Dieses Protokoll ermöglicht die In-vitro-Kultivierung und direkte mikroskopische Visualisierung des isolierten Atemwegsgewebes während verschiedener Gewebemanipulationsverfahren wie Entepithelisierung und Regeneration des Atemwegsgewebes. Die in dieser Studie vorgeschlagene In-situ-Bildgebung ermöglicht eine schnelle und zerstörungsfreie Überwachung des Tracheallumens während der bildgebungsgeführten kontrollierten Entfernung des endogenen Epithels und der Abgabe der exogenen Zellen. Die bildgebungsgeführte bioreaktive Plattform und die Gewebemanipulationsprotokolle können verwendet werden, um biotechnologisches Atemwegsgewebe für die Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening zu erzeugen.
Der Aufbau und die Verwendung des bildgebenden Atemwegsgewebe-Bioreaktors werden von zwei Doktoranden aus unserer Forschungsgruppe, Mohammad Mir, und Jiawen Chen demonstriert. Um mit der Erstellung eines In-situ-Bildgebungsgeräts zu beginnen, setzen Sie eine Röhrenlinse in ein stapelbares Linsenrohr ein und sichern Sie es mit einem Haltering. Montieren Sie dann die Objektivtischbaugruppe über einen C-Mount-Adapter auf einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera.
Verwenden Sie die Micromanager-Software, um die Kamera zu bedienen und Fotos und Videos aufzunehmen. Während Sie auf ein Objekt abzielen, das sich 10 Meter von der Kamera entfernt befindet, passen Sie den Abstand zwischen dem Röhrenobjektiv und dem Bildsensor der Kamera an, bis ein fokussiertes Bild des Objekts auf dem Computerbildschirm gebildet wird. Als nächstes verwenden Sie optische Käfigsystemkomponenten wie Montagestange, Gewindekäfigplatte und Käfigwürfel, um eine Filterlinse auf einem zweischneidigen, hochauflösenden, dichroitischen Spiegel und einem Laser am Gerät zu montieren.
Schließen Sie ein 20-faches Objektiv an das Gerät an. Montieren Sie dann eine grüne Linse mit einem Durchmesser von 500 Mikrometern am distalen Ende der Linsenröhre über den X-Y-Übersetzer. Passen Sie den Abstand zwischen den grünen und den Objektivlinsen an, um die fokussierten mikroskopischen Bilder zu bilden.
Um das isolierte Trachea-Lumen der Ratte im hellen Feld oder fluoreszierenden Bereich sichtbar zu machen, platzieren Sie den Bioreaktor auf der Bildgebungsstufe. Als nächstes infundieren Sie 500 Mikroliter der frisch zubereiteten Carboxyfluorescein-Succinimidylester oder CFSE-Lösung mit einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute durch die Luftröhre über die Spritzenpumpe, die mit dem Schlauch der Luftröhrenkanüle verbunden ist. Sobald die CFSE-Lösung die Luftröhre gefüllt hat, stoppen Sie die Pumpe.
Nach 10 Minuten waschen Sie das Luftröhrenlumen, indem Sie 10 Milliliter PBS mit der Spritzenpumpe infundieren, um die verbleibenden nicht eingearbeiteten CFSE-Reagenzien zu entfernen. Führen Sie nach dem Waschen das distale abbildende Ende der grünen Linse über den Luer-Stecker, der an einem Ende der Luftröhre befestigt ist, in die Luftröhre ein. Bewegen Sie dann vorsichtig die grüne Linse in der Luftröhre, bis die Luftröhrenoberfläche fokussiert ist.
Um die Hellfeldbilder in der Mikromanager-Software aufzunehmen, beleuchten Sie das Luftröhrenlumen mit weißem Licht durch den Käfigwürfel. Klicken Sie dann auf das Live-Symbol, um die Lumenoberfläche der Luftröhre in Echtzeit anzuzeigen. Verwenden Sie die Registerkarten "Bildgebung" und "Belichtung", um die Belichtungszeit auf den gewünschten Wert zu ändern.
Um den Kontrast und die Helligkeit von Bildern anzupassen, verwenden Sie das Histogramm- und Intensitätsskalierungsfenster, um Schwarz-Weiß-Pfeile am Endpunkt der interaktiven Histogrammanzeige zu verschieben. Klicken Sie auf Stop Live, um das Snap-Symbol zu aktivieren, und klicken Sie dann auf das Snap-Symbol, um das Bild einzufrieren. Verwenden Sie als Nächstes die Einstellung Exportieren und dann Bilder als verschobene Registerkarten, um die Bilder im gewünschten Format zu speichern.
Um Fotos und Videos in einem fluoreszierenden Modus zu erhalten, beleuchten Sie das Luftröhrenlumen mit CFSE-spezifischem Laserlicht durch den Käfigwürfel und erfassen Sie die Bilder in Echtzeit, indem Sie die abbildende Sonde hin und her bewegen. Sobald die Fotos und Videos erhalten sind, entfernen Sie vorsichtig die grüne Linse von der Luftröhre. Für die Entepithelialisierung der Luftröhre werden 50 Mikroliter des frisch hergestellten 2%igen Natriumdodecylsulfats durch die Luftröhrenkanüle eingeträufelt, um einen dünnen Film der Waschmittellösung auf dem Luftröhrenlumen zu erzeugen.
Schließen Sie nach der Instillation die Rohrverbindungen des Bioreaktors mit männlichen oder weiblichen Luer-Steckern und überführen Sie den Bioreaktor für 10 Minuten in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator, damit das SDB in der Luftröhre verweilen kann. Wiederholen Sie die Instillation einmal. Nach der zweiten Instillation entfernen Sie das lysierte Epithel und SDS, indem Sie das Luftröhrenlumen dreimal mit 500 Mikrolitern PBS über eine Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 10 Millilitern pro Minute bewässern.
