierten Objekte wurden durchgeführt unter Verwendung von Mäuselunge Wohnsitz mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) und isoliert, wie in den Protokollnotizen verwiesen. Die LR-MSCs wurden in einer Dichte von 500.000 Zellen in einer 60 mm-Gewebekulturschale ausgesät und bis 90% Konfluenz in 48 h gezüchtet. Um Schäden zu generieren, wurde 4% CSE (oben beschrieben) mit den Zellen 24 h nach der ersten Aussaat Periode, aber vor dem Kratzer Assay inkubiert. Für jeden Test wurde die Kratz mit ...

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.8K Aufrufe.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Serie: Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Eine Vorrichtung zur Durchführung Zellmigration / Wundheilung in einer 96-Well-Platte

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...