The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.

1. 도금 CHO-ICAM 세포 주 :이 단계의 목적은 합류 단층을 생성하는 것을 목표로 밤새 성장 유동 챔버의 CHO-ICAM 세포 플레이트이다. <ol><li> 5 %, 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (CHO-ICAM 완전 배지)로 보충 된 10 ml의 RPMI 배지에서 10cm 조직 배양 처리 된 배양 접시에서 CHO-ICAM 세포 유지 CO 2. </li><li> 세포를 수집하기 위해, 1 ml의 0.5 % 트립신 EDTA를 추가하고 온화한 진탕 1 분 동안 실온에서 배양한다. 미디어의 4 ml의 트립신을 중화. </li><li> hemacytometer를 사용하여 CHO-ICAM 세포를 계산하고 챔버 당 0.75 × 10 5 세포를 계산합니다. 참고 :이 실험에서 : 2.25 × 10 5 세포 3 실 시드 필요합니다. </li><li> 원심 0.75 × 105 CHO-ICAM의 500 XG, 실온에서 5 분 동안 실 당 세포 및 CHO의 챔버 당 30 μL의 세포 펠렛을 재현 탁-ICAM 전체 문화 미디어. 참고 :이 실험에서는 90 μl의 3 챔버 시드 필요합니다. </li><li> 천천히 유량 용기의 한 저수지로 세포를 추가합니다. 세포가 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 5 분 동안 정착하도록 허용합니다. </li><li> 각 실의 두 저수지에 걸쳐 완전한 배양 배지 200 μl를 추가합니다. 시스템이 평형화 같이 둘 사이의 추가는 다른 세포의 이동을 방지한다. </li><li> 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기 내에서 하룻밤 세포를 품어. </li></ol> T 세포의 제조 2 주 :이 분석은 일차 인간 T 세포 또는 T 세포 라인으로 수행 될 수있다. 혈액 T 세포의 분리에 대한 프로토콜은 이전에 설명되었다.하여 10 일차 인간 T 세포가 최상의 결과를 새롭게 분리 된 세포를 사용하는 경우. T 세포 라인을 사용하는 경우, 셀의 소스에 의해 지정된 배양 프로토콜을 따른다. 형광 microsco에 세포를 검출하기 위해T 세포가 카복시 플루오 레세 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 표시되어 퍼가기. <ol><li> hemacytometer를 이용하여 T 세포를 세어 챔버 당 2 × 106 개 세포를 계산한다. 주 :이 실험에서는 6 × 106 세포를 3 챔버에 대해 필요하다. </li><li> 원심 분리 (2)는 T × 106 500 × g으로 실온에서 5 분 동안 세포 챔버 당 1 % 글루코스 또는 2 % FBS를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 1 ㎖의 세포 (PBS)에 재현 탁. </li><li> 1 CFSE 추가 : 1000 희석 (주 5 mm로했다). 빛 덮고 실온에서 8 분 동안 품어 </li><li> 5 분, RT 500 XG에 스핀. </li><li> 조건 당 240 μL에 재현 탁 세포 펠렛을 RPMI 미디어 부족 혈청 (4 절 &quot;주의&quot;를 참조하십시오). 이 실험에서는, 일반 RPMI 720 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 각 챔버, 튜브 당 240 ㎕의 표지 빈 1.5 ml의 튜브에 세포를 나눈다. 사용할 때까지 37 ° C 열 블록의 세포를 유지합니다. </li></ol> 3 일 설정전자 입력 / 출력 뿌리고과 주사기 펌프 <ol><li> 37 ° C에 현미경 라이브 영상 실을 따뜻하게. </li><li> 입력 뿌리고을 준비합니다 : <ol><li> 물 500㎖의 유리 병을 채우고 뚜껑으로이 구멍을 만든다. 그리고 &quot;의&quot;구멍 레이블을 &quot;알아.&quot; 이 입력 매체 가열 수조로서 작용한다. </li><li> 뚜껑과 수조 내로 관통 뿌리기 입력을 실행. &quot;출력&quot;구멍을 통해 제공되는 주사기에 연결 뿌리고의 측면 구멍 &quot;에서&quot;, 입력 저수지에 연결 측면을 통해 오는 있는지 확인합니다. </li><li> 시스템에서 모든 공기를 제거하기 위해 물 60 ㎖로 뿌리기 입력을 플래시합니다. </li><li> 프라임 RPMI 미디어 혈청 부족으로 뿌리기 입력은 37 ° C로 예열. 60 ML의 주사기를 입력하고 뿌리고 완전히 끝났다과 공기 방울을 결여 될 때까지 미디어를 통해 밀어 넣습니다. 