Los autores desean agradecer al Fondo para Microscopía Óptica Avanzada (www.aomf.ca) en la Red de Salud de la Universidad para obtener ayuda con la microscopía, y el Sr. Jason Ellis de la princesa Margarita Centro de Cáncer de máquinas para la fabricación del WC y la etapa de formación de imágenes. También nos gustaría agradecer al Dr. Iris Kulbatski para la edición de manuscritos.

NOTA: Todo el trabajo con animales se llevó a cabo bajo el protocolo # 2615 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Health Network. 1. Preparación quirúrgica de ratón <ol><li> Antes de la cirugía, esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y la cámara de ventana (WC) por tratamiento en autoclave. Complementar el agua potable con 50 mg / kg de peso corporal de amoxicilina 2 días antes de la cirugía. Inyectar el ratón con 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por vía intraperitoneal 4 h antes de la cirugía. </li><li> Anestesiar el ratón nude atímicos mediante inyección intraperitoneal de solución salina 350-400 l que contiene 80 mg / kg de ketamina y 13 mg / kg de xilazina (Nota: Esto fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional, y no hemos tenido ninguna experiencia con los efectos adversos ). Confirmar la anestesia adecuada mediante pruebas de reflejo del pie. Para continuar observando el patrón respiratorio, color de las mucosas y el reflejo del pie durante el procedimiento. </li><li> Realice la pr quirúrgicaocedures bajo una campana de bioseguridad para mantener condiciones estériles durante la cirugía. Coloque el ratón sobre una manta eléctrica cubierto con un paño quirúrgico para mantener la temperatura del cuerpo durante la cirugía. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo el microscopio estereoscópico. </li><li> Aplicar ungüento para los ojos para mantener los ojos húmedos durante la cirugía. Repetir si es necesario durante el procedimiento quirúrgico. Esterilizar la zona de funcionamiento del ratón limpiando con un 7,5% de povidona yodada, el 70% de alcohol isopropílico y 10% de povidona yodada en forma consecutiva, y repetir este procedimiento dos veces. </li><li> Hacer una incisión en la piel longitudinal 10 mm usando escalpelo con una cuchilla (# 15), se acerca el fémur desde el lado lateral. Exponer el fémur entre los músculos flexores y extensores mediante disección roma con unas pinzas hemostáticas y para asegurar la funcionalidad muscular. </li><li> Inserte la barra en forma de U por debajo del hueso, e instalar el WC (Figura 1). Asegurar la barra con la ventana con dos tuercas y apriete las tuercas porceps. Llenar el espacio entre el hueso y el WC con cemento dental. </li><li> Triturar el hueso cortical en una región 6 x 2 mm 2 con un micro-taladro para tener acceso óptico a la cavidad ósea. Nota: Inspeccione cuidadosamente el adelgazamiento del hueso cortical bajo el microscopio, mientras que la realización de este procedimiento. Deja una capa de periostio intacto, casi transparente del hueso. </li><li> Coloque el cubreobjetos 8 mm en la ventana, y asegurar el cubreobjetos con un anillo de retención para mantenerlo en su lugar. </li><li> Reajuste la musculatura de los músculos flexores y extensores de la espalda a sus ubicaciones originales mediante el uso de fórceps para mantener su función después de la cirugía. Suturar la dermis utilizando 5-0 sutura y un soporte de aguja. </li><li> Monitorear el ratón para la recuperación, hasta que está consciente y es capaz de moverse libremente. Poner el animal en una jaula nueva cuando se recuperan. </li><li> Después de la recuperación, realice la adquisición de imágenes en el animal en el mismo día o los días siguientes (véase la sección 2). Supervisar el physicondición de cal del ratón diaria. Nota: Monitorear las condiciones físicas, tales como la carga de peso en el miembro, encorvando, rápida o poco profunda respiración, hinchazón de las extremidades posteriores, la automutilación, celulitis y dermatitis severa. </li><li> Dar la inyección intraperitoneal de 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina durante 3 días, y 1 mg / kg de peso corporal de meloxicam durante 5 días después de la cirugía para el tratamiento de dolor post-quirúrgico y la inflamación. Continuar proporcionando el agua