Os autores gostariam de agradecer a Facilidade Avançada Microscopia Óptica (www.aomf.ca) na University Health Network para assistência com a microscopia, e o Sr. Jason Ellis do Cancer Center Machine Shop Princess Margaret para o fabrico do WC e do estágio de imagem. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Iris Kulbatski para a edição do manuscrito.

NOTA: Todos os trabalhos animal foi realizado sob o protocolo nº 2615 aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a Rede Universitária de Saúde. 1. Preparação cirúrgica do Rato <ol><li> Antes da cirurgia, todos os esterilizar instrumentos cirúrgicos e a câmara de janela (CC) em autoclave. Suplemento da água potável com 50 mg / kg de peso corporal de amoxicilina de 2 dias antes da cirurgia. Injectar o rato com 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por via intraperitoneal quatro horas antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar o rato nu atímicos por injeção intraperitoneal de solução salina 350-400 ul contendo 80 mg / kg de ketamina e 13 mg / kg de xilazina (Nota: Este foi aprovado pela Comissão de Cuidados Institucionais Animal, e nós não ter tido qualquer experiência com efeitos adversos ). Confirmar a anestesia adequada através de testes de reflexo pé. Continue observando para padrão respiratório, a cor das mucosas e do reflexo do pé durante o procedimento. </li><li> Executar a pr cirúrgicaocedures sob uma cabine de segurança biológica para manter condições estéreis durante a cirurgia. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento eléctrico coberto com um tecido cirúrgico para manter a temperatura do corpo durante a cirurgia. Executar todos os procedimentos cirúrgicos sob o microscópio estereoscópico. </li><li> Aplicar pomada para manter os olhos úmidos durante a cirurgia. Repita se necessário durante o procedimento cirúrgico. Esterilizar a área operacional do mouse limpando com 7,5% iodopovidona, álcool isopropílico a 70% e 10% iodopovidona consecutivamente, e repita este procedimento duas vezes. </li><li> Faça um 10 milímetros incisão cutânea longitudinal usando bisturi com lâmina (# 15), aproximando-se do fémur do lado lateral. Expor o fêmur entre os músculos flexores e extensores por dissecção romba usando uma pinça e hemostats para garantir a funcionalidade muscular. </li><li> Inserir a barra em forma de U sob o osso, e instalar a CC (Figura 1). Fixe a barra com a janela usando duas porcas, e aperte as porcas com aceps. Encher o espaço entre o osso e o WC com cimento dental. </li><li> Triturar o osso cortical numa região de 6 x 2 mm2 com um micro-broca para ganhar acesso óptico para a cavidade medular. Nota: Verifique cuidadosamente afinamento do osso cortical sob o microscópio durante a realização deste procedimento. Deixar uma camada de periósteo intacto, quase transparente do osso. </li><li> Coloque a lamela 8 mm sobre a janela, e garantir a lamela com um anel elástico para mantê-lo no lugar. </li><li> Reajuste a musculatura dos flexores e extensores de volta para seus locais originais usando uma pinça para manter a sua função após a cirurgia. Suturar a derme usando 5-0 sutura e um suporte de agulha. </li><li> Monitorar o mouse para a recuperação, até que ele está consciente e é capaz de se mover livremente. Coloque o animal em uma gaiola nova, quando recuperado. </li><li> Após a recuperação, realizar a aquisição de imagens sobre o animal no mesmo dia ou nos dias seguintes (ver secção 2). Monitorar o physicondição de cal do mouse diária. Nota: Monitorar as condições físicas, tais como rolamento de peso no membro, curvando, respiração rápida ou superficial, inchaço dos membros posteriores, auto-mutilação, celulite e dermatite grave. </li><li> Dê injecção intraperitoneal de 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por 3 dias, e 1 mg / kg de peso corporal do meloxicam durante 5 dias após a cirurgia para o tratamento da dor pós-operatória e inflamação. Continuar a fornecer a água suplementada com amoxicilina durante 5 dias. </li><li> No ponto final experimental, sacrificar o animal por CO 2 narcose seguido por um método secundário (por exemplo, deslocamento cervical). </li></ol> 2. Aquisição de Imagem Usando Combined multi-fótons e microscopia confocal <ol><li> Antes da imagiologia, anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal de uma solução salina de 350-400 ul contendo 80 mg / kg de cetamina e 13 mg / kg de xilazina. Como alternativa, use anestésico inalável, quando disponível.Aplicar pomada. </li><li> Injectar a mistura de corantes intravasculares para a vasculatura rotulagem (0,65 mg de 2 MDa de fluoresceína (FITC) -dextrano) e neutrófilos (4 ug de aloficocianina (APC) anticorpo-Ly6G -anti). </li><li> Usar um multi-fotão vertical combinadas e microscópio confocal equipado com um laser multi-fotão variando 705-980 nm para a excitação de dois fotões, bem como lasers de fotões individuais que fornece os comprimentos de onda de excitação de azul para vermelho. </li><li> Definir um estágio de imagem feitos sob medida para o microscópio (Figura 1B). Fixe o mouse sobre o palco, fixando as duas extremidades do WC com pinças. Nota: Os componentes críticos da fase são: duas pinças para segurar o WC, e um elemento de aquecimento para manter a temperatura fisiológica (37 ° C) do mouse durante o exame. </li><li> Ligue o laser de dois fótons e do sistema confocal, e lançar o software de aquisição de imagem, clicando em &quot;Sistema Start&quot;. Uma janela com 4 abas (Localize,Aquisição, processamento e manter) será aberta. </li><li> Configurar os canais de imagem. Clique em &quot;Configuração Inteligente&quot; sob a guia Aquisição e escolher os corantes que serão utilizados para geração de imagens: FITC (488 nm de excitação, 493-588 nm de emissão) e APC (633 nm de excitação e de emissão 638-743 nm). Escolha &quot;Melhor Signal&quot; e clique em &quot;Aplicar&quot;. </li><li> Adicionar a geração de segundo harmônico (SHG) imagem canal de aquisição manualmente. Ligue o laser de dois fótons sob a janela &quot;Laser&quot; na guia Acquisition. Sob a janela de Canais, clique no sinal &quot;+&quot; para adicionar uma faixa. </li><li> Configure a faixa SHG. Alterar o comprimento de onda de 840 nm sob a janela Canais usando as setas acima e abaixo, e escolher a faixa de detecção para ser 415-425 nm sob a janela &quot;Caminho de Luz&quot;, utilizando a barra deslizante. </li><li> Clique em &quot;ocular Online&quot; na guia Localizar. Clique FITC sob a configuração de filtro para FITC para visualizar a região de interesse e ajustar o foco manualmente, virando tele concentrar botão do lado do microscópio. Quando a região de interesse está localizado, clique em &quot;ocular off-line&quot;, na guia Localizar. </li><li> Clique na guia Acquisition. Selecionar a trilha FITC sob a janela Channels e clique em &quot;Live&quot; para visualizar a imagem de FITC-dextrano com objetivo de 5X. Ajuste o foco, se necessário, e clique em &quot;Stop&quot; na guia Acquisition para parar a pré-visualização. </li><li> ligar manualmente a 20X objetivo água movendo uma roda por cima das lentes. Ver a imagem novamente para FITC-dextrano com o objetivo 20X, e ajustar Ganho Master e Pinhole sob a janela de Canais para conseguir sinal e um contraste perfeito. Repita o procedimento para outros canais, selecionando faixas de APC e SHG sob a janela de Canais. </li><li> Escolha os parâmetros de imagem. Clique em &quot;Modo de Aquisição&quot; para abrir a janela. Defina o tamanho do quadro para ser 1.024 x 1.024 pixels, e média de 4X para obter imagens de alta qualidade. </li><li> Adquirir um instantâneo 2D. Selecione todos os canais sob Canais ganhardow e clique em &quot;Snap&quot;, na guia Acquisition. Verifique a qualidade da imagem e alterar os parâmetros de imagem, se necessário. </li><li> Adquirir imagem time-lapse 2D. <ol><li> Verifique fora &quot;Séries Temporais&quot; na guia Acquisition para abrir a janela Time Series. Digite 0 sob os intervalos, e 40 para o número total de verificações para levar 40 imagens continuamente, sem intervalo de tempo. Nota: 40 scans gera cerca de 5 minutos de tempo-série com uma velocidade de digitalização de 7,5 seg / frame e o tamanho da imagem de 600 mm x 600 mm. Ajuste o intervalo e número de exames, dependendo do microscópio, as configurações de aquisição de imagem ea taxa de quadros da câmera. Um intervalo de tempo fixo (&gt; 0 seg) pode ser utilizado para comparar imagens de lapso de tempo adquiridas em diferentes pontos de tempo. Uma duração de imagem mais lapso de tempo pode ser necessária, dependendo da velocidade média esperada de neutrófilos (ou outras células de interesse) na condição experimental. </li></ol></li><li> Adquirir imagem 3D.<ol><li> Verifique fora &quot;Z-Stack&quot; na guia Acquisition para abrir a janela Z-Stack. Iniciar o modo de visualização &quot;ao vivo&quot; para FITC-dextrano. Concentre-se no topo da amostra e clique em &quot;Set First&quot;, e concentrar-se na outra extremidade da amostra e clique em &quot;Definir Última&quot; na janela do Z-stack. </li><li> Defina o intervalo a ser de 10 mm sob a janela do Z-stack. Dependendo da primeira e da última fatia óptico seleccionada na etapa anterior, isso irá gerar 10-20 fatias, com a espessura óptica total de 90-180 uM. Nota: O intervalo de Z-pilha é dependente do tamanho do furo de pino, que determina a espessura da fatia óptico. Definir o intervalo a ser menos do que a espessura da fatia óptico. </li><li> Clique em &quot;Iniciar Experimento&quot; na guia Acquisition para começar a recolher imagens. </li></ol></li><li> Adquirir imagem time-lapse 3D. <ol><li> Verifique fora &quot;Séries Temporais&quot; e &quot;Z-stack&quot; na