Name: femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow at JoVE.com

著者らは、WCと撮影台を製造するためのプリンセスマーガレットがんセンターマシンショップから顕微鏡の支援のために大学健康ネットワークで高度な光学顕微鏡施設（www.aomf.caを）感謝したい、と氏はジェイソン・エリスでしょう。また、原稿編集のために博士アイリスKulbatskiに感謝したいと思います。

注：すべての動物の作業は、大学健康ネットワーク施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの＃2615で行いました。 マウスの1外科の準備<ol><li>手術に先立ち、オートクレーブにより、すべての手術器具や窓室（WC）を滅菌します。 2日前、手術とアモキシシリンの50 mg / kg体重で飲料水を補います。腹腔内に4時間、手術前にブプレノルフィンの0.1 mg / kg体重でマウスを注入します。 </li><li> 80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジン（注を含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射による無胸腺ヌードマウスを麻酔：これは施設内動物実験委員会によって承認された、と私たちは悪影響の経験がありませんでした）。足の反射をテストすることによって、適切な麻酔を確認してください。手順中の呼吸パターン、粘膜の色と足の反射のために観察し続けます。 </li><li>外科的な広報を行います手術中に無菌状態を維持するための安全キャビネットの下ocedures。手術中の体温を維持するために、外科用ドレープで覆われた電気加熱パッドの上にマウスを置きます。実体顕微鏡下ですべての外科的処置を実行します。 </li><li>手術中に湿った目を保つために眼軟膏を適用します。必要に応じて、外科手術の際に繰り返します。連続して7.5％ポビドンヨード、70％のイソプロピルアルコールおよび10％ポビドンヨードで拭いて、マウスの動作領域を殺菌し、この手順を2回繰り返します。 </li><li>側面から大腿骨に接近し、ブレード（＃15）とメスを用いて10ミリメートル縦皮膚切開を行います。筋肉の機能を確保するために鉗子や止血剤を使用して、鈍的切開により屈筋と伸筋の間の大腿骨を公開します。 </li><li>骨の下でU字型の棒を挿入し、WC（ 図1）をインストールします。 2つのナットを使用してウィンドウでバーを固定し、ためにナットを締めCEPS。歯科用セメントと骨とWCとの間の空間を満たします。 </li><li>骨髄腔への光アクセスを得るために、マイクロドリルで6×2ミリメートル2領域での皮質骨を削ります。 注：この手順を実行しながら、慎重に顕微鏡下皮質骨の菲薄化を検査します。骨の無傷の、ほぼ透明骨膜層を残します。 </li><li>ウィンドウ上に8ミリメートルのカバーガラスを配置し、所定の位置にそれを維持するためにスナップリングでカバーガラスを固定します。 </li><li>手術後のその機能を維持するために鉗子を使用して戻って元の場所への屈筋と伸筋の筋組織を再調整します。 5-0縫合糸と針ホルダを使用して、真皮を縫合。 </li><li>それは意識があると自由に移動できるようになるまで、回復のためのマウスを監視します。回収されたときに、新しいケージに動物を入れてください。 </li><li>回復後、（セクション2を参照）と同じ日または次の日に動物の画像取得を行います。 physiを監視します毎日マウスのCAL条件。 注：このような四肢、ハンチング、急速または浅い呼吸、後肢の腫脹、自傷、蜂巣および重度の皮膚炎に体重負荷のような物理的な条件を、監視します。 </li><li> 3日間のブプレノルフィン/ kg体重を0.1mgの腹腔内注射を与え、術後疼痛及び炎症の治療のための手術後5日間、メロキシカム1mg / kg体重。 5日間アモキシシリンを補充した水を提供し続けます。 </li><li>実験的なエンドポイントで、二次的方法（ 例えば 、頚椎脱臼）、続いてCO 2ナルコーシスにより動物を安楽死させます。 </li></ol>複合多光子共焦点顕微鏡を用いて2画像取得<ol><li>撮影に先立ち、80ミリグラム/ kgのケタミンおよび13 mgの/ kgのキシラジンを含む350〜400μlの生理食塩水の腹腔内注射によってマウスを麻酔。利用可能な場合あるいは、吸入可能麻酔薬を使用しています。眼軟膏を適用します。 </li><li>および好中球（アロフィコシアニン（APC） - 抗Ly6G抗体4μgの）（2 MDAフルオレセイン（FITC） - デキストランの0.65 mg）をラベリング血管系のための血管内色素の混合物を注入します。 </li><li>青から赤に励起波長を提供して705から980 nmのから二光子励起のために及ぶ多光子レーザー、ならびに単一光子レーザーを装備した直立組み合わせた多光子共焦点顕微鏡を使用してください。 </li><li>顕微鏡（ 図1B）上にカスタムメイドの撮影台を設定します。ワニ口クリップでWCの2つの端部をクランプすることにより、ステージ上でマウスを固定します。 