참고 : lengt 기반으로 주사기 Z- 추적 injection.Size에 따라튜브의 시간은 달라질 수 소수에 필요한 볼륨을 사용했다. <ol><li> (여기서 3) 실험 챔버의 수에 의해 분 (5 분)의 개수에 의해 흐름 (여기에서는 0.3 ㎖ / 분)의 속도를 곱함으로써 실험에 필요한 매체의 부피를 계산하게하고; 이 실험에서, 4.5 ml의 용지를 사용합니다. 참고 : 우리는 프라이밍 후 주사기에 남아있는 (여기에 9.5 ㎖의 총) 5 ml의 여분의 체적을 갖는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 37 ° C를 유지하기 위해 현미경의 라이브 영상 인클로저에 전체 입력 설정을 놓습니다. 뿌리고을 실행하고 인클로저 밖으로 주사기와 주사기 펌프에 주사기를로드합니다. </li></ol></li><li> 출력 뿌리고을 준비합니다 : <ol><li> 출력 폐기물로 사용하는 250 ml의 병의 뚜껑에 구멍을 만듭니다. </li><li> 구멍을 통해 병에 출력 튜브를 실행합니다. 느슨하게 뚜껑을 고정하는 모든 방법을 폐쇄하지. </li><li> 마일의 라이브 영상 인클로저로 출력 설정을 배치croscope. </li></ol></li><li> 원하는 전단 응력 (DYN / cm 2)을 생성하기 위해 상기 유량 (ml / 분)에 필요한 계산. 전단 응력 따라서 계정으로 세포 연구 할 유형과 치료 전단 스트레스 수준 결정을 포함하여 전체 모델을, 다른 혈관 구획에 따라 다릅니다. 참고 :이 실험은 밀접하게 작은 정맥 설정을 모방하기 위해 0.4 DYN / cm 2에서 수행된다. <ol><li> 전단 응력을 계산할 때 고려 챔버의 크기를 가져 가라. 여기에 사용 된 흐름 챔버 용 (제조업 (11)에 의해 제공) 다음 공식을 사용 (재료의 표 참조) : T = η * 176.1 *의 ø는 T = 전단 응력, η = 동적 점도, ø는 = 유량 곳. 참고 : 37 ° C에서 RPMI 미디어의 동적 점도는 0.007이다. </li></ol></li></ol> 셀 흐름 챔버와 자극 4.로드 주 : 접착을 개시하기 위해,T 세포를 자극한다. 다음 실험에서 세포를 자극되지 남아 있거나 SDF-1α (12) 또는 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA, 양성 대조군)으로 자극 13. T 세포에 대한 케모카인의 적절한 프리젠 테이션을 위해, CHO-ICAM 세포는 세포 표면에 프레 수 (연속 세척 하였다) SDF-1α와 함께 예비 인큐베이션한다. PMA는 제 톡 디아 실 글리세롤 (DAG)와 구조적으로 유사한 포르 볼 에스테르; 여기로는 양성 대조군으로 사용된다. T 세포는 바로 전에 유동 챔버 내로 로딩하기 PMA로 처리된다. <ol><li> 현미경의 흐름 챔버 슬라이드를 놓고 20 배 목표를 사용하여 CHO-ICAM 단층에 초점면을 설정합니다. </li><li> 37 ° C 열 블록에있는 다른 모든 조건 CFSE - 스테인드 T 세포를 유지합니다. 그 조건에 대한 분석 직전에 다음과 같이 CHO-ICAM 또는 T 세포를 준비합니다 <ol><li> 비자극 조건 (챔버 (1))의 경우, 하나의 튜브 / 유동 채널을 유지치료 황색, 자극에 대한 부정적인 제어를 제공합니다. </li><li> PMA 자극 (챔버 (2))의 경우, 양성 대조군으로서 역할하는 PMA (10 NG / ㎖)와 T 세포를 자극 한 튜브; 유량 용기에 넣기 전에 즉시 처리합니다. </li><li> SDF-1α 자극 (챔버 (3))의 경우, 상부 리저버 (출력 저장조)에서 한 번에 3 회 70 μL를 제거하고 SDF의 70 μl를 첨가하여 SDF-1α (100 NG / ㎖)와 제 3 유동 챔버를 자극 -1α (100 NG / ㎖) 하부 통 (입력 저수지)로. 5 분 동안 품어. </li></ol></li><li> 하나의 챔버의 출력 저장소로부터 3 회 제거하고 시간에 70 μl를 버린다. </li><li> 입력 저수지로 3 회를 전처리 (해당되는 경우) T 세포 현탁액의 70 μl를 추가합니다. 세포가 챔버 ( &quot;에서&quot;)의 입구에서 이동할 수 있도록하기 위해 5 분을 기다린 챔버의 근위 출구 ( &quot;아웃&quot;)에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 이 시간 동안, 화상 (5)CFSE - 스테인드 T 세포에 대한 필드. 챔버 (그림 1)의 중심에 걸쳐 분산되어있는 필드를 선택합니다. 여기 레이저 파장 : 다음 여기 / 방출 488 nm의 조건으로 사용하는 단계; 발광 컬렉션 필터 : 500-540 나노. 