guia Acquisition para abrir o Time Seriese as janelas Z-stack. </li><li> Configurar o Time Series e parâmetros de aquisição Z-stack como descrito nos passos 2.14 e 2.15. Clique em &quot;Iniciar Experimento&quot; na guia Acquisition para começar a recolher imagens. </li></ol></li><li> Monitorar o mouse durante o exame para ter certeza que é estável e inconsciente. Se o mouse é instável e / ou consciente durante o exame, remova o mouse do palco, injetar adicionais 100-150 mL da solução anestésica por via intraperitoneal, e continuar de imagem. Nota: Os sinais de instabilidade incluem respiração rápida e movimento do mouse, o que pode ser visto como deslocando artefatos em imagens adquiridas. </li><li> Após a aquisição da imagem, dê o mouse para fora do palco e devolvê-lo para a jaula. Use uma lâmpada de aquecimento para mantê-lo quente, e monitorar o rato até que ele esteja consciente. </li></ol> Análise 3. Imagem e quantificação <ol><li> Usar a imagem de software de análise para analisar os dados em 3D e de séries temporais. Abra o software eadicionar imagens arrastando-os para a tela aberta, que é chamado vista &quot;Arena&quot;. Clique duas vezes em um arquivo de imagem para abri-la; a imagem será aberta em vista &quot;Superar&quot;. </li><li> Criar uma imagem 2D / 3D. <ol><li> A partir do bar &quot;Mais&quot; encontrado no canto superior direito, clique em &quot;Editar / Show Ajuste Display&quot; para abrir a janela &quot;Display Ajuste&quot;. Otimizar a exibição de fluorescência, ajustando os limites para cada canal e tirar um instantâneo para salvar a imagem. </li></ol></li><li> Gerar faixas de objetos a partir de imagens de lapso de tempo. <ol><li> Abra a imagem a ser analisada sob visão &quot;Superar&quot;. Clique no ícone com uma imagem de pontos alaranjados, encontrada abaixo do ícone &quot;Superar&quot;. Isto irá abrir uma nova janela &quot;Spots&quot;. </li><li> Verifique fora &quot;pontos de trilha (com o tempo)&quot; e clique na seta azul para ir para a próxima etapa. Selecione o canal que contém os objetos para rastrear sob &quot;Channel Source&quot;, e definir o diamet objeto estimadoer under &quot;diâmetro XY estimado&quot;, digitando um número. Clique na seta azul para ir para a próxima etapa. Nota: Para o acompanhamento de neutrófilos, seleccionar o canal que contém a APC fluorescência para os neutrófilos e definir o diâmetro do objecto a 12 um com base no tamanho conhecido de neutrófilos. </li><li> Na janela, localizar e selecionar o filtro &quot;Qualidade&quot;, clicando na seta para baixo. Observe os pontos definidos pelo software e ajustar manualmente o limiar para incluir ou excluir pontos. Uma vez limite é definido, clique na seta azul para ir para o passo &quot;Tracking&quot;. </li><li> No caso do algoritmo, localizar e selecionar &quot;Motion Algoritmo Autoregressive&quot;, clicando na seta para baixo. Digite 10 mm para &quot;Max Distance&quot; e 3 para &quot;Max Gap Size&quot; encontrado em Parâmetros. Verifique fora &quot;preencher as lacunas com todos os objectos detectados&quot; para começar a controlar, e clique na seta azul para ir para a próxima etapa. Nota: &quot;algoritmo de movimento Autoregressive&quot; é usado fou objetos que têm direcionado o movimento, uma vez que gera faixas com base na localização prevista do movimento anterior. &quot;Max Distance&quot; e &quot;Max Gap tamanho&quot; pode ser ajustado dependendo da dimensão e velocidade do objeto esperado sendo monitorado, bem como a duração total da imagem time-lapse. </li><li> Em Tipo de Filtro, selecione o filtro &quot;Track Duração&quot;. Clique na seta verde para finalizar rastreamento, e verificar as faixas que foram gerados. Volte para a etapa anterior se necessário para classificar manualmente as faixas. </li></ol></li><li> Se os desvios imagem lapso de tempo gerados, corrigir o desvio de translação. <ol><li> Clique no ícone com uma imagem de um lápis. Este é um guia de edição que se abre &quot;Tracks Editar&quot; janela. Examine a imagem de lapso de tempo e encontrar um ponto de referência que não deve estar se movendo para todas as imagens. </li><li> No canto superior esquerdo da tela, encontrar &quot;Pointer&quot; janela e verificar fora &quot;Select&quot; para activar o cursor para a selecção de um local. Clique no local de referência. </li><li> Clique em &quot;Deriva Correct&quot; na janela &quot;Editar faixas&quot;. Verifique fora &quot;Translational tração&quot;. O software irá gerar automaticamente a série corrigida de imagens. </li></ol></li><li> Medir o movimento celular definida pelas faixas de objetos em imagens de lapso de tempo. <ol><li> Sob a janela &quot;Editar faixas&quot;, marque &quot;Tracks&quot; e selecione uma faixa que representa o movimento de uma célula. A faixa selecionada será destacada em amarelo na imagem de séries temporais. </li><li> Clique no ícone com uma imagem de um gráfico para abrir a janela (guia estatísticas) &quot;Estatísticas&quot;. </li><li> Em &quot;Selection&quot;, selecione &quot;Track Velocidade Média&quot;, clicando na seta para baixo para gerar a velocidade em pista significa para a faixa selecionada. Escolha diferentes faixas e repita os passos para medir a velocidade em pista significa para todas as células de interesse. </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genetics.">Mouse Genetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).