注：WCを保持するための2つのワニ口クリップ、撮像中にマウスの生理的温度（37℃）を維持するために加熱要素：ステージの重要な構成要素です。 </li><li>二光子レーザーおよび共焦点システムの電源を入れ、「スタートシステム」をクリックすることで、画像取得ソフトウェアを起動します。 4つのタブ付きウィンドウ（見つけて、収集、処理、および保守）が開きます。 </li><li>イメージングチャンネルを設定します。取得タブの下に「スマートセットアップ」をクリックして、イメージングのために使用される染料を選択：FITC（488 nm励起、493から588 nmの発光）とAPC（633 nm励起および638から743 nmの発光を）。 「最良の信号」を選択し、「適用」をクリックします。 </li><li>第二高調波発生（SHG）撮像チャネルを手動で追加します。買収タブの「レーザー」ウィンドウの下に二光子レーザーをオンにします。 Channelsウィンドウの下で、トラックを追加するには、「+」記号をクリックしてください。 </li><li> SHGトラックを設定します。上下の矢印を使用してChannelsウィンドウの下に840 nmの波長を変更し、スライダバーを使用して「光パス」ウィンドウの下に415から425 nmで検出範囲を選択します。 </li><li>探しタブの下に「接眼レンズオンライン」をクリックします。関心のある領域を表示し、トンを回して手動でピントを調整するためにFITC用のフィルタ設定の下でFITCをクリックします彼は顕微鏡の側につまみを集中します。関心領域が配置されているときに、見つけタブの下に「接眼レンズオフライン」をクリックします。 </li><li>取得]タブをクリックします。 Channelsウィンドウの下にFITCトラックを選択して、5倍の対物レンズを用いてFITCデキストランの画像をプレビューするには、「ライブ」をクリックしてください。必要に応じてフォーカスを調整し、プレビューを停止するには、取得]タブの下で「停止」をクリックします。 </li><li>手動でレンズの上にホイールを動かすことによって、20X水目標に向けます。 20Xの対物レンズを用いてFITCデキストランのために再度画像を表示し、最適な信号とコントラストを達成するために、チャンネル・ウィンドウの下にマスターゲインとピンホールを調整します。 Channelsウィンドウの下にAPCとSHGのトラックを選択することで、他のチャンネルについて、この手順を繰り返します。 </li><li>撮像パラメータを選択します。そのウィンドウを開くには、「取得モード」をクリックします。高品質の画像を得るために、フレーム1,024×1024ピクセルにサイズ、および4Xの平均化を設定します。 </li><li> 2Dスナップショットを取得します。チャンネルが勝つの下にすべてのチャンネルを選択しますダウとは、買収のタブの下に「スナップ」をクリックしてください。画像の品質を確認し、必要に応じて撮影パラメータを変更します。 </li><li> 2Dタイムラプス画像を取得します。 <ol><li>時系列ウィンドウを開くために取得タブで「時系列」をオフに確認してください。間隔の下で0を入力し、時間間隔なしで連続40画像を撮影するためのスキャンの合計数は40。 注：40スキャンは7.5秒/フレームの走査速度及び600μmの×600ミクロンの画像サイズで約5分の長期時系列を生成します。間隔顕微鏡、画像取得の設定、カメラのフレームレートに応じて、スキャンの数を調整します。固定されたインターバル時間（&gt; 0秒）は、異なる時点で取得されたタイムラプス画像を比較するために使用することができます。長いタイムラプスイメージングの期間は、実験条件における好中球の予想平均速度（または関心のある他の細胞）に応じて必要となる場合があります。 </li></ol></li><li> 3D画像を取得します。<ol><li> Z-Stack]ウィンドウを開くために取得タブで「Z-スタック」をオフに確認してください。 FITCデキストランのための「ライブ」プレビューモードを開始します。サンプルの上に焦点を当て、「最初の設定」をクリックし、サンプルのもう一方の端に焦点を当ててクリックZスタックウィンドウに「最後のセット」。 </li><li> Zスタックウィンドウの下には10μmであると間隔を設定します。前のステップで選択した最初と最後の光学スライスに応じて、これは90から180ミクロンの全体的な光学的厚さで、10月20日のスライスを生成します。 注：zスタック間隔は、光学スライスの厚さを決定するピンホールの大きさに依存します。光学スライスの厚さよりも小さくなるように間隔を設定します。 </li><li>画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。 </li></ol></li><li> 3Dタイムラプス画像を取得します。 <ol><li>時系列を開くために取得タブで「時系列」をオフにチェックし、「Z-スタック」Zスタック窓。 </li><li>ステップ2.14と2.15で説明したように時系列およびZ-スタック取得パラメータを設定します。画像の収集を開始するために取得]タブの下の「実験を開始」をクリックします。 </li></ol></li><li>それが安定して無意識であることを確認するために撮像中にマウスを監視します。マウスは、撮影時の不安定および/または意識がある場合は、ステージからマウスを削除し、腹腔内に麻酔液の追加の100-150μLを注入し、撮影を続けます。 注意：不安定性の徴候は、取得した画像にアーチファクトをシフトとして見ることができるマウスの速い呼吸と動きを、含まれています。 </li><li>画像取得後、ステージからマウスを取ると、ケージに戻します。暖かいそれを維持し、それは意識があるまで、マウスを監視するために加熱ランプを使用してください。 </li></ol> 3.画像解析と定量化<ol><li> 3次元時系列データを分析するために画像解析ソフトウェアを使用。ソフトウェアを開いて、「アリーナ」ビューと呼ばれるオープン画面へドラッグして画像を追加します。それを開くには、画像ファイルをダブルクリックします。画像は「サーパス」ビューの下で開かれます。 </li><li> 2D / 3D画像を作成します。 <ol><li>右上にある &quot;詳細&quot;バーから、「画面の調整」ウィンドウを開くには、「編集/表示するディスプレイの調整」をクリックします。各チャネルのしきい値を調整することにより、蛍光表示を最適化し、画像を保存するスナップショットを取ります。 </li></ol></li><li>タイムラプス画像を使用してオブジェクトのトラックを生成します。 <ol><li>ビューを「サーパス」で分析する画像を開きます。 「サーパス」アイコンの下に見つかったオレンジ色のドットの画像とアイコンをクリックします。これは、新しい「スポット」ウィンドウを開きます。 </li><li> 「（時間以上）のトラックスポット」をオフにチェックして、次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。 「ソースチャンネル」の下で追跡するためのオブジェクトを含むチャンネルを選択して、推定されたオブジェクトDIAMETを設定数値を入力して「推定XY直径」の下えー。次のステップに進むために青色の矢印をクリックしてください。 注：好中球の追跡のために、好中球に対するAPCの蛍光を含むチャンネルを選択して、好中球の既知のサイズに基づいて、12ミクロンへのオブジェクトの直径を設定します。 </li><li>ウィンドウで、検索し、下矢印をクリックして「品質」フィルタを選択します。ソフトウェアで定義されたスポットを観察し、スポットを含めるか除外するかを手動でしきい値を調整します。しきい値が定義されると、「トラッキング」のステップに行くために青色の矢印をクリックしてください。 </li><li>アルゴリズムの下で、下矢印をクリックして「自己回帰モーションアルゴリズム」を見つけ、選択します。 「最大ギャップサイズ」の「最大距離」のための10ミクロンおよび3のタイプは、パラメータの下で見つかりました。オフチェック追跡を開始し、次のステップに行くために青色の矢印をクリックし、「すべての検出されたオブジェクトとのギャップを埋めます」。 注：「自己回帰運動アルゴリズムは「F使用されていますまたはそれは、前の動きから予測位置に基づいて、トラックを生成するので、動きを指示したオブジェクト。 「最大距離」と「最大ギャップサイズは、「予想される寸法と速度追跡されているオブジェクトのと同様に、タイムラプス画像の全体の持続時間に応じて調整することができます。 </li><li>フィルタの種類]で、「トラック時間」フィルタを選択します。追跡を終了するには、緑色の矢印をクリックし、生成されたトラックを確認してください。必要に応じて手動でトラックをソートする前のステップに戻ります。 </li></ol></li><li>生成されたタイムラプス画像ドリフトの場合、翻訳ドリフトの正しいです。 <ol><li>鉛筆の画像でアイコンをクリックしてください。これは、「編集トラック」ウィンドウが開き、編集タブです。タイムラプス画像を調べて、すべての画像に移動すべきではないの参照場所を見つけます。 </li><li>画面の左上隅で、「ポインタ」ウィンドウを見つけるとCuをアクティブにする」を選択し、「オフチェックスポットを選択するためのrsor。参照スポットをクリックします。 </li><li> 「編集トラック」ウィンドウに「正しいドリフト」をクリックしてください。 「トランスレーショナドリフト」をオフに確認してください。ソフトウェアは自動的に画像の補正後のシリーズを生成します。 </li></ol></li><li>タイムラプス画像内のオブジェクトのトラックによって定義された携帯の動きを測定します。 <ol><li> 「編集トラック」ウィンドウの下に、「トラック」をオフにチェックし、細胞の動きを表すトラックを選択。選択したトラックは、時系列画像の黄色で強調表示されます。 </li><li> 「統計」ウィンドウ（統計]タブ）を開くために、グラフの画像とアイコンをクリックしてください。 </li><li> 「選択」の下では、トラックの速度が選択されたトラックのために意味を生成するには、下矢印をクリックして「トラックスピード平均」を選択します。別のトラックを選択し、トラックの速度は関心のあるすべてのセルの平均を測定するためのステップを繰り返します。 </li></ol></li></ol>

