Die Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen in apoE und anderen Arten von hyperlipidämischen Mäusen ist der Schlüssel zur Beurteilung verschiedener genetischer Faktoren und neuer Therapien. Unser Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Analyse der atherosklerotischen Belastung in qualitativer und quantitativer Weise in einer einzigen Maus. 16 Wochen nach der Induktion von Atherosklerose, bevor Sie das Herz durchbluten, laden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit 10 Millilitern DPBS und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel.
Heben Sie die Bauchhaut der experimentellen Maus mit einer Pinzette an und schneiden Sie mit einer feinen Schere die Haut von der Bauchbasis bis zur Halsspitze. Öffnen Sie die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs und heben Sie mit der Pinzette das Brustbein an, um Zugang zum Zwerchfell zu erhalten. Schneiden Sie die Membran ab und schneiden Sie den Brustkorb weg, um die Brusthöhle freizulegen.
Als nächstes machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof des Herzens und injizieren Sie langsam das gesamte Volumen von DPBS in die apikale linke ventrikuläre Punktion. Die Leber und die Niere färben sich hellbraun. Wenn die gesamte Kochsalzlösung durchblutet wurde, verwenden Sie einen Vliesschwamm, um die Brusthöhle von Fremdblut und -flüssigkeit zu reinigen.
Nachdem die Brusthöhle abgewischt wurde, entfernen Sie die nicht-experimentellen Organe und schneiden Sie das Schlüsselbein mit einer Pinzette und einer feinen Schere ab. Legen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie die Pinzette und die Federschere, um die Aorta zu sezieren. Wenn die Aorta isoliert wurde, bedecken Sie das Gewebe mit einem salzhaltigen Vliesschwamm und sezieren Sie die Aortenzweige, einschließlich der brachiozephalen, Carotis-, Subclavien-, Nieren-, Becken- und Oberschenkelarterien.
Wenn alle Arterien, die sich von der Aorta verzweigen, isoliert wurden, verwenden Sie eine Pinzette und eine Federschere, um das zufällige Fett- und Bindegewebe um die Aorta- und Aortenäste herum sorgfältig zu sezieren und zu entfernen. Eine erfolgreiche Isolierung von Aorta und Aortenzweigen erfordert Übung und Geduld. Um den Gefäßbaum zu fixieren, laden Sie zuerst eine 10-Milliliter-Spritze mit 4% Formaldehyd in 1X DPBS und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel.
Denken Sie daran, immer 4% Formaldehyd in einem Abzug zuzubereiten. Führen Sie die Nadel in die apikale linksventrikuläre Punktion ein und injizieren Sie langsam das gesamte Volumen des Fixiermittels. Reinigen Sie die Brusthöhle von Fremdflüssigkeiten mit einem Vliesschwamm wie demonstriert und verwenden Sie eine Pinzette und eine Mikrosezierungs-Federschere, um das Herz von der Aorta zu trennen.
Wenn die Gewebe getrennt wurden, isolieren und entfernen Sie die Aorta und ihr Hauptgefäß von einem Millimeter über der Halsschlagader bis zum Ende der Oberschenkelarterie und legen Sie das Gefäß in einen Behälter aus DPBS. Für die Öl-Rot-O-Färbung der ungeöffneten ganzen Aorta verwenden Sie Minutien-Stifte, um das Gefäß auf einer Wachs-Petrischale zu befestigen und das Gefäß mit frischem DPBS abzuspülen. Gießen Sie 25 Milliliter frische 0,45 Mikrometer porengefilterte Oil Red O-Lösung in die Schale für einen 60-minütigen Fleck bei Raumtemperatur.
Tauchen Sie das Gewebe mit 60% Isopropanol für eine 20-minütige Wäsche bei Raumtemperatur ein. Am Ende der Inkubation spülen Sie das Gefäß dreimal mit frischem destilliertem Wasser für fünf Minuten pro Waschgang aus und stellen Sie das Gericht unter das Seziermikroskop. Verwenden Sie eine Pinzette und eine Federschere zum sanften Reinigen des gesamten perivaskulären Fettgewebes um die Aorta herum, um eine falsche Färbung von Oil Red O zu vermeiden, und übertragen Sie das Gefäß auf einen sauberen Glasmikroskop-Objektträger.
Oil Red O markiert die lipidreiche Plaque rot, so dass die nicht plaquehaltigen Bereiche blass sind. Erfassen Sie dann digitale hochauflösende Mikroaufnahmen mit einem Lichtmikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist, und speichern Sie die Bilder vorzugsweise im getaggten Bilddateiformat. Zur gegenüberliegenden Montage der Aortengewebeprobe das Gefäß in eine Wachs-Petrischale geben und das Gewebe mit frischem DPBS bedecken.
Durchtrennen Sie die Halsschlagadern und Subclaviararterien des Aortenbogens und der Beckenarterien in der Bauchaorta ein bis zwei Millimeter nach den Bifurkationen. Durchtrennen Sie die Nierenarterien. Als nächstes verwenden Sie eine mikrosezierende Federschere, um die Aortenvorbereitung entlang der inneren Krümmung und der Beckenarterien längs zu öffnen und die drei Zweige des Aortenbogens entlang der größeren Krümmung bis zum Basisniveau der inneren Krümmung zu schneiden.
Verwenden Sie dann Minutien-Pins, um die Aorta flach gegen die Schale zu befestigen, ohne sich mit der Lumenseite nach oben zu dehnen, und bedecken Sie das Gewebe mit frischem DPBS. Im Vergleich zu Apolipoprotein E-Knockout-Mäusen zeigen die Aortenwände der glatten Muskelzelle TGF-beta-R2 Knockout-Apolipoprotein E-Mäuse eine schwere Atherosklerose, die es schwierig macht, die Läsionen zu sezieren. Zudem sind die Aneurysmen unterhalb der suprarenalen Aorta besonders ausgedehnt und erinnern stark an fortgeschrittene menschliche Aortenaneurysmen.
Hier ist ein repräsentatives Bild einer ungeöffneten Aorta von einer cholesterinreichen, fettreichen, mit Diät gefütterten TGF-beta-R2-Knockout-Apolipoprotein-E-Maus gezeigt, die mit Oil Red O gefärbt ist. Die Maus entwickelte sowohl ein aufsteigendes als auch ein abdominales Aortenaneurysma mit beschleunigter atherosklerotischer Läsionsbildung, die in den brachiocephalischen, Carotis-, Subclavium-, Becken-, Femoral- und Nierenarterien beobachtet wurde. Diese en face Oil Red O Färbung von TGF-beta-R2 Knockout Apolipoprotein E Mausgewebe zeigt eine schwere aneurysmatische Vergrößerung und deutliche Verlängerung der gesamten Aorta im Vergleich zur Apolipoprotein E Knockout Mausgruppe.
Es ist wichtig, in der Lage zu sein, mit Oil Red O gefärbte Plaques von falschem Hintergrund zu unterscheiden Oil Red O gefärbtes perivaskuläres Fettgewebe. Atherosklerose-Plaques sind dreidimensionale Phänomene. Nach der Quantifizierung der 2D-Läsion der Aorten im Gesicht empfehlen wir eine Plaque-Set-Analyse wie Aortenwurzeln und die Arteria brachiocephalica.
Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um zu entscheiden, ob ein bestimmter genetischer Faktor, eine Intervention oder eine Behandlung das Fortschreiten oder die Regression der Atherosklerose in diesen Modellen beeinflusst.