</li></ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Em tempo real, imagens seriadas dos processos celulares dinâmicos na medula óssea fornece a informação que é de outro modo difícil de obter usando técnicas convencionais tais como a histologia e as contagens sanguíneas totais. O modelo WC fêmur descrito aqui fornece uma oportunidade única para investigar alterações celulares e estruturais na medula óssea ao longo do tempo. Embora um modelo fêmur CC tem sido relatado anteriormente, o nosso design inovador proporciona um campo de imagem de visão maior e men...

A medula óssea é um órgão importante envolvidos na hematopoiese e regulação imune. É constituída por um componente que contém células germinais hematopoiéticas e progenitoras hematopoiéticas (hspCs), e um componente do estroma contendo células progenitoras não hematopoiéticas que dão origem a células mesenquimais 1. Dois terços da actividade hematopoiética é dedicado à produção de células mielóides 2. Em particular, um grande número de neutrófilos são produzidas na medula óssea, com 1-2 x 10 células 11 gerado por dia num ser humano adulto normal 2. Os neutrófilos são a primeira linha de defesa contra infecções microbianas e muitas vezes são reservados na medula óssea até que o estresse desencadeia a sua mobilização para completar os neutrófilos periféricos 1,3. Em adição aos seus efeitos anti-microbianos, estudos recentes sugerem um papel importante na biologia de neutrófilos cancro, tendo ambos pro- e anti-tumorigénica fenótipos dependendo de crescimento transformantefator beta (TGF-β) de sinalização no microambiente tumoral 4,5. Além disso, estudos demonstraram que os neutrófilos que se acumulam em tumores primários exercer efeitos pró-tumorigénicas e metastáticos através da supressão da função das células T citotóxica 6,7, enquanto que os neutrófilos em circulação exercer um agente citotóxico, efeito anti-metastático 8. Como tal, a investigação de células hematopoiéticas da medula óssea, particularmente os neutrófilos, é crucial para elucidar o seu papel na regulação imune e tumor. A histopatologia e uma contagem completa do sangue periférico são rotineiramente usadas para avaliar as alterações celulares e estruturais na medula óssea 9. No entanto, estes métodos apenas fornecem informação estática de diferentes populações de células ou de tecidos microestruturas. Longitudinal imagem in vivo pode ser utilizado em combinação com os métodos padrão para avaliar a dinâmica de vários componentes celulares, vasculares e do estroma, bem como célula-a-Cinterações ell de forma longitudinal. Microscopia intravital (IVM), definida como imagem de animais que vivem em microscópica resolução 10, é particularmente útil para avaliar os processos celulares dinâmicas ao longo do tempo na mesma amostra, reduzindo o número de animal experimental necessário. IVM é frequentemente combinada com uma câmara janela cronicamente transplantado (WC) para acessar o órgão de interesse para geração de imagens ao longo de um período de semanas a meses. modelos WC cranianos e dorsal-dobra cutânea tem a mais longa história de uso que remonta a meados de 1990. Mais recentemente, outros modelos WC especificas de órgãos, tais como os de almofada de gordura mamaria e vários órgãos abdominais foram desenvolvidos 11. A abordagem típica para geração de imagens de medula óssea in vivo tem uma exposição envolvido principalmente da calvária de ratos, onde o osso mais fina permite a visualização direta de células individuais com o mínimo de intervenção cirúrgica 12-14. No entanto, a medula óssea pode b calváriae distinta da de outros ossos, tais como o osso longo, tal como demonstrado por um menor número de hspCs e células hipóxicas em calvárias, o que indica a manutenção e desenvolvimento de hspCs 15 reduzida. Portanto, abordagens alternativas para avaliar os componentes celulares do osso longo têm sido investigados. Estes incluem a exposição direta da medula óssea femoral 16 e transplante ectópica do fêmur divisão na dobra cutânea dorsal WC 17. No entanto, o primeiro é um procedimento terminal que não permite o rastreamento de alterações celulares, estruturais e funcionais durante períodos de tempo mais longos, e este último provavelmente perturba a função normal da medula óssea devido ao transplante de fêmur a