이러한 이미지는 미리 유동 세포 수의 역할을한다. </li><li> 유량 용기 저수지에 동시에 입력 및 출력 튜브를 연결합니다. 주 : 챔버 내에 기포를 도입하여 챔버 내의 전체적인 균형을 유지하지 않도록 동시에 튜브를 부착하는 것은 매우 중요하다. </li><li> CFSE - 스테인드 T 세포를 시각화하는 동안 0.3 ml / 분 (0.4 DYN / cm 2)에서 흐름을 시작합니다. 흐름은, 특히 제 1 챔버와, 시작으로, 따라서 T 세포 이동의 개시 타이밍에서 5 분 시작 종종 유동을 시작 및 T 세포를 관찰 압연의 차이도있다. </li><li> 5 분 후, 흐름을 종료하고 CFSE 채널에서 이미지 필드 5. 무작위로 죽 분산 필드를 선택유동 챔버의 중심 ughout (도 1). 이러한 이미지는 이후 흐름 세포 수의 역할을 할 것이다. </li></ol> 5. 접착 세포의 비율을 결정 주 : 획득 된 영상에서 세포 수의 측정은 자동 소프트웨어 객관적으로 이루어진다. 우리의 연구에 우리는 ImageJ에 (버전 1.48V)와 같은 소프트웨어 Volocity (버전 6.2.1)하지만 다른 소프트웨어를 사용하여도 적용 할 수있다. <ol><li> 각 조건에 대한 필드 사전 흐름 당 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 &quot;프리 플로우 평균 세포 수&quot;입니다. (7) </li><li> 각 조건에 대한 필드 이후의 흐름에 따라 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 &quot;포스트 흐름 평균 세포 수&quot;입니다. (7) </li><li> 다음 수식을 사용하여 부착 된 세포의 비율을 계산 / (프리 플로우 평균 세포 수) = 부착 세포 (포스트 플로우 평균 세포 수)의 비율 × 100 %. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking.">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li><li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. 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(88), (2014).</li><li>Ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+shear+rates+for+ibidi+&#956;-Slides+-+based+on+numerical+calculations.">Shear stress and shear rates for ibidi &#956;-Slides - based on numerical calculations.</a> Application Note 11. , (2014).</li><li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts,+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration.">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li><li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1.">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li><li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability.">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li><li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells.">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1:+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion.">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

올바르게 T 세포 유착을 분석하기 위하여, 자극은 시험관 내 방법을 선택할 때 고려되어야 연구에 포함된다. LFA-1의 활성화 및 바인딩 ICAM-1에 이르는 신호를 연구하는 여러 가지 분석이 있지만 모든 방법이 서로 호환되지 않습니다. 정적 접착 분석 (10)는 최적의 T 세포 APC의 상호 작용을 연구하는 데 적합하다; 대안으로, 여기에 설명 된 전단 응력 방법은 T 세포 상피 세포의 상호 작?...

T 림프구 접착 성 T 세포 트래 피킹 및 항원 제시에 중요한 역할을 수행하는 3 건강한 면역 시스템의 고유 프로세스들을 중재한다. 면역 감시 또는 접착이 두 가지 역할이 중요한 활성 면역 반응 동안의 여부. 4 T 세포 - 내피 세포 상호 작용의 생리 학적 신호 이벤트 (APC) 상호 셀 제시 T 세포 항원을 구별하고, 따라서의 구분 방법을 필요 연구는 가장 관련된 신호 폭포를 이해합니다. 림프구 넘쳐 중에 혈관 벽에 대한 T 세포의 밀착성 신속한 동적 인테그린 활성화를 필요로한다. 내피 따라 액티브 상태 인테그린 접착 분자 간의 긴밀한 상호 작용은 T 세포가 세포 통로 허용 영역 검색에 표면을 따라 기어 있도록 혈류에 강한 접착력을 이끈다. 5 T 세포의 Bi 크롤링 -directionally 아론GA 혈관벽은 T 세포의 구별 접착제 선단부와 편광 접착시에 의존한다.도 6은 가장 중요한 것은, 밀착성 및 윤회 혈류 순환에 의해 발생되는 전단력에 대한 저항을 요구한다. 림프구 접착력을 연구하는 실험을 설계 할 때,주의가 관심있는 특정 자극에 지불해야한다. 인테그린 활성화하는 T 세포 유착 모든 형태의 일반적이고 중요한 요소이지만, 활성화 캐스케이드의 개별 수용체 공동 수용체의 하류 고유 할 가능성이있다. 마찬가지로, 인테그린 및 접착 분자 쌍은 전문 미세 환경에서 특정 소집단에 작동합니다. 이와 같이, 이러한 쌍은 매우 다르게 조절 될 수있다. 여기에 제시된 모델은 전단 응력 조건에서 발생하는 활성화를 인테그린에 이르는 폭포 신호의 연구에 이상적입니다. (7) 이러한 상호 작용이 적절히 정적 adhesi에서 이해 될 수 없다시스템에 의한 충격이 힘은 8 비록. T 세포의 행동을 직접 갖고 도시 한 인간 ICAM-1 (CHO-ICAM 세포)를 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포 및 CHO (중국 햄스터 난소) 세포 시스템을 수 여기서 제시 쉽게 백혈구 집단 또는 다른 부착 분자 연구를 수정할. 이 분석은, 백혈구의 혈관 외 유출의 밀착성 스테이지에 대한 모델을 제공하고, 전단 응력을 이용하여 T 세포의 접착 성 및 인테그린 활성화를 정량하는 방법을 제공한다. CHO-ICAM 세포를 이용하여 살아있는 세포에서의 리간드 LFA-1의 친화 관심 다양한 자극에 응답하여 실시간으로 검사 할 수있다. 이러한 기술은 용이하게 크게 다른 모델에 비해 혈류 및 전단 응력을 모델링하는 데 필요한 장비를 단순화 주사기 펌프를 조합하여 시판 미세 유동 챔버를 얻을 필요. (9) 상기 분석의 다른 주요 장점은 특정 시그널링 있다는캐스케이드 개별 인테그린의 결과 활성화 상태는 깨끗하게 관심 인간 부착 분자를 발현하는 CHO 세포 공학을 사용하여 조사 할 수있다. 또한, 생균 이미징 정량적 데이터의 조합이 방법의 중요한 장점이다. 정적 T 세포 부착 분석법 다수 좋게 T 세포 APC 상호 작용을 모델링하는 설명되었지만 전반적으로,이 모델은 T 세포의 상피 부착 동적 프로세스 포착이 불충분하다. 접착 시험을 선택할 때이 때문에, 당해 자극을 고려해야한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">T cell samples (cell line or primary)</td>
			<td style="width:269px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-152</td>
			<td style="width:248px;">Peripheral human T cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHO-ICAM-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#181;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml glass bottle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB800250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone tubing 0.8 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope with incubator chamber</td>