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著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

リアルタイムは、骨髄中の動的な細胞プロセスの連続撮影は、そうでなければ、このような組織学および総血球数などの従来の技術を用いて得ることが挑戦されている情報を提供します。ここで説明した大腿骨WCモデルは、時間の経過とともに、骨髄中の細胞と構造変化を調査するためのユニークな機会を提供しています。大腿骨WCモデルは、以前に報告されているが、本発明の新規な設計は...

骨髄は造血及び免疫調節に関与する重要な器官です。これは、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）を含む造血成分、および間葉細胞1を生じる非造血前駆細胞を含む間質成分から成ります。造血活性の三分の二は、骨髄細胞2の世代に捧げられています。 1-2×10 11細胞は、正常な成人2日ごとに生成して、特に、好中球の大多数は、骨髄で産生されます。好中球は、微生物感染に対する防御の第一線であり、ストレスが末梢 ​​好中球1,3を補完するために彼らの動員をトリガするまで、主に骨髄に予約されています。それらの抗菌効果に加えて、最近の研究では、形質転換成長によってプロ及び抗腫瘍形成表現型の両方を有する、癌生物学における好中球の重要な役割を示唆しています腫瘍微小環境4,5におけるシグナル伝達因子β（TGF-β）。また、研究では、循環中の好中球は、細胞毒性、抗転移効果8を発揮しながら、原発腫瘍に蓄積する好中球は、T細胞6,7の細胞傷害性機能を抑制することにより、プロ腫瘍形成および転移性効果を発揮することを実証しました。このように、骨髄中の造血細胞の研究、特に好中球は、免疫および腫瘍調節におけるそれらの役割を解明するために重要です。 組織病 ​​理学および完全な末梢血球数を日常骨髄9細胞および構造変化を評価するために使用されます。しかしながら、これらの方法は、異なる細胞集団または組織の微細構造の静的な情報を提供します。長手方向のインビボイメージングは、複数の細胞、血管および間質成分の動力学ならびに細胞からCを評価するための標準的な方法と組み合わせて使用することができます縦の方法でエル相互作用。顕微鏡の分解能10で生きている動物の画像化として定義される生体顕微鏡（IVM）は、必要な実験動物の数を減少させる、同じ試料中の経時動的な細胞プロセスを評価するために特に有用です。 IVMは、多くの場合、数週間から数ヶ月の期間にわたって画像化の対象の臓器にアクセスするために慢性的に移植窓室（WC）と組み合わされます。頭蓋と背皮脂WCのモデルが戻って1990年代半ばにさかのぼる使用の最も長い歴史を持っています。より最近では、このような乳房脂肪パッドおよび様々な腹部の器官のものなどの他の臓器特異的WCモデル11を開発されてきました。 生体内で骨髄を撮像するための典型的なアプローチは、薄くなった骨が最小限の外科的介入12-14と単一細胞の直接可視化を可能にしたマウスの頭蓋冠、の主に関与露出を持っています。しかし、頭蓋冠の骨髄は、bの場合があり電子HSPCs 15の維持・発展を減少示し頭蓋冠でHSPCsと低酸素細胞の低い数、によって示されるように、そのような長い骨のような他の骨、のとは異なります。したがって、長骨内の細胞成分を評価するための代替的なアプローチが研究されてきました。これらは、大腿骨の髄16と背側皮下脂肪WC 17で分割大腿骨の異所性移植の直接のエクスポージャーが含まれます。しかし、前者はより長い期間にわたって、セルラー構造的および機能的変化の追跡を許可しない端末の手順であり、後者の可能性が高いが原因背側皮下脂肪WC内部の異所性サイトへの大腿骨の移植に正常な骨髄機能を妨げます。時間をかけて大腿骨髄の同所シリアルイメージングを可能にするもう一つの方法は、大腿骨にWCを使用することです。一つ前のレポートでは、使用して大腿骨髄中の微小循環の長期的なイメージングを実証しましたマウス18で大腿骨WC。さらに、著者らは、骨髄転移をモニタリングにおけるその有用性を示す、大腿骨における腫瘍細胞の可視化を示しました。しかし、このWCの設計は、それによって作り、その大きなサイズ（1.2センチ直径）と大規模なマウスのみに適した比較的小さな撮影領域（直径4mm）、（26〜34グラム、生後3-6ヶ月）によって制限されていました日常的な使用のための非現実的なアプローチ。 したがって、小さい全体のサイズと大きい内側の撮像領域を持つ新しいWCは、本研究の目的のために設計されました。この研究の目的は、大腿骨の髄内に種々の細胞型を撮像するための方法を提供することでした。大腿骨WCモデルは、社内で開発された3D血管網内の好中球を可視化し、追跡するために使用されました。このモデルを用いて、骨髄のIVMは、40日間に渡って連続的に行うことができます。このアプローチは、免疫調節A、造血のプロセスを解明するための様々な分野に適用することができますND腫瘍発生。