Legen Sie dann den Bioreaktor auf einen Shaker, um mechanisch mit einer Frequenz von 20 Hertz und einer Verschiebungsamplitude von 0,3 Millimetern zu vibrieren, um die Ablösung von SDS-behandelten Epithelzellen vom Luftröhrenlumen physikalisch zu fördern. Während die Luftröhre mechanisch vibriert wird, instillieren Sie 500 Mikroliter PBS zweimal durch das Luftröhrenlumen, um die verbleibenden SDS- und Zelltrümmer zu entfernen. Nach der Epithelentfernung bewerten Sie die Clearance der Epithelschicht, indem Sie die Intensität der CFSE mit dem Bildgebungsgerät für grüne Linsen messen.
Nach der Vorbereitung einer entepithelialisierten Rattenluftröhre tauen gefrorene mesenchymale Stammzellen oder MSCs 30 Sekunden lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer, gefolgt von der Herstellung einer Zelllösung mit einer Konzentration von fünf mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter. Beschriften Sie dann die Zellen fluoreszierend, indem Sie sie mit zwei Millilitern 100-mikromolärer CFSE-Lösung bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach 15 Minuten spülen Sie die Zellen dreimal mit fünf Millilitern PBS aus, bevor Sie sie in einem frischen DMEM-Kulturmedium in einer Endkonzentration von dreimal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter zurücksetzen. Unmittelbar nach der Herstellung von Kollagen I Hydrogel, wie im Manuskript beschrieben, fügen Sie die Zellen der Hydrogellösung mit der gewünschten Konzentration hinzu. Mischen Sie dann die Zellen und die Gellösung mit einer Mikropipette, um eine gleichmäßige Zell-Hydrogel-Mischung zu erhalten.
Als nächstes befestigen Sie ein Ende der Luftröhre innerhalb des Bioreaktors an einer programmierbaren Spritzenpumpe durch einen Luer-Stecker und liefern fünf Milliliter frisches Kulturmedium bei 37 Grad Celsius in die Bioreaktorkammer, um die Außenfläche der Luftröhre abzudecken. Verabreichen Sie dann 10 Mikroliter Bolus des Zell-Hydrogel-Gemisches in die entepithelialisierte Luftröhre innerhalb des Bioreaktors, um eine Zell-Hydrogel-Schicht auf dem Luftröhrenlumen zu erzeugen. Stellen Sie den Bioreaktor nach der Zellinjektion in einen sterilen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zur Gegelierung für 30 Minuten, um eine Geigung zu ermöglichen.
Um die Verteilung der implantierten Zellen zu visualisieren, sterilisieren Sie die grüne Linse mit 70% Isopropylalkohol oder Ethanol und stellen Sie den Bioreaktor auf die Bildgebungsstufe, um die Fotos und Videos sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzmodus zu erhalten. Nach 30 Minuten Zellaussaat einen Milliliter Kulturmedium mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute in das Luftröhrenlumen infundieren. Zum Schluss wird die zellgesäte Luftröhre im Bioreaktor in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit kultiviert.
Halten Sie während der Zellkultur die Medien im Lumen statisch, während Medien außerhalb der Luftröhre kontinuierlich über einen unidirektionalen Fluss durchblutet werden. In den Hellfeld- und Fluoreszenzbildern der entepithelialisierten Luftröhre wurde vor der CFSE-Markierung kein fluoreszierendes Signal beobachtet. Mit dem CFSE wurde ein gleichmäßiges Fluoreszenzsignal im gesamten Epithel beobachtet.
Nach der Deepithelialisierung wurde die Fluoreszenzintensität signifikant verringert, was auf eine Ablation des Epithels hinweist. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung der entepithelialisierten Luftröhre veranschaulichte die Entfernung des pseudostratifizierten Epithels aus dem Luftröhrenlumen und die Erhaltung von Zellen und extrazellulärer Matrix oder ECM-Mikrostrukturen in darunter liegenden Gewebeschichten. Darüber hinaus bestätigte die Pentachrom- und Trichromfärbung die Aufrechterhaltung der Luftröhrengewebearchitektur und der ECM-Komponenten wie Kollagen und Proteoglykane.
Die Immunfluoreszenz von Epithelzellen und Kollagen I zeigte eine vollständige Entfernung des Epithels und die Erhaltung von Kollagen I im subepithelialen Gewebe. Die Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die native Luftröhre mit multizillierten und kelchigen Zellen bevölkert war. In der entepithelialisierten Luftröhre wurde die Basalmembran freigelegt, wie ein Netznetzwerk aus extrazellulären Matrixfasern und das Fehlen von Epithelzellen zeigen.
Die Fluoreszenzbilder der entepithelialisierten Luftröhre bei der Aussaat mit PBS und Kollagen sind hier dargestellt. Im Vergleich zu den Zellen, die über Kulturmedium ausgesät wurden, blieben die fluoreszierend markierten Zellen, die über Hydrogel geliefert wurden, gleichmäßiger über das Lumen haften. Die Zelllebensfähigkeitsstudie zeigte, dass die Lebensfähigkeit durch das Zellabgabeverfahren nicht beeinträchtigt wurde und über 90% der Zellen lebensfähig blieben.
Die Bildung eines dünnen Waschmittelfilms im Entepithelisierungsprozess und die Verwendung von Hydrogel als Trägervehikel für Zellen sind wesentliche Schritte für den Erfolg dieses Protokolls. Unser nächstes Forschungsziel ist es, im Labor gezüchtete Primär- oder Stammzellen der Atemwege auf das entepithelialisierte Atemwegsgewebe zu implantieren, um zu untersuchen, ob funktionelles Atemwegsgewebe vorbereitet werden kann.