amoxicilina-complementado por 5 días. </li><li> En el punto final experimental, la eutanasia a los animales por CO 2 narcosis seguido de un método secundario (por ejemplo, la dislocación cervical). </li></ol> 2. Adquisición de imágenes por Combinada multi-fotón y microscopía confocal <ol><li> Antes de la formación de imágenes, anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de una solución salina 350 a 400 l que contiene 80 mg / kg de ketamina y 13 mg / kg de xilazina. Como alternativa, utilice anestésico inhalable, cuando esté disponible.Aplicar ungüento para los ojos. </li><li> Inyectar la mezcla de colorantes intravasculares para vasculatura etiquetado (0,65 mg de 2 MDa de fluoresceína (FITC) dextrano) y los neutrófilos (4 g de aloficocianina (APC) de anticuerpo-Ly6G -anti). </li><li> Utilice un multi-fotón vertical combinada y el microscopio confocal equipado con un láser de múltiples fotones que van desde 705 hasta 980 nm para la excitación de dos fotones, así como láseres de fotones individuales que proporciona longitudes de onda de excitación de azul a rojo. </li><li> Establecer una etapa de formación de imágenes a medida en el microscopio (Figura 1B). Asegure el ratón en la etapa de sujeción por los dos extremos del WC con pinzas de cocodrilo. Nota: Los componentes críticos de la etapa son: dos pinzas de cocodrilo para mantener el aseo, y un elemento de calefacción para mantener la temperatura fisiológica (37 ° C) del ratón durante la exploración. </li><li> Encienda el láser de dos fotones y el sistema confocal, y poner en marcha el software de adquisición de la imagen haciendo clic en &quot;Inicio del sistema&quot;. Una ventana con 4 pestañas (Localizar,Adquisición, procesamiento, y Mantener) se abrirá. </li><li> Configurar los canales de imagen. Haga clic en &quot;Configuración inteligente&quot; en la pestaña de Adquisición y elegir los colorantes que se utilizarán para la imagen: FITC (488 nm de excitación, 493 a 588 nm de emisión) y APC (633 nm de excitación y 638 a 743 nm de emisión). Elija &quot;mejor señal&quot; y haga clic en &quot;Aplicar&quot;. </li><li> Añadir el segundo canal de adquisición de imágenes generación armónica (SHG) manualmente. Encienda el láser de dos fotones debajo de la ventana &quot;láser&quot; en la pestaña de Adquisición. Bajo la ventana de Canales, haga clic en el signo &quot;+&quot; para añadir una pista. </li><li> Configure la pista SHG. Cambiar la longitud de onda de 840 nm bajo la ventana de canales con las flechas hacia arriba y hacia abajo, y elegir el rango de detección para ser 415-425 nm bajo la ventana &quot;Light Path&quot; usando la barra deslizante. </li><li> Haga clic en &quot;oculares en línea&quot; en la pestaña Buscar. Haga clic FITC con la configuración de filtro para FITC para ver la región de interés y ajustar el enfoque manualmente girando tque se centran perilla en el lado del microscopio. Cuando se encuentra la región de interés, haga clic en &quot;oculares fuera de línea&quot; en la pestaña Buscar. </li><li> Haga clic en la ficha Adquisición. Seleccionar la pista FITC bajo la ventana Canales y hacer clic en &quot;vivo&quot; para previsualizar la imagen de FITC-dextrano, con el objetivo de 5X. Ajuste el enfoque si es necesario, y haga clic en &quot;Stop&quot; en la pestaña de Adquisición para detener la vista previa. </li><li> gire manualmente a 20X objetivo agua moviendo una rueda por encima de los lentes. Ver la imagen de nuevo por FITC-dextrano usando el objetivo 20X, y ajuste maestro de ganancia y del agujero de alfiler bajo la ventana de canales para lograr la señal y un contraste óptimo. Repita para otros canales mediante la selección de APC y los grupos de autoayuda pistas debajo de la ventana Canales. </li><li> Elija los parámetros de imagen. Haga clic en &quot;Modo de adquisición&quot; para abrir su ventana. Ajuste el tamaño del cuadro sea 1.024 x 1.024 píxeles, y el promedio de 4X para obtener imágenes de alta calidad. </li><li> Adquirir una instantánea 2D. Seleccionar todos los canales bajo Canales gananDow y haga clic en &quot;Snap&quot; en la pestaña de Adquisición. Comprobar la calidad de la imagen y cambiar los parámetros de imagen si es necesario. </li><li> Adquirir imagen de lapso de tiempo 2D. <ol><li> Marque &quot;series de tiempo&quot; en la pestaña de Adquisición para abrir la ventana de series temporales. Escriba 0 en virtud de los intervalos, y 40 para el número total de exploraciones para tomar 40 imágenes continuas sin intervalo de tiempo. Nota: 40 exploraciones genera aproximadamente 5 minutos largo de series de tiempo con una velocidad de barrido de 7,5 seg / bastidor y el tamaño de la imagen de 600 micras x 600 micras. Ajuste el intervalo y número de análisis en función del microscopio, la configuración de adquisición de imágenes y la velocidad de cuadros de la cámara. Un intervalo de tiempo fijo (&gt; 0 seg) se puede usar para comparar las imágenes con lapso de tiempo adquiridos en diferentes puntos temporales. Una duración de imagen de lapso de tiempo más largo puede ser necesario en función de la velocidad media esperada de los neutrófilos (u otras células de interés) en la condición experimental. </li></ol></li><li> Adquirir imagen en 3D.<ol><li> Marque &quot;Z-Stack&quot; en la pestaña de Adquisición para abrir la ventana de Z-Stack. Iniciar el modo de vista previa &quot;en vivo&quot; de FITC-dextrano. Se centran en la parte superior de la muestra y haga clic en &quot;Set primero&quot;, y se centran en el otro extremo de la muestra y haga clic en &quot;Último conjunto&quot; en la ventana de Z-pila. </li><li> Establecer el intervalo a ser de 10 micras bajo la ventana de Z-pila. Dependiendo de la primera y la última rebanada óptico seleccionado en el paso anterior, esto generará 10-20 rebanadas, con espesor óptico global de 90 a 180 micras. Nota: El intervalo z-pila depende del tamaño de la del agujero de alfiler, que determina el espesor de la rebanada óptica. Ajuste el intervalo de ser menor que el espesor de la rebanada de óptica. </li><li> Haga clic en &quot;Experimento de inicio&quot; en la pestaña de adquisición para iniciar la recopilación de imágenes. </li></ol></li><li> Adquirir imagen de lapso de tiempo 3D. <ol><li> Marque &quot;Time Series&quot; y &quot;Z-pila&quot; en la pestaña de Adquisición para abrir la serie temporaly las ventanas Z-pila. </li><li> Creó la serie de tiempo y parámetros de adquisición de pila Z como se describe en los pasos 2.14 y 2.15. Haga clic en &quot;Experimento de inicio&quot; en la pestaña de adquisición para iniciar la recopilación de imágenes. </li></ol></li><li> Monitorear el ratón durante la formación de imágenes para asegurarse de que es estable e inconsciente. Si el ratón es inestable y / o consciente durante la exploración, quite el ratón desde el escenario, inyectar 100-150 l adicional de la solución anestésica por vía intraperitoneal, y continuar imágenes. Nota: Los signos de inestabilidad incluyen respiración rápida y el movimiento del ratón, que puede ser visto como el cambio artefactos en las imágenes adquiridas. </li><li> Después de la adquisición de imágenes, tomar el ratón fuera del escenario y devolverlo a la jaula. Utilice una lámpara de calentamiento para mantener el calor, y controlar el ratón hasta que esté consciente. </li></ol> Análisis de Imagen y 3. Cuantificación <ol><li> Utilice el software de análisis de imágenes para analizar los datos en 3D y de series de tiempo. Abra el programa yañadir imágenes arrastrándolas a la pantalla abierta, que se llama punto de vista &quot;Arena&quot;. Haga doble clic en un archivo de imagen para abrirla; la imagen se abrirá bajo la vista &quot;Supera&quot;. </li><li> Crear una imagen de 2D / 3D. <ol><li> En la barra de &quot;Más&quot; que se encuentra en la esquina superior derecha, haga clic en &quot;Editar / exhibición de la demostración de ajuste&quot; para abrir &quot;de ajuste de visualización&quot; de la ventana. Optimizar la visualización de fluorescencia mediante el ajuste de los umbrales para cada canal, y tomar una instantánea para guardar la imagen. </li></ol></li><li> Generar pistas de objetos a partir de imágenes con lapso de tiempo. <ol><li> Abra la imagen que se analiza en la vista &quot;Supera&quot;. Haga clic en el icono con una imagen de puntos de color naranja, que se encuentra debajo del icono &quot;Supera&quot;. Esto abrirá una nueva ventana &quot;Spots&quot;. </li><li> Marque &quot;de los puntos de pista (en el tiempo)&quot; y haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso. Seleccione el canal que contiene los objetos para realizar un seguimiento en &quot;Channel Fuente&quot;, y establecer el objeto Diamet estimadoer en &quot;XY diámetro estimado&quot; escribiendo un número en. Haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso. Nota: Para el seguimiento de los neutrófilos, seleccionar el canal que contiene APC de fluorescencia para los neutrófilos y establecer el diámetro objeto a 12 micras sobre la base del tamaño conocido de neutrófilos. </li><li> En la ventana, buscar y seleccionar el filtro &quot;Calidad&quot; haciendo clic en la flecha hacia abajo. Observe los puntos definidos por el software y ajustar el umbral manualmente para incluir o excluir puntos. Una vez que se define el umbral, haga clic en la flecha azul para ir a la &quot;Pista&quot; paso. </li><li> Conforme al algoritmo, buscar y seleccionar &quot;Autoregresivo Movimiento Algoritmo&quot; haciendo clic en la flecha hacia abajo. Tipo de 10 micras para &quot;Distancia máxima&quot; y 3 para &quot;Tamaño máximo de Gap&quot; que se encuentra en Parámetros. Marque &quot;Rellenar los huecos con todos los objetos detectados&quot; para iniciar el seguimiento, y haga clic en la flecha azul para ir al siguiente paso. Nota: &quot;algoritmo de movimiento Autoregresivo&quot; se utiliza fu objetos que han dirigido el movimiento, ya que genera pistas basados ​​en localización predicha por el movimiento anterior. &quot;Max Distancia&quot; y &quot;Tamaño Max Gap&quot; puede ser ajustada en función de la dimensión esperada y la velocidad del objeto que está siendo rastreado, así como la duración total de la imagen de lapso de tiempo. </li><li> Bajo Tipo de filtro, seleccione el filtro &quot;Duración total&quot;. Haga clic en la flecha verde para finalizar el seguimiento, y comprobar las pistas que se han generado. Volver al paso anterior si es necesario para ordenar manualmente las pistas. </li></ol></li><li> Si las derivas de imágenes con lapso de tiempo generados, corregir la deriva de la traducción. <ol><li> Haga clic en el icono con una imagen de un lápiz. Se trata de una pestaña de edición que se abre &quot;Edición de Pistas&quot; ventana. Examinar la imagen de lapso de tiempo y encontrar un punto de referencia que no debe estar en movimiento para todas las imágenes. </li><li> En la esquina superior izquierda de la pantalla, encontrará ventana &quot;Puntero&quot; y marque &quot;Seleccionar&quot; para activar el cursor para la selección de un punto. Haga clic en el punto de referencia. </li><li> Haga clic en &quot;Drift correcta&quot; en la ventana &quot;Editar pistas&quot;. Marque &quot;traslacional Drift&quot;. El software generará automáticamente la serie corregida de imágenes. </li></ol></li><li> Medir el movimiento celular definido por las pistas de objetos en imágenes con lapso de tiempo. <ol><li> Bajo la ventana &quot;Editar pistas&quot;, marque &quot;Tracks&quot; y seleccione una pista que representa el movimiento de una célula. La pista seleccionada se resalta en amarillo en la imagen de series de tiempo en. </li><li> Haga clic en el icono con una imagen de un gráfico para abrir la ventana (pestaña estadísticas) &quot;estadísticas&quot;. </li><li> En &quot;Selección&quot;, seleccionar &quot;Track velocidad media&quot; haciendo clic en la flecha hacia abajo para generar significa que la velocidad de la pista para la pista seleccionada. Elegir diferentes pistas y repita los pasos para medir significa que la velocidad de la pista para todas las células de interés. </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genetics.">Mouse Genetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

En tiempo real, de imágenes en serie de los procesos celulares dinámicos en la médula ósea proporciona información que de otro modo un reto para obtener usando técnicas convencionales tales como la histología y los recuentos sanguíneos totales. El modelo WC fémur descrito aquí ofrece oportunidades únicas para investigar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea con el tiempo. Aunque un modelo de fémur WC se ha informado anteriormente, nuestro nuevo diseño proporciona un campo de la imag...

La médula ósea es un órgano importante que participa en la hematopoyesis y la regulación inmune. Se compone de un componente hematopoyético que contiene las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs), y un componente del estroma que contiene células progenitoras no hematopoyéticas que dan lugar a células mesenquimales 1. Dos tercios de la actividad hematopoyética se dedica a la generación de células mieloides 2. En particular, un gran número de neutrófilos se producen en la médula ósea, con 1-2 x 10 11 células generadas por día en un ser humano adulto normal 2. Los neutrófilos son la primera línea de defensa contra las infecciones microbianas y son en su mayoría reservados en la médula ósea hasta que el estrés desencadena su movilización para complementar los neutrófilos periféricos 1,3. Además de sus efectos anti-microbianos, estudios recientes sugieren un papel importante de los neutrófilos en la biología del cáncer, que tiene tanto pro- y anti-fenotipos tumorigénicos en función de crecimiento transformantefactor beta (TGF-β) de señalización en el 4,5 microambiente tumoral. Por otra parte, los estudios demostraron que los neutrófilos que se acumulan en los tumores primarios ejercen efectos pro-tumorigénicas y metastásicas mediante la supresión de la función citotóxica de las células T 6,7, mientras que los neutrófilos en circulación ejercen un efecto citotóxico anti-metastásico 8. Como tal, la investigación de las células hematopoyéticas en la médula ósea, en particular los neutrófilos, es crucial para la aclaración de su papel en la regulación inmune y tumor. Histopatología y un recuento completo de sangre periférica se utilizan habitualmente para evaluar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea 9. Sin embargo, estos métodos sólo proporcionan información estática de diferentes poblaciones de células o de tejidos microestructuras. Longitudinal de imágenes in vivo se puede utilizar en combinación con los métodos estándar para evaluar la dinámica de múltiples componentes celulares, vasculares y del estroma, así como la célula a-cell interacciones de manera longitudinal. Microscopía intravital (IVM), definido como formación de imágenes de animales que viven en la resolución microscópica 10, es particularmente útil para la evaluación de los procesos celulares dinámicos en el tiempo en la misma muestra, lo que reduce el número de animal experimental requerido. IVM se combina a menudo con una cámara de ventana trasplantado crónicamente (WC) para acceder al órgano de interés para obtener imágenes de más de una duración de semanas a meses. modelos WC craneal y dorsal-pliegue de la piel tienen la más larga historia de uso se remonta a mediados de la década de 1990. Más recientemente, otros modelos de WC de órganos específicos, tales como las de la almohadilla de grasa mamaria y varios órganos abdominales se han desarrollado 11. El enfoque típico para obtener imágenes de la médula ósea in vivo tiene la exposición participa principalmente de la bóveda craneal de ratones, donde el hueso adelgazada permite la visualización directa de las células individuales con una intervención quirúrgica mínima 12-14. Sin embargo, la médula ósea de calota puede be distinta de la de otros huesos, tales como el hueso largo, como se demuestra por un menor número de HSPCs y células hipóxicas en bóveda craneal, lo que indica mantenimiento y desarrollo de HSPCs 15 reduce. Por lo tanto, se han investigado enfoques alternativos para evaluar los componentes celulares en el hueso largo. Estos incluyen la exposición directa de la médula ósea del fémur 16 y el trasplante ectópica de fémur fractura en el pliegue cutáneo dorsal 17 WC. Sin embargo, el primero es un procedimiento del terminal que no permite el rastreo de alteraciones celulares, estructurales y funcionales durante períodos de tiempo más largos, y el segundo probable perturba la función normal de la médula ósea debido a el trasplante de fémur a un sitio ectópico en el interior del WC dorsal del pliegue cutáneo. Otro método que permite formación de imágenes de serie ortotópico de médula ósea femoral en el tiempo es el uso de un WC en el hueso femoral. Un informe anterior demostró imágenes a largo plazo de la microcirculación en la médula ósea del fémur usando unaWC fémur en ratones 18. Adicionalmente, los autores demostraron la visualización de las células tumorales en el fémur, lo que indica su utilidad en la metástasis ósea de monitoreo hueso. Sin embargo, este diseño WC estaba limitado por su gran tamaño (1,2 cm de diámetro) y área de imagen relativamente pequeña (4 mm de diámetro), que fue sólo es adecuado para los ratones grandes (26 a 34 g, de 3-6 meses de edad) con lo que el acercarse poco prácticos para su uso rutinario. Por lo tanto, un nuevo WC con un tamaño general más pequeño y el área de formación de imágenes interno más grande fue diseñada con el propósito de este estudio. El objetivo de este estudio era proporcionar un método para obtener imágenes de diversos tipos de células en la médula ósea femoral. El modelo WC fémur fue desarrollado internamente y se utiliza para visualizar y realizar un seguimiento de los neutrófilos dentro de la red vascular 3D. Usando este modelo, IVM de la médula ósea se puede realizar en serie de más de 40 días. Este enfoque se puede aplicar a una variedad de campos para elucidar los procesos de la hematopoyesis, la regulación inmune unand el desarrollo de tumores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NRCNU-F athymic nude mice</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>Ncr nude</td>
			<td>8-10 weeks old, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1302P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&#160;</td>
			<td>DIN 01989529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td>
			<td>DIN 02169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Proxima</td>
			<td>DYNJP2405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Life Brand</td>
			<td>57800827375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (tear gel)</td>
			<td>Novartis&#160;</td>
			<td>T296/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>GreenField</td>
			<td>P010IP7P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-150-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle (#3)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (#15)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors curved</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-Mixter Hemostat</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill</td>
			<td>Harvard Apparaus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill burrs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femur window chamber</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped bar</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (8mm)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>HBIO 64-0701 CS-8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring (8mm)</td>
			<td>ACKLANDS GRAINGER</td>
			<td>UNSPSC # 31163202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts (hexagon stainless steel)</td>
			<td>Fastenal</td>
			<td>70701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>3M</td>
			<td>RelyX U200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 Monosof black)</td>
			<td>Covioien</td>
			<td>SN-5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12501-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>DIN 0281251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>DIN 02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin (Clamavox)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02027879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 710 NLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging stage</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris 8.0</td>
			<td>Image analysis software described in Section 3 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Murino médula ósea femoral se accede con éxito utilizando el WC para permitir la visualización de los neutrófilos individuales y redes vasculares. La figura 1 muestra el instrumento WC y se describe el procedimiento quirúrgico, que consiste en la exposición del hueso femoral y el adelgazamiento de hueso cortical para obtener acceso óptico dentro de la hueso. La cirugía es bien tolerado en ratones; que se evaluaron para las reacciones físicas adversas, tales com...

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

8.1K vistas.  Princess Margaret Cancer Centre. The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Video: Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

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