um site ectópica no interior do WC dorsal de dobras cutâneas. Um outro método que permite imagens seriadas ortotópico de medula óssea femural ao longo do tempo é o uso de um WC no osso femoral. Um relatório anterior demonstrou imagem latente a longo prazo da microcirculação na medula óssea do fémur usando umfêmur WC em ratos 18. Além disso, os autores demonstraram a visualização de células tumorais no fémur, o que indica a sua utilidade em metástases da medula óssea de monitorização. No entanto, este design WC era limitado pelo seu grande tamanho (1,2 cm de diâmetro) e a área de imagem relativamente pequena (4 mm de diâmetro), o que era apenas adequado para grande ratinhos (26-34 g, 3-6 meses de idade), tornando assim o aproximar-se impraticável para uso rotineiro. Por conseguinte, um novo WC com um tamanho global menor e maior área de imagem interna foi concebido para a finalidade do presente estudo. O objectivo deste estudo foi o de proporcionar um método para imagiologia de vários tipos de células na medula óssea do fémur. O modelo WC fêmur foi desenvolvido in-house e foi usado para visualizar e acompanhar neutrófilos dentro da rede vascular 3D. Utilizando este modelo, MIV da medula óssea pode ser realizado em série ao longo de 40 dias. Esta abordagem pode ser aplicada a uma variedade de campos para elucidar os processos de hematopoiese, uma regulação imuneo desenvolvimento do tumor nd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NRCNU-F athymic nude mice</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>Ncr nude</td>
			<td>8-10 weeks old, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1302P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&#160;</td>
			<td>DIN 01989529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td>
			<td>DIN 02169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Proxima</td>
			<td>DYNJP2405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Life Brand</td>
			<td>57800827375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (tear gel)</td>
			<td>Novartis&#160;</td>
			<td>T296/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>GreenField</td>
			<td>P010IP7P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-150-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle (#3)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (#15)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors curved</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-Mixter Hemostat</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill</td>
			<td>Harvard Apparaus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill burrs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femur window chamber</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped bar</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (8mm)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>HBIO 64-0701 CS-8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring (8mm)</td>
			<td>ACKLANDS GRAINGER</td>
			<td>UNSPSC # 31163202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts (hexagon stainless steel)</td>
			<td>Fastenal</td>
			<td>70701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>3M</td>
			<td>RelyX U200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 Monosof black)</td>
			<td>Covioien</td>
			<td>SN-5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12501-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>DIN 0281251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>DIN 02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin (Clamavox)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02027879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 710 NLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging stage</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris 8.0</td>
			<td>Image analysis software described in Section 3 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Medula óssea femural de murino é acessado com sucesso utilizando o WC para permitir a visualização de neutrófilos individuais e redes vasculares. A Figura 1 mostra o instrumento WC e descreve o procedimento cirúrgico, o que envolve a exposição do osso femoral e adelgaçamento do osso cortical para ganhar acesso óptico no interior da osso. A cirurgia é bem tolerada em ratinhos; eles foram avaliados para reações físicas adversas, como inchaço dos membros post...

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

8.1K visualizações.  Princess Margaret Cancer Centre. The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Vídeo: Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

In vitro a formação de biofilme em um slide Câmara de 8 poços

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Imunologia e Infecção

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

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