			<td>Ziess</td>
			<td style="width:119px;">700</td>
			<td>Any wide field fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td style="width:119px;">NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:119px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDF-1&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">350-NS-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16561-29-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Volocity software</td>
			<td style="width:269px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:269px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.48V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay of adhesion under shear stress for the study of t lymphocyte-adhesion molecule interactions

전반적으로, T 세포 유착, 면역 시냅스 형성 항원 제시 세포 (APC)와 상호 작용 및 염증 부위로 세포 모집 고유 프로세스에 기여 함수의 중요한 구성 요소이다. T 세포의 혈관 작용은 순환 자체에 의해 발생되는 전단 응력에 의해 도전하는 동안 T 세포 유착이 두 상황은 휴대 APC 상호 정적으로 간주 될 수있는 T 다르다. T 세포 APC 상호 작용은 두 개의 휴대 파트너가 서로 정적 상대적 점에서 정적으로 분류하고 있습니다. 일반적으로, 이러한 상호 작용이 임파절 내에서 발생한다. T 세포가 혈관의 벽과 상호 작용으로 세포를 구속하고 생성 된 전단 응력에 저항해야한다. -1,2- 이러한 차이는 더 두 가지 규정하는 처리와 유동 조건에서 고정 부착 및 접착 성 증진의 필요성을 강조. T 세포 접착의 조절이 가장 간결 단점이라고 할 수있다세포 표면에 발현 분자 인테그린과 상호 작용하여 세포의 표면에 발현되는 접착 분자 인테그린 리간드의 상호 작용을 조절하는 친 화성 상태 조업. 인테그린 선호도 상태의 규제의 우리의 현재 이해는 체외 모델 시스템에서 종종 단순한에서 온다. 접착 여기서 설명 유동 조건을 사용하여 분석하고 시각화 자극 다음 실시간 T 세포 상피 세포 상호 작용의 정확한 정량을 허용한다. 유동 검정 하에서 접착 저해 또는 자극 물질로 처리 다음 T 세포 내 시그널링 밀착성 시험에 적용될 수있다. 또한,이 분석은 접착제 백혈구 집단 및 인테그린 접착 분자 쌍 T 세포 신호 전달을 넘어 확장 될 수있다.

나타낸 바와 같이, 대표적인 결과 SDF-1α 자극, 주르 케트 일차 인간 CD3 + T 세포를 사용하여 유동 부착 분석법에서 도시된다. 모든 도시 실험에서 음성 대조군은 무 자극 세포이다. 자극되지 않은 셀의 문턱 기저 %의 밀착성 5 사이 - 10 %; 특히이 범위에서 상기 기재의 밀착성이 문제가 실​​험을 나타내고 T 세포의 시작 인구 비특이적 제제에 미리 활성화 하였다 나?...

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Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.4K 조회수.  New York University School of Medicine.  이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다. 

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...