Besonderer Dank geht an Dr. Clare M. Waterman für Mentorship und Diskussionen, Michelle Baird und Mike Davidson für die in diesen Studien verwendet, um viele der fluoreszierenden cDNA-Konstrukte bieten, und Kathryn Applegate und Gaudenz Danuser für plusTipTracker MT-Analyse-Software zu entwickeln. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss zu KAM von der National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) und die National Institutes of Health (NIH). (Zuschuss: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mit HUVECs in Morphologie und Migration Experimente. Abbildung lebender Zellen von EB3-markierte MT Wachstumsdynamik innerhalb HUVECs erfordert angemessene und reproduzierbare Zellkulturbedingungen, um zu messen und zu bewerten Veränderungen in MT Wachstum und HUVEC Morphologie, so dass sie dann zu einem ECM-Signalisierungs Cue zugeordnet werden. HUVECs stellen ein hervorragendes Modell der Zellform und Beweglichkeit für das Studium. Sie sind sehr zugänglich für die Transfektion mit fluoreszenzmarkierten cDNAs sie dramatische Morphologien als Reaktion auf sowohl lösliche als auch physikalische Signal Cues aufweisen, und sie behalten die Fähigkeit , sich in vaskuläre Röhren zu organisieren , wenn 65-70 geeignete Zellkulturbedingungen zur Verfügung gestellt. Primäre Zellkulturen, wie HUVECs, erfordern eine sorgfältige Handhabung und Überwachung von Zellpassage Nummer, um die Zellen gesund sind, um sicherzustellen, und dass sie sich verhalten normalerweise während der Experimente. Wenn beispielsweise die Durchführung von Experimenten untersucht cytoskeleton und / oder die Zellmorphologie, HUVECs sollte nicht für Experimente über den zehnten Zellkulturdurchgang verwendet werden, wie HUVECs typischerweise beginnen ungleichmäßigen Morphologien herum Passage zwölf bis fünfzehn anzuzeigen. Zelldichte ist auch ein kritischer Regulator der HUVEC Gesundheit und Proliferation. HUVEC Verzweigung Untersuchungen (siehe Protokoll 10,1-10,4 oben) verwenden relativ niedrige Zelldichte Kulturen, um die Zellen physischen Raum zu schaffen, mit ihren ECM zu interagieren und verzweigte Vorsprünge zu verlängern. Im Gegensatz dazu ist der Migrationsforschung in der Wundrand (siehe Protokoll 10,5-10,8), HUVECs sind Kultur in einer Monoschicht vor der Verletzung. Als solche Wundrand HUVECs eine relativ unverzweigten Morphologie zeigen, erstrecken sich Kantenvorsprüngen führt, und zeigen Zell-Zell-Interaktionen mit ihren unmittelbaren Nachbarn, wie sie in die Wunde wandern. Caveats und Vorteile von Tracking-MT Dynamics in Wohn HUVECs. Spinning Disk-Mikroskopie ist ein ausgezeichneter Ansatztesten experimentelle Hypothesen, die konfokale Bildklarheit mit hoher Zeitauflösung erfordern. Mit der entsprechenden Kamera und Lasermodul dieser Mikroskopie Ansatz ist empfindlich gegenüber niedriger Emission Fluoreszenz und kann in reduzierten Photobleaching im Vergleich zu anderen Arten von Fluoreszenzmikroskopie unterstützen. Wichtig ist, dass dieser Ansatz auch gut für mittlere bis hohe Zeitauflösung Bildgebung geeignet, da zur Erzeugung umfassende Messungen von MT Wachstumsdynamik mit dem EB3 Label-Ansatz, in einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen erforderlich ist. Während die EB3 Methodik zur Etikettierung wachsenden MT Plus-Enden deutliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Fluoreszenzmarkierung MTs aufweist, hat es auch eindeutige Nachteile auf. Zum Beispiel gibt es einen Anteil des MT - Array , das zu einem gegebenen Zeitpunkt nicht aktiv wachsenden wird einschließlich sowohl der Population von Auseinanderbauen MTs und der Population von stabilen, nicht-dynamischen MTs 71-74. EB3 würde diese zwei Populationen von MTs nicht beschriften undDaher ist der Beitrag dieser beiden Populationen nicht in experimentellen Datenanalyse einbezogen werden. Alternative Methoden für die gesamte MT Array Auswertung wurden auf die Expression von fluoreszenzmarkierten Tubulin fokussiert, die in allen Populationen von MTs enthält und ermöglicht Identifizierung wachsen, schrumpfen, und stabile MTs. Jedoch wegen der relativ hohen Dichte des MT-Array in der Nähe der Mitte der Zelle und neben dem Mtoc (MTOC), das gesamte MT-Array Markierung erzeugt ein Nachteil bei der Durchführung der Bildanalyse von MT Enden, die nicht in der Nähe der Zelle Peripherie 75-77. Experimente unter Verwendung von Zweifarben - co-Markierung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin und fluoreszierende EB3 in lebenden Zellen haben gezeigt, qualitativ, dass die überwiegende Mehrheit der Tubulin-markiertem MTs auch EB3-markiertes 78. Darüber hinaus hat es kein effizientes Verfahren zur automatischen Verfolgung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin markiert worden. Dies bedeutet, dass die Daten KollHand Verfolgung einzelner MTs tion und Messungen der MT Dynamik in Zellen benötigen fluoreszierendes Tubulin exprimieren, ein Prozess, fehleranfällig und mühsam ist. Als Ergebnis hat die automatisierte Computeranalyse von EB3 markiertem MTs die bevorzugte Methode werden zur Messung MT Dynamik wie es Dynamik MT Experimente angewendet werden kann auf zahlreiche Zelltypen und in einer Vielzahl von experimentellen Regimen 35,79. Die Verknüpfung MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration. Aus der Sicht eines Zytoskelett Ermittler, eine äußerst nützliche Anpassung der plusTipTracker automatisierten Tracking-Analyse ist die Fähigkeit, sowohl ganze Zelle und regionale Veränderungen in MT Wachstumsdynamik zu messen und zu bewerten. Die Anforderung für eine Zelle polarisiert zu werden, ist eine wesentliche Voraussetzung für die Richtungszellmigration. Als solche haben polarisierte Signal Cues lange Schlüsselfaktoren für die gerichtete Zellmigration bekannt 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Beispielsweise lösliche Signalmoleküle wie VEGF Aktin - Polymerisation und MT Wachstum in Richtung der VEGF cue in endothelialen Zelltypen 2,82-87 induzieren. Zusätzlich kann in Reaktion auf physikalische Wechselwirkungen mit dem ECM (beispielsweise Compliance und Dimensionalität mechanosensing) modulieren HUVECs ihre MT Dynamik durch örtliches Regulieren MAPs MT Wachstum zu fördern verzweigten Vorsprünge innerhalb verlängernden, und dies dient HUVEC Migration in Richtung der Führung Stichwort 5,31,88. Somit Polarisation in Reaktion auf extrazelluläre Signalisierungs cues unterstreicht die Notwendigkeit für experimentelle Bewertung von lokalisierten Veränderungen in Zytoskelett-Dynamik. Gleichzeitige Live-Cell-Imaging von MT Wachstumsdynamik (mit dem EB3-Ansatz) und HUVEC Zellmigration ist extrem schwierig durchzuführen, weil MTs auf einer Zeitskala von Sekunden wachsen, während Veränderungen der Zellmorphologie und gerichtete Migration auf einer Zeitskala von Stunden auftreten. Doch beide Prozesse sind eng LINKEd. Außerdem führt kontinuierliche, schnelle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten EB3 auf der zweiten Zeitskala des EB3 Signal Photobleaching. Versuche, dieses Problem zu überwinden, indem kurze Abbildungsreihe EB3 (1-2 min Akquisitions Serie) alle 30 Minuten waren erfolgreich leitend, jedoch nur in einer kleinen Anzahl von ECs erreicht werden könnte, der eine optimale Expression EB3 hatte und daß keine nachteiligen haben anzuzeigen Auswirkungen auf wiederholte Laserbeleuchtung 5. Ein alternativer Ansatz, der für Interpretationen , wie MT Wachstumsdynamik beitragen zu Veränderungen der Zellmorphologie und Migration ermöglicht die plusTipTracker Region of Interest (ROI) Werkzeug 35 (siehe Protokoll 6.6). Diese Methode ermöglicht eine ganze Zelle MT Wachstum Spuren unterteilt in benutzerdefinierten Regionen zu sein, von dem Spuren MT Wachstum können dann extrahiert und analysiert werden. Beispielsweise Vergleiche von &quot;verzweigten&quot; versus &quot;nicht verzweigte&quot; Regionen der Zelle haben gezeigt, dass mehr MTs s wachsenNiedrigen und persistent innerhalb verzweigten Regionen im Vergleich zu dem nicht verzweigten Zellperipherie 5. In polarisiert Wundrand HUVECs, Vergleiche der Vorderkante und Hinterkante Wachstumsdynamik MT zeigte, dass MCAK-induzierte MT Demontage innerhalb der Vorderkante spezifisch gehemmt wird, aber nicht die Hinterkante. Regional Bewertung der Vorder- und Hinterkante MT Wachstumsdynamik in HUVECs exprimierenden Rac1 und / oder Phosphorylierung Mutanten von MCAK ergab ferner, dass Rac1-induzierte Aktivierung von Aurora-A-Kinase gezielt und lokal MCAK Aktivität innerhalb der Vorderkante verhindert HUVEC Polarisation und gerichtete Migration zu fahren 31. So hat die Kombination von automatisierten Verfolgung von MT Wachstumsdynamik und regionale Bewertung der MT Wachstumsdynamik innerhalb der verzweigten Vorsprünge und / oder der Vorderkante der Wundrand HUVECs erlaubt uns MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration zu verknüpfen. Die Protokolle beschrieben sind designed, um eine im Allgemeinen einfach und hoch reproduzierbare Methodik für HUVEC Kultur und experimentelle Untersuchung. Dennoch sind viele der Protokolldetails komplex und zeitaufwendig, was sich wiederum Gelegenheit für Fehler oder Schwierigkeiten stellt die experimentelle Methodik in der Durchführung. Während es wurde versucht, mögliche Probleme während des gesamten Protokolls, hier ist eine zusätzliche, detaillierte Fehlersuche von möglichen Problemen zur Verfügung gestellt, die weniger verbreitet sind oder in anderer Weise als Noten innerhalb der Methodik Protokolle abgekürzt. