The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.

1. placcatura le cellule CHO-ICAM Nota: Lo scopo di questa fase è quello piastra cellule CHO-ICAM nelle camere di flusso per la crescita notte con l&#39;obiettivo di generare un monostrato confluente. <ol><li> Mantenere le cellule CHO-ICAM a 10 cm di tessuto-coltura trattata piatti della cultura in 10 ml di mezzi RPMI con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (CHO-ICAM completa terreni di coltura) a 37 ° C con 5% CO 2. </li><li> Per raccogliere le cellule, aggiungere 1 ml di 0,5% tripsina-EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto agitando delicatamente. Neutralizzare la tripsina con 4 ml di media. </li><li> Contare le cellule CHO-ICAM utilizzando un emocitometro e calcolare 0.75 x 10 5 cellule per camera. Nota: In questo esperimento: saranno necessari 2,25 x 10 5 cellule per seminare 3 camere. </li><li> Centrifuga 0,75 x 10 5 cellule CHO-ICAM per camera per 5 minuti a 500 xg, a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in 30 ml per camera di CHO-ICAM Terreni di coltura completo. Nota: In questo esperimento saranno necessari 90 ml di sementi 3 camere. </li><li> Aggiungere lentamente le cellule in un serbatoio della camera di flusso. Permettono alle cellule di stabilirsi per 5 minuti nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2. </li><li> Aggiungere 200 ml di terreni di coltura completo tra i due serbatoi di ciascuna camera. aggiunte alternare tra i due per evitare il movimento delle cellule, come il sistema equilibra. </li><li> Incubare le cellule durante la notte all&#39;interno di un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule T Nota: Questo test può essere fatto con le cellule umane T primarie o una linea cellulare T. Un protocollo su isolamento delle cellule T da sangue è stato descritto in precedenza. 10 Se si utilizzano cellule T umane primarie utilizzano cellule appena isolate per i migliori risultati. Se si utilizza una linea cellulare T, seguire il protocollo coltura specificato dalla fonte delle cellule. Al fine di individuare le cellule su un microsco fluorescentepe le cellule T sono etichettati con carbossi estere succinimidyl fluoresceina (CFSE). <ol><li> Contare le cellule T utilizzando un emocitometro e calcolare 2 x 10 6 cellule per camera. Nota: In questo esperimento, saranno necessari 6 x 10 6 cellule per 3 camere. </li><li> Centrifugare 2 x 10 6 cellule per T camera per 5 min a 500 xg, a temperatura ambiente e risospendere le cellule in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) contenente 1% di glucosio o 2% FBS. </li><li> Aggiungere CFSE a 1: 1.000 diluizione (magazzino fatta a 5 mm). Coprire dalla luce e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente </li><li> Spin a 500 xg per 5 minuti, RT. </li><li> Risospendere il pellet cellulare con 240 pl per condizione (vedere il paragrafo 4 &quot;Note&quot;) di RPMI mezzi privi di siero. In questo esperimento, risospendere il pellet cellulare in 720 ml di pianura RPMI. Dividere le celle vuote in provette da 1,5 ml etichettate per ciascuna camera, 240 ml per provetta. Mantenere le cellule in un blocco C di calore 37 ° fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Impostazione °e Input / Output condutture e pompa a siringa <ol><li> Riscaldare il microscopio dal vivo camera di imaging a 37 ° C. </li><li> Preparare il tubazioni di ingresso: <ol><li> Riempire una bottiglia di vetro da 500 ml con acqua e fare 2 fori nel coperchio. Etichettare i fori &quot;in&quot; e &quot;out&quot;. Questo fungerà da un bagno di acqua di riscaldamento per i mezzi di ingresso. </li><li> Eseguire l&#39;ingresso getti attraverso i fori del coperchio e nel bagno d&#39;acqua. Assicurarsi che il lato della tubazioni che collega alla siringa passa attraverso il &quot;in&quot; foro e la parte che si collega al serbatoio di ingresso passa attraverso il &quot;out&quot; buco. </li><li> Lavare l&#39;ingresso getti con 60 ml di acqua per rimuovere l&#39;aria dal sistema. </li><li> Primo l&#39;ingresso getti con i media RPMI privo di siero riscaldato a 37 ° C. Riempire una siringa da 60 ml e spingere attraverso i media fino a quando il tubazioni è completamente innescato e privo di eventuali bolle d&#39;aria. Nota: A seconda del length di tubo utilizzato il volume richiesto per primo varierà. <ol><li> Calcolare il volume del supporto necessari per l&#39;esperimento moltiplicando la velocità del flusso (qui 0,3 ml / min) per il numero di minuti (5 min) per il numero di camere nell&#39;esperimento (qui 3); in questo esperimento, utilizzare 4,5 ml media. Nota: Si consiglia con 5 ml di volume extra (qui per un totale di 9,5 ml) rimanendo nella siringa dopo aver riempito. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;intera impostazione di ingresso nel recinto di immagini dal vivo del microscopio per mantenere 37 ° C. Eseguire il tubazioni e la siringa fuori del recinto e caricare la siringa nella pompa a siringa. </li></ol></li><li> Preparare il tubazioni di uscita: <ol><li> Effettuare un foro nel coperchio di una bottiglia da 250 ml da utilizzare come rifiuti uscita. </li><li> Eseguire il tubo di uscita attraverso il foro e nella bottiglia. Liberamente fissare il coperchio, non chiudere tutta la strada. </li><li> Posizionare la messa a punto di uscita nel recinto di immagini dal vivo del microscope. </li></ol></li><li> Calcolare la portata (ml / min) necessario per generare la tensione di taglio desiderata (dyn / cm 2). Lo sforzo di taglio varia nei diversi compartimenti vascolari, quindi prendere in considerazione il modello globale che comprende tipi di cellule da studiare e trattamenti momento di decidere su un livello di stress di taglio. Nota: Questi esperimenti sono condotti a 0,4 dine / cm 2 per imitare da vicino un piccolo ambiente vena. <ol><li> Prendere le dimensioni della camera in considerazione nel calcolo sforzo di taglio. Utilizzare la seguente formula (fornita dal produttore 11) per le camere a flusso usati qui (vedi Tabella dei Materiali): T = η * 176,1 * ø dove lo stress T = taglio, η = viscosità dinamica, ø = portata. Nota: La viscosità dinamica dei media RPMI a 37 ° C è 0.007. </li></ol></li></ol> 4. Caricamento delle Camere di flusso e stimolazione delle cellule Nota: Al fine di avviare l&#39;adesione,Le cellule T devono essere stimolati. Nel seguente esperimento le cellule o rimanere non stimolata o vengono stimolati con SDF-1α 12 o acetato forbolo miristato (PMA; controllo positivo) 13. Per una corretta presentazione delle chemochine a cellule T, cellule CHO-ICAM sono preincubate con SDF-1α (seguito da lavaggi di serie), che consente per la presentazione sulla superficie cellulare. PMA è un estere del forbolo che è strutturalmente simile al secondo messaggero diacil glicerolo (DAG); qui viene utilizzato come controllo positivo. Le cellule T sono direttamente trattati con PMA prima del caricamento nella camera di flusso. <ol><li> Posizionare il vetrino camera di flusso sul microscopio e impostare il piano focale sul monostrato CHO-ICAM con l&#39;obiettivo 20X. </li><li> Mantenere le cellule T CFSE-colorate per tutte le altre condizioni del blocco C di calore 37 °. Preparare le cellule CHO-ICAM o T come segue immediatamente prima del test per la condizione: <ol><li> Per la condizione non stimolato (camera 1), tenere un tubo / ch flussoambra non trattata, per servire come controllo negativo per la stimolazione. </li><li> Per la stimolazione PMA (camera 2), di stimolare un tubo di cellule T con PMA (10 ng / ml) per servire come controllo positivo; il trattamento subito prima di caricare in camera di flusso. </li><li> Per la stimolazione SDF-1α, (camera 3), stimolano la terza camera di flusso con SDF-1α (100 ng / ml) rimuovendo 70 microlitri alla volta 3 volte dal serbatoio superiore (serbatoio output) e quindi aggiungendo 70 ml di SDF -1α (100 ng / ml) nella (serbatoio ingresso) inferiore serbatoio. Incubare per 5 min. </li></ol></li><li> Rimuovere e gettare 70 microlitri alla volta 3 volte dal serbatoio di uscita di una camera. </li><li> Aggiungere 70 ml di sospensione pre-trattati (a seconda dei casi) delle cellule T nel serbatoio di ingresso 3 volte. Attendere 5 min per permettere alle cellule di muoversi dalla ingresso della camera ( &quot;In&quot;), e per raggiungere l&#39;uscita prossimale ( &quot;Out&quot;) della camera. </li><li> Durante questo tempo, immagine 5campi per le cellule T CFSE-macchiati. Scegliere campi che sono dispersi in tutto il centro della camera (Figura 1). Utilizzare le seguenti condizioni di eccitazione / emissione: eccitazione lunghezza d&#39;onda del laser: 488 nm; filtro di raccolta di emissione: 500 - 540 nm. Queste immagini serviranno come i conteggi delle cellule pre-flow. </li><li> Collegare il tubo di ingresso e uscita contemporaneamente ai serbatoi camera di flusso. Nota: fissaggio della tubazione contemporaneamente è critico in modo da non introdurre bolle d&#39;aria nella camera e mantenere equilibrio globale entro la camera. </li><li> Inizia flusso a 0,3 ml / min (0,4 dine / cm 2), mentre la visualizzazione delle cellule T CFSE-macchiati. Come flusso comincia, soprattutto con la prima camera, vi è spesso un ritardo tra l&#39;avvio del flusso e osservando rotolamento delle cellule T, quindi iniziare a cronometrare 5 min all&#39;inizio del movimento delle cellule T. </li><li> Termina flusso dopo 5 min, e di immagine 5 campi nel canale CFSE. Scegli campi dispersi casualmente throughout centro della camera di flusso (Figura 1). Queste immagini serviranno come i conteggi delle cellule post-flow. </li></ol> 5. determinazione della percentuale di cellule aderenti Nota: Determinazione del numero delle cellule nelle immagini acquisite avviene oggettivamente con software automatizzato. Per i nostri studi abbiamo utilizzato il software Volocity (versione 6.2.1), ma altri software come ImageJ (versione 1.48V) sono applicabili anche. <ol><li> Determinare il numero di cellule per campo pre-flusso per ogni condizione. La media dei 5 campi è il &quot;numero di celle media pre-flow.&quot; 7 </li><li> Determinare il numero di cellule per campo post-flusso per ogni condizione. La media dei 5 campi è il &quot;numero di celle media post-flow.&quot; 7 </li><li> Calcolare la percentuale di cellule aderenti utilizzando la seguente formula: Percentuale di cellule aderenti = (post-flow conteggio medio delle celle) / (numero di cellule media pre-flow) x 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking.">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li><li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. 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(88), (2014).</li><li>Ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+shear+rates+for+ibidi+&#956;-Slides+-+based+on+numerical+calculations.">Shear stress and shear rates for ibidi &#956;-Slides - based on numerical calculations.</a> Application Note 11. , (2014).</li><li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts,+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration.">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li><li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1.">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li><li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability.">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li><li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells.">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1:+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion.">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Per analizzare correttamente l&#39;adesione delle cellule T, lo stimolante da includere nello studio deve essere considerato nella scelta di un metodo in vitro. Mentre ci sono diversi metodi per studiare i segnali che portano a LFA-1 attivazione e ICAM-1 vincolante tutti i metodi non sono intercambiabili. Un test di adesione statica 10 è più adatto per studiare le interazioni delle cellule T-APC; In alternativa, il metodo descritto qui sforzo di taglio è ideale per modellare cellule epiteliali int...

T adesione dei linfociti media una serie di processi distinti in un sistema immunitario sano, 3 giocare un ruolo critico nel traffico delle cellule T e presentazione dell&#39;antigene. Sia durante la sorveglianza immunitaria o una risposta immunitaria attiva queste due grandi ruoli per l&#39;adesione sono fondamentali. 4 Gli eventi di segnalazione fisiologiche di cellule endoteliali interazioni delle cellule T sono distinti da cellule T che presentano l&#39;antigene delle cellule (APC) interazioni, e quindi richiedono metodi distinti di studio per comprendere meglio le cascate di segnalazione coinvolte. La ferma adesione di una cellula T a una parete del vaso sanguigno durante linfociti stravaso richiede l&#39;attivazione rapida e dinamica integrina. La stretta interazione tra uno stato attivo integrine e di adesione molecole lungo l&#39;endotelio conduce alla resistenza al flusso di sangue adesione, consentendo alle cellule T per strisciare lungo la superficie alla ricerca di un&#39;area permissivo per il passaggio delle cellule. 5 La scansione di un bi cellule T -directionally alonga parete dei vasi sanguigni è legato alla adesione polarizzato, con una distinta adesiva estremità anteriore della cellula T. 6 Soprattutto, ferma adesione e la trasmigrazione richiedono resistenza alla forza di taglio generata dal flusso di sangue circolante. Durante la progettazione di esperimenti per studiare l&#39;adesione dei linfociti, occorre prestare attenzione allo stimolo specifico di interesse. Mentre integrina attivazione è un componente comune e critica di tutte le forme di adesione cellulare T, le cascate di attivazione sono suscettibili di essere unico valle dei singoli recettori e corecettori. Allo stesso modo, le coppie integrina e molecola di adesione funzionano in microambienti specializzate e su sottopopolazioni specifiche. In questo modo, queste coppie possono essere regolati in modo diverso. Il modello qui presentato è l&#39;ideale per lo studio delle cascate di segnalazione che portano alla integrina attivazione che si svolgono in condizioni di stress di taglio. 7 Queste interazioni non può essere adeguatamente compreso in un Pellicole staticail sistema a causa dell&#39;impatto hanno dimostrato queste forze di avere direttamente sul comportamento delle cellule T. 8 Anche qui presentata con le cellule T e le cellule CHO (ovaio di criceto cinese) ingegnerizzate per esprimere (cellule CHO-ICAM) umana ICAM-1, il sistema può essere facilmente modificato per studiare diverse popolazioni dei leucociti o molecole di adesione. Questa analisi fornisce un metodo per quantificare l&#39;adesività delle cellule T e l&#39;attivazione delle integrine con sforzo di taglio, fornendo un modello per lo stadio ferma adesione dei leucociti stravaso. Attraverso l&#39;uso di cellule CHO-ICAM l&#39;affinità di LFA-1 per il suo ligando in cellule vive può essere esaminata in tempo reale in risposta a vari stimoli di interesse. Questa tecnica richiede facilmente ottenuta, disponibili in commercio camere di micro-flusso in combinazione con una pompa a siringa, semplificando notevolmente l&#39;attrezzatura necessaria per modellare il flusso sanguigno e sollecitazione di taglio rispetto ad altri modelli. 9 Un altro importante vantaggio di questo saggio è che la segnalazione specificacascate e lo stato di attivazione risultante singoli integrine possono essere pulito studiate attraverso l&#39;uso di cellule CHO ingegnerizzate esprimono molecole di adesione umani di interesse. Inoltre, la combinazione di dati quantitativi con cellule vive è un significativo vantaggio di questo metodo. Nel complesso, mentre sono stati descritti una serie di saggi di adesione cellulare T statica che ben modellare le interazioni delle cellule T-APC, questi modelli non sono sufficienti a catturare il processo dinamico di adesione delle cellule epiteliali-T. Per questo motivo, quando si sceglie un saggio di adesione deve essere considerato lo stimolo in questione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">T cell samples (cell line or primary)</td>
			<td style="width:269px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-152</td>
			<td style="width:248px;">Peripheral human T cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHO-ICAM-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#181;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone tubing 0.8 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope with incubator chamber</td>
			<td>Ziess</td>
			<td style="width:119px;">700</td>
			<td>Any wide field fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td style="width:119px;">NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:119px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDF-1&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">350-NS-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16561-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Volocity software</td>
			<td style="width:269px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:269px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.48V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay of adhesion under shear stress for the study of t lymphocyte-adhesion molecule interactions

Nel complesso, l&#39;adesione cellulare T è un componente critico della funzione, contribuire ai processi distinti di assunzione cellulare per siti di infiammazione e di interazione con cellule presentanti l&#39;antigene (APC) nella formazione di sinapsi immunologica. Questi due contesti di adesione delle cellule T si differenziano che T interazioni cellula-APC può essere considerato statico, mentre le interazioni dei vasi cellule T del sangue sono sfidati dal shear stress generato da circolazione stessa. interazioni cellule T-APC sono classificati come statico dal fatto che i due partner cellulari sono relative statico a vicenda. Solitamente, questa interazione avviene nei linfonodi. Come una cellula T interagisce con la parete dei vasi sanguigni, le cellule arrestano e devono resistere alla sollecitazione di taglio generate. 1,2 Queste differenze evidenziano la necessità di comprendere meglio l&#39;adesione statica e aderenza in condizioni di flusso come due processi normativi distinti. Il regolamento di adesione delle cellule T possono essere più succintamente descritta come contraina stato affinità delle integrine molecole espresse sulla superficie cellulare, e regolando così l&#39;interazione delle integrine con leganti molecola di adesione espresse sulla superficie della cellula interagenti. La nostra attuale comprensione del regolamento di integrine stati affinità viene dal spesso semplicistico nei sistemi modello in vitro. Il saggio di adesione con condizioni di flusso qui descritte permette la visualizzazione e la quantificazione precisa delle cellule epiteliali interazioni delle cellule T in tempo reale dopo uno stimolo. Un&#39;adesione sotto test flusso può essere applicata a studi di aderenza segnalazione all&#39;interno delle cellule T dopo il trattamento con sostanze inibenti o stimolatori. Inoltre, questo test può essere espansa al di là di segnalazione delle cellule T a qualsiasi popolazione adesiva leucociti e qualsiasi coppia molecola di integrina-adesione.

Risultati rappresentativi sono mostrati dal saggio di adesione flusso utilizzando Jurkat e cellule T CD3 umani primari, come indicato, stimolate con SDF-1α. I controlli negativi in ​​tutti gli esperimenti riportati sono cellule non stimolate. Una adesione soglia basale percentuale di cellule non stimolate è compresa tra 5 - 10%; Adesione bassa in particolare al di sopra di questo intervallo indica un esperimento problematico e suggerisce la popolazione inizio di cellule ...

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Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L&#39;obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l&#39;adesione delle cellule T con condizioni di flusso.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.4K Views.  New York University School of Medicine.  Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso. 

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...