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F athymic nude mice</td><td>Taconic</td><td>Ncr nude</td><td>8-10 weeks old, female</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&amp;nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Surgical drape</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad</td><td>Life Brand</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment (tear gel)</td><td>Novartis&amp;nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors curved</td><td>Fine science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Baby-Mixter Hemostat</td><td>Fine science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine science Tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-drill</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Micro-drill burrs</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Femur window chamber</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness)</td></tr><tr><td>U-shaped bar</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height)</td></tr><tr><td>Coverglass (8 mm)</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Retaining ring (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC # 31163202</td><td></td></tr><tr><td>Nuts (hexagon stainless steel)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Suture (5-0 Monosof black)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Halsey needle holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine (Temgesic)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoxicillin (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Imaging stage</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height)</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Image analysis software described in Section 3 of the Protocol&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

マウス大腿骨髄が正常に個々の好中球および血管ネットワークの可視化を可能にするためにWCを使用してアクセスします。1は、WCの楽器を示し、内部の光学アクセスを得るために、大腿骨と皮質骨の菲薄化の露出を伴う外科手術を、説明図骨。手術はマウスで忍容性が良好です。それらは苦痛の無い報告書では、このような5日後に手術のため...

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

8.1K ビュー.  Princess Margaret Cancer Centre. The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

発生生物学

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular niches modulating critical hematopoietic stem cell (HSC) functions1,2. Indeed, a more detailed picture of the hematopoietic microenvironment is now emerging, in which the endosteal and the endothelial niches form functional units for the regulation of normal HSC and their progeny3,4,5. New studies have revealed the importance of perivascular cells, adipocytes and neuronal cells in maintaining and regulating HSC function6,7,8. Furthermore, there is evidence that cells from different lineages, i.e. myeloid and lymphoid cells, home and reside in specific niches within the BM microenvironment. However, a complete mapping of the BM microenvironment and its occupants is still in progress.
Transgenic mouse strains expressing lineage specific fluorescent markers or mice genetically engineered to lack selected molecules in specific cells of the BM niche are now available. Knock-out and lineage tracking models, in combination with transplantation approaches, provide the opportunity to refine the knowledge on the role of specific &#34;niche&#34; cells for defined hematopoietic populations, such as HSC, B-cells, T-cells, myeloid cells and erythroid cells. This strategy can be further potentiated by merging the use of two-photon microscopy of the calvarium. By providing in vivo high resolution imaging and 3-D rendering of the BM calvarium, we can now determine precisely the location where specific hematopoietic subsets home in the BM and evaluate the kinetics of their expansion over time. Here, Lys-GFP transgenic mice (marking myeloid cells)9 and RBPJ knock-out mice (lacking canonical Notch signaling)10 are used in combination with IVFM to determine the engraftment of myeloid cells to a Notch defective BM microenvironment.

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital fluorescence microscopy (IVFM) of the calvarium is applied in combination with genetic animal models to study the homing and engraftment of hematopoietic cells into bone marrow (BM) niches.

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

免疫・感染学

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

医学

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

生物学

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>生きたマウスの骨髄研究のための大腿内注射

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>生きたマウスを使用した簡略化された大腿内注射により、継続的な骨髄分析が可能

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

生きたマウスを使用した簡略化された大腿内注射により、継続的な骨髄分析が可能

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル

要約

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造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

マウス骨髄単球の追跡

生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

生きたマウスを使用した簡略化された大腿内注射により、継続的な骨髄分析が可能

生きたマウスを使用した簡略化された大腿内注射により、継続的な骨髄分析が可能