저자는 현미경과 지원을 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 시설 (www.aomf.ca)를 감사하고, 화장실, 이미징 단계의 제조 프린세스 마가렛 암 센터의 기계 공장에서 씨 제이슨 엘리스 것이다. 우리는 또한 원고 편집 박사 아이리스 Kulbatski에게 감사의 말씀을 전합니다.

참고 : 모든 동물의 작업은 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜 # 2615에 따라 실시 하였다. 마우스 1. 수술 준비 <ol><li> 이전 수술로, 모든 수술기구 및 고압 증기 멸균하여 윈도우 챔버 (WC)를 소독. 2 일전 수술 아목시실린의 50 mg / kg 체중으로 식수를 보충합니다. 복강 4 시간 전에 수술 부 프레 노르 핀의 0.1 ㎎ / ㎏ 체중와 마우스를 주입한다. </li><li> 80 ㎎ / ㎏ 케타민 13 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (주를 포함 350-400 μL 식염수 용액을 복강 내 주사에 의한 무 흉선 누드 마우스를 마취 :이 기관 동물 관리위원회의 승인을하고, 우리는 부작용 어떤 경험이 없었어요 ). 발 반사를 테스트하여 적절한 마취를 확인합니다. 절차를 수행하는 동안 호흡 패턴, 점막 색상과 발 반사에 대한 관찰을 계속합니다. </li><li> 수술 홍보를 수행바이오 안전성 캐비닛에서 ocedures 수술시 무균 상태를 유지합니다. 수술 동안 체온을 유지하는 수술 용 드레이프 피복 전기 난로에 마우스를 놓는다. 실체 현미경 아래에있는 모든 수술 절차를 수행합니다. </li><li> 수술하는 동안 촉촉한 눈을 유지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 수술하는 동안 필요한 경우 반복합니다. 연속적으로 7.5 % 포비돈 - 요오드, 70 % 이소 프로필 알코올 10 % 포비돈 - 요오드 닦아 마우스의 조작 영역을 소독 회이 과정을 반복한다. </li><li> 측면에서 대퇴골에 접근, 블레이드 (# 15)와 메스를 사용하여 10mm 길이의 피부 절개를합니다. 근육의 기능을 보장하기 위해 집게와 지혈제를 사용 무딘 절개하여 굴근과 신근 근육 사이의 대퇴골을 노출. </li><li> 뼈 아래에있는 U 자형 막대를 삽입하고, WC (그림 1)를 설치합니다. 2 개의 너트를 사용하여 창 막대를 고정하고, 용와 너트를 조이CEPS. 뼈 및 치과 시멘트와 화장실 사이의 공간을 채 웁니다. </li><li> 골수 공동 광학 액세스하는 마이크로 드릴 6 × 2 ㎜ × 2 영역의 피질골을 분쇄. 참고 :이 절차를 수행하는 동안 조심스럽게 현미경으로 피질골의 숱을 검사합니다. 뼈의 손상, 거의 투명 골막 층을 둡니다. </li><li> 창에 8 밀리 커브 글라스를 놓고 장소에 보관하는 스냅 링과 커브 글라스를 고정합니다. </li><li> 수술 다음 그 기능을 유지하기 위해 집게를 사용하여 다시 원래 위치로 굴근과 신근의 근육을 조정합니다. 5-0 봉합사와 바늘 홀더를 사용하여 진피 봉합사. </li><li> 이 의식 자유롭게 움직일 수있을 때까지, 복구를 위해 마우스를 모니터합니다. 복구 할 때 새 케이지에 동물을 넣습니다. </li><li> 복구 후, 같은 날 또는 다음 날 동물의 이미지 수집을 수행 (섹션 2 참조). 풍모를 모니터링매일 마우스의 칼 상태. 참고 : 무게가 빠르거나 얕은 호흡, 뒷다리의 부종, 자기 절단, 봉와직염, 심한 피부염을 hunching, 사지에 베어링과 같은 물리적 조건을 모니터링합니다. </li><li> 3 일간의 부 프레 노르 핀 / kg 체중 0.1 mg을 복강 내 주사를주고, 수술 - 후 통증 및 염증 치료를위한 수술 후 5 일간 멜 록시 캄의 1 ㎎ / ㎏ 체중. 5 일간 아목시실린 - 보충 물을 제공하는 계속합니다. </li><li> 실험 엔드 포인트, CO에 의해 보조 방법 (예를 들어, 경추 탈구)이어서이 마취를 동물을 안락사. </li></ol> 복합 다중 광자 및 공 초점 현미경을 사용하여 2. 이미지 획득 <ol><li> 종래 이미징 80 밀리그램 / kg 케타민, 13 밀리그램 / kg 자일 라진 함유 350-400 μL의 생리 식염수를 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 가능한 경우 또는 흡입 마취제를 사용합니다.눈 연고를 적용합니다. </li><li> 라벨 혈관에 대한 혈관 내 염료의 혼합물 (0.65 2 MDA 형광 (FITC) -dextran의 mg) 및 호중구 (Allophycocyanine (APC의 4 μg의) - 반대로 Ly6G 항체)를 주입한다. </li><li> 청색으로부터 적색에 여기 파장을 제공하는 705-980 nm 내지 이광자 여기 레인 징 다중 광자 레이저뿐만 아니라, 단일 광자 레이저를 구비 한 직립 결합 다중 광자와 공 촛점 현미경을 사용한다. </li><li> 현미경 (그림 1B)에 사용자 정의 만든 영상 단계를 설정합니다. 악어 클립으로 WC의 두 끝을 체결하여 무대에 마우스를 고정합니다. WC를 유지하기 위해 두 악어 클립 및 가열 요소는 이미징 동안 마우스의 생리적 온도 (37 ° C)를 유지하기 위해 다음 단계의 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다 있습니다. </li><li> 두 광자 레이저 공 초점 시스템의 전원을 켜고 &quot;시작 시스템&quot;을 클릭하여 이미지 수집 소프트웨어를 실행합니다. 4 탭 창이 (찾아획득, 처리 및 유지) 열립니다. </li><li> 이미징 채널을 설정합니다. 획득 탭에서 &quot;스마트 설치&quot;를 클릭하고 영상에 사용되는 염료를 선택 FITC (488 nm의 여기, 493-588 nm의 방출)와 APC (633 nm의 여기 및 638-743 nm의 방출을). &quot;최고의 신호&quot;를 선택하고 &quot;적용&quot;을 클릭합니다. </li><li> 수동 제 2 고조파 발생 (SHG) 화상 취득 채널을 추가한다. 획득 탭에서 &quot;레이저&quot;창 아래에있는 두 광자 레이저를 켭니다. [채널] 창에서 트랙을 추가하려면 &quot;+&quot;기호를 클릭합니다. </li><li> SHG 트랙을 설정합니다. 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 채널 창 아래 840 nm의 파장을 변경하고 슬라이더 막대를 사용하여 &quot;빛의 경로&quot;창에서 415-425 나노 미터로 검출 범위를 선택합니다. </li><li> 찾기] 탭에서 &quot;접안 온라인&quot;을 클릭합니다. FITC 관심의 영역을 확인하고 t을 돌려 초점을 수동으로 조정에 대한 필터 설정에서 FITC를 클릭합니다그 현미경 측에 손잡이를 집중한다. 관심 영역이있는 경우, 찾기 탭에서 &quot;접안 오프라인&quot;을 클릭합니다. </li><li> 획득 탭을 클릭합니다. 채널 창에서 FITC 트랙을 선택하고, 5 배 목표와 FITC-덱스 트란의 이미지를 미리 &quot;라이브&quot;를 클릭합니다. 필요에 초점을 조정하고 미리보기를 중지 취득 탭에서 &quot;중지&quot;를 클릭합니다. </li><li> 수동 렌즈 위의 휠을 이동하여 20 배의 물 목표로 설정합니다. 20 배 목표를 사용하여 FITC-덱스 트란에 대한 이미지를 다시보기 및 최적의 신호와 대비를 달성하기 위해 채널 창에서 마스터 게인 및 핀홀을 조정합니다. [채널] 창에서 APC 및 SHG 트랙을 선택하여 다른 채널에 대해 반복합니다. </li><li> 이미징 매개 변수를 선택합니다. 그 창을 엽니 다 &quot;수집 모드&quot;를 클릭합니다. 고품질의 이미지를 얻기 위해, 프레임 크기는 1024 X 1024 픽셀로 설정하고, 4 배의 평균. </li><li> 2 차원 스냅 샷을 취득. 채널 승리에서 모든 채널을 선택다우와 획득 탭​​에서 &quot;스냅&quot;을 클릭합니다. 이미지의 품질을 확인하고 필요한 경우 영상 매개 변수를 변경합니다. </li><li> 2D 시간 경과 이미지를 획득. <ol><li> 시계열 창을 엽니 획득 탭​​에 &quot;시간 시리즈&quot;를 해제하십시오. 시간 간격없이 연속 40 이미지를 취할 검사의 총 수의 간격에 따라 0, 40을 입력합니다. 참고 : 40 스캔은 7.5 초 / 프레임의 스캔 속도 및 600 μm의 × 600 μm의 이미지 크기는 약 5 분 장시간 시리즈를 생성한다. 간격과 현미경 화상 취득 설정 및 카메라의 프레임 레이트에 따라 스캔의 수를 조정한다. 일정 간격의 시간 (&gt; 0 초)은 상이한 시점에서 취득한 타임 랩스 영상과 비교하기 위해 사용될 수있다. 더 긴 시간 경과 영상 시간은 실험 조건에서 호중구 (또는 관심의 다른 세포)의 예상 평균 속도에 따라 요구 될 수있다. </li></ol></li><li> 3D 이미지를 획득.<ol><li> Z 축 스택 창을 엽니 획득 탭​​에 &quot;Z-스택&quot;을 해제하십시오. FITC-덱스 트란의 &quot;라이브&quot;미리보기 모드를 시작합니다. 샘플의 상단에 초점 &quot;우선 설정&quot;을 클릭하고 샘플의 다른 쪽 끝을에 초점을 클릭 Z 스택 창에서 &quot;최근 설정&quot;. </li><li> Z 축 스택 창에서 10 μm의 것으로 간격을 설정합니다. 이전 단계에서 선택된 제 1 및 최종 광학 슬라이스에 따라이 90-180 ㎛, 전체 광학 두께, 10-20 슬라이스를 생성한다. 주 : Z 스택 간격 광학 슬라이스 두께를 결정 핀홀의 크기에 의존한다. 광학 슬라이스의 두께 이상이어야 간격을 설정합니다. </li><li> 이미지를 수집하기 시작 획득 탭​​에서 &quot;시작 실험&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 3D 시간 경과 이미지를 획득. <ol><li> 시계열을 열 획득 탭​​에 &quot;시간 시리즈&quot;와 &quot;Z-스택을&quot;오프 확인그리고 Z-스택 창. </li><li> 단계 2.14과 2.15에 설명 된대로 시간 시리즈 설정하고 Z 스택 획득 매개 변수를 설정합니다. 이미지를 수집하기 시작 획득 탭​​에서 &quot;시작 실험&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 이 안정적이고 의식이 있는지 확인하기 위해 촬영하는 동안 마우스를 모니터합니다. 마우스가 촬영 중에 불안정 및 / 또는 의식이있는 경우, 무대에서 마우스를 제거 복강 마취 솔루션의 추가로 100 ~ 150 μl를 주입하고, 영상을 계속합니다. 참고 : 불안의 징후가 빠른 호흡과 획득 된 영상에서 아티팩트를 변화로 볼 수있다 마우스의 움직임을 포함한다. </li><li> 이미지 수집 한 후, 단계 떨어져 마우스를 가지고 케이지로 돌아갑니다. 따뜻하게 유지하고, 의식 때까지 마우스를 모니터링하는 가열 램프를 사용한다. </li></ol> 3. 이미지 분석 및 정량화 <ol><li> 3 차원 및 시계열 데이터를 분석하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 소프트웨어를 열고&quot;아레나&quot;보기라고 열려있는 화면으로 드래그하여 이미지를 추가 할 수 있습니다. 를 열 수있는 이미지 파일을 더블 클릭; 이미지가 &quot;능가&quot;보기에서 열립니다. </li><li> 2 차원 / 3 차원 이미지를 만듭니다. <ol><li> 오른쪽 상단에있는 &quot;추가&quot;줄에서 &quot;디스플레이 조정&quot;창을 엽니 다 &quot;편집 /보기 표시 조정&quot;을 클릭합니다. 각 채널에 대한 임계 값을 조정함으로써, 형광 표시를 최적화하며, 이미지를 저장하는 스냅 샷. </li></ol></li><li> 시간 경과 이미지를 사용하여 개체 트랙을 생성합니다. <ol><li> 이미지를 엽니 다하는 &quot;능가&quot;보기에 따라 분석한다. 은 &quot;능가&quot;아이콘 아래에있는 오렌지 도트의 이미지와 아이콘을 클릭합니다. 이 새로운 &quot;관광 명소&quot;창이 열립니다. </li><li> &quot;(시간 이상) 트랙 스포트를&quot;오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. &quot;소스 채널&quot;에서 추적 할 개체를 포함하는 채널을 선택하고, 추정 된 개체 diamet 설정에 숫자를 입력하여 &quot;예상 XY 직경&quot;에서 어입니다. 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. 참고 : 호중구 추적의 경우, 호중구에 대한 APC 형광을 포함하는 채널을 선택하고 호중구의 알려진 크기에 따라 12 μm의 객체 직경을 설정합니다. </li><li> 창에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 &quot;품질&quot;필터를 선택합니다. 소프트웨어에 의해 정의 된 지점을 관찰하고 포함하거나 지점을 제외 수동으로 임계 값을 조정합니다. 임계 값이 정의되면, &quot;추적&quot;단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. </li><li> 알고리즘에서 찾아 아래쪽 화살표를 클릭하여 &quot;회귀 모션 알고리즘&quot;을 선택합니다. &quot;최대 간격 크기&quot;에 대한 &quot;최대의 거리&quot;에 대한 10 μm의 3 유형 매개 변수 아래에 있습니다. 추적을 시작하려면 &quot;모든 탐지 된 개체와 격차를 채우기&quot;오프 확인하고 다음 단계로 이동 파란색 화살표를 클릭합니다. 주 : &quot;회귀 모션 알고리즘&quot;F를 사용또는 이전 운동에서 예측 된 위치에 따라 트랙을 생성하기 때문에, 운동을 지시 한 개체입니다. &quot;최대 거리&quot;와 &quot;최대 간격 크기&quot;추적뿐만 아니라, 시간 경과 이미지의 전체 지속되는 예상 치수 오브젝트의 속도에 따라 조정될 수있다. </li><li> 필터 유형에서 &#39;추적 기간 &quot;필터를 선택합니다. 추적을 완료하고, 생성 된 트랙을 확인하기 위해 녹색 화살표를 클릭합니다. 수동으로 트랙을 정렬 할 필요하면 이전 단계로 돌아갑니다. </li></ol></li><li> 번역 드리프트에 대한 올바른 생성 된 시간 경과 이미지 드리프트, 경우. <ol><li> 연필의 이미지로 아이콘을 클릭합니다. 이것은 &quot;편집 트랙&quot;창을 엽니 다 편집 탭입니다. 시간 경과 이미지를 검사하고 모든 이미지를 이동하지 않아야 참조 지점을 찾을 수 있습니다. </li><li> 화면의 왼쪽 상단 모서리에서 &quot;포인터&quot;창을 찾아 오프 확인 용돈을 활성화하기 위해 &quot;선택&quot;자리를 선택하는 rsor. 기준 지점을 클릭합니다. </li><li> &quot;편집 트랙&quot;창에서 &quot;올바른 드리프트&quot;를 클릭합니다. &quot;번역 상 드리프트&quot;를 해제하십시오. 이 소프트웨어는 자동으로 이미지를 보정 시리즈를 생성합니다. </li></ol></li><li> 시간 경과 영상에서 객체 추적에 의해 정의 된 세포의 움직임을 측정한다. <ol><li> &quot;편집 트랙&quot;창에서 &quot;트랙&quot;오프 확인하고 세포의 움직임을 나타내는 트랙을 선택합니다. 선택한 트랙은 시계열 이미지에서 노란색으로 강조 표시됩니다. </li><li> 은 &quot;통계&quot;창 (통계 탭) 열 그래프의 이미지로 아이콘을 클릭합니다. </li><li> &quot;선택&quot;에서 트랙 속도가 선택한 트랙에 대한 의미 생성 아래쪽 화살표를 클릭하여 &quot;트랙 속도 평균&quot;을 선택합니다. 다른 트랙을 선택하고 트랙 속도가 관심의 모든 세포에 대한 의미 측정하는 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol>

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J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), (2013).</li><li>Koewler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Monoclonal+Antibody+Raised+Against+Nerve+Growth+Factor+on+Skeletal+Pain+and+Bone+Healing+After+Fracture+of+the+C57BL/6J+Mouse+Femur.">Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur.</a> J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system.">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genetics.">Mouse Genetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

실시간 골수에서 동적 세포 과정의 일련 촬상 그렇지 같은 조직학 총 혈구와 같은 종래 기술을 이용하여 수득 도전 정보를 제공한다. 여기에 설명 된 대퇴골 WC 모델은 시간에 따른 골수 세포 및 구조적 변화를 조사하는 독특한 기회를 제공한다. 대퇴골의 WC 모델은 이전에보고되었지만, 우리의 새로운 디자인 성인 마우스에 사용하기위한 더 호환도 작아 WC 전체 크기의 큰 이미지 필드를 제공한다....

골수는 조혈 및 면역 조절에 관여하는 중요한 기관이다. 이는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)를 함유하는 성분으로 구성 조혈 및 중간 엽 세포 하나를 야기 비 조혈 전구 세포를 포함하는 기질 성분. 조혈 활동 3 분의 2는 골수 세포 2의 생성에 전념하고 있습니다. 1-2 × 10 11 세포는 정상적인 인간 성인이 하루 당 생성에 특히 호중구의 다수는 골수에서 생성된다. 호중구는 미생물 감염에 대한 방어의 첫 번째 줄에있는 스트레스가 주변 호중구 1,3-을 보완하기 위해 자신의 동원을 트리거 할 때까지 주로 골수에서 예약되어 있습니다. 그 항균 효과에 더하여, 최근의 연구에 따라 바뀌는 성장 프로 및 항 종양 표현형 모두 갖는 암 생물학에서 호중구의 주요 역할을 시사종양 미세 환경의 4,5에 신호 인자 베타 (TGF-β). 또한, 연구는 순환 호중구 세포 독성, 항 전이 효과를 발휘하면서 8 차 종양에 축적 호중구, T 세포의 세포 독성 -6,7- 기능을 억제함으로써 프로 종양 및 전이성 영향을 미치는 것을 설명했다. 이와 같이, 골수의 조혈 세포, 특히 호중구의 조사가 종양 면역 조절의 역할을 밝히기에 중요하다. 조직 병리학 및 전체 말초 혈액 카운트는 정기적으로 골수 구 셀룰러 및 구조적 변화를 평가하기 위해 사용된다. 그러나, 이들 방법은 단지 다른 세포 집단 또는 조직의 미세 구조의 정적 인 정보를 제공한다. 생체 내 이미징 종 세포에서 C뿐만 아니라 여러 세포, 혈관 및 간질 성분의 동역학을 평가하기 위해 표준 방법을 병용 할 수있다길이 방식으로 엘 상호 작용. 미세한 분해능 10 살아있는 동물의 생체 내에 촬상 정의 현미경 (IVM)는, 동일한 샘플 시간에 걸쳐 동적 세포 과정을 평가할 필요 실험 동물의 수를 감소하는데 특히 유용하다. IVM은 종종 주 개월의 기간에 걸쳐 이미징 관심의 기관에 액세스 할 수있는 만성적 이식 윈도우 실 (WC)와 결합된다. 두개골과 지​​느러미 - 피부 집계 WC 모델은 다시 1990 년대 중반까지 거슬러 올라가는 사용의 긴 역사를 가지고 있습니다. 최근 이러한 유방 지방 패드 및 다양한 복부 장기의 것과 다른 기관 특이 WC 모델 (11)이 개발되었다. 생체 내에서 골수 이미징의 일반적인 접근 방식은 얇은 뼈가 최소한의 수술 적 치료 12-14 단일 세포의 직접 시각화를 가능하게 마우스의 덮개 뼈, 주로 참여 노출을 보유하고 있습니다. 그러나, 두개골 골수 ㄱ 수도E HSPCs (15)의 유지 보수 및 개발 감소 나타낸다의 두개골에 HSPCs 저산소 세포의 낮은 숫자에 의해 입증 된 바와 같이, 이러한 긴 뼈 다른 뼈의 구별. 따라서, 긴 뼈의 세포 구성 요소를 평가하기위한 다른 방법을 조사하고 있습니다. 다음은 대퇴 골수 (16)의 직접적인 노출과 등쪽 피부 집계 WC (17)의 분할 대퇴골의 이소성 이식을 포함한다. 그러나, 전자는 더 긴 기간에 걸쳐, 셀룰러 구조적 및 기능적 변화를 추적하는 것을 허용하지 않는 터미널 절차이고, 후자의 가능성 때문에 등쪽 피하 지방 WC 내부 자궁외 사이트 대퇴골 이식 정상적인 골수 기능을 방해한다. 시간이 지남에 따라 대퇴골 골의 소성을 연속 촬영을 가능하게하는 또 다른 방법은 대퇴골의 WC의 사용이다. 하나의 이전 보고서는를 사용하여 대퇴 골수 미세 장기 영상을 보여쥐 18 WC를 대퇴골. 또한 저자는 모니터링 골수 전이에서의 유틸리티를 나타내는 대퇴골에서 종양 세포의 가시화를 보여 주었다. 그러나,이 WC 설계가 큰 마우스 (26-34g 나이 3-6 개월)에만 적합했다 대형 사이즈 (1.2 cm 직경)과 상대적으로 작은 이미징 영역 (4mm 직경)에 의해 제한되었다함으로써 제조 일상적인 사용을위한 실용적 접근. 따라서, 작은 전체 크기 새로운 WC 큰 내부 이미징 영역이 연구의 목적으로 설계되었다. 본 연구의 목표는 대퇴골 골 다양한 세포 유형을 묘화 방법을 제공하는 것이다. 대퇴골의 WC 모델은 자체 개발하고, 3D 혈관 네트워크 내에서 호중구를 시각화하고 추적하는 데 사용되었다. 이 모델을 이용하여, 골수 IVM 40 일간 연속적으로 수행 할 수있다. 이 방법은 면역 조절 A를 조혈 과정의 해명을위한 다양한 분야에 적용될 수있다차 종양 개발.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NRCNU-F athymic nude mice</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>Ncr nude</td>
			<td>8-10 weeks old, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1302P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&#160;</td>
			<td>DIN 01989529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td>
			<td>DIN 02169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Proxima</td>
			<td>DYNJP2405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Life Brand</td>
			<td>57800827375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (tear gel)</td>
			<td>Novartis&#160;</td>
			<td>T296/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>GreenField</td>
			<td>P010IP7P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-150-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle (#3)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (#15)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors curved</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-Mixter Hemostat</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill</td>
			<td>Harvard Apparaus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill burrs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femur window chamber</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped bar</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (8mm)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>HBIO 64-0701 CS-8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring (8mm)</td>
			<td>ACKLANDS GRAINGER</td>
			<td>UNSPSC # 31163202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts (hexagon stainless steel)</td>
			<td>Fastenal</td>
			<td>70701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>3M</td>
			<td>RelyX U200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 Monosof black)</td>
			<td>Covioien</td>
			<td>SN-5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12501-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>DIN 0281251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>DIN 02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin (Clamavox)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02027879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 710 NLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging stage</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris 8.0</td>
			<td>Image analysis software described in Section 3 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

쥐 대퇴골 골 성공적 개별 호중구 및 혈관 네트워크의 시각화를 활성화 WC를 사용하여 액세스된다. 하나의 WC 구를 도시하고 내부 광 액세스하는 대퇴골과 피질골의 박형화의 노광을 수반 수술을 설명 도표 뼈. 수술은 생쥐에서 잘 허용된다 그들은 고통없이 보고서와 같은 오일 수술 후의 화장실에 뒷다리의 부종, 비 체중이 다리에 베어링, 자기 ?...

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

8.1K 조회수.  Princess Margaret Cancer Centre. The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

비디오: Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

초파리 번데기 내에서 염증 성 세포 역학의 장기 Vivo에서 추적

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

대한 대퇴골 창 회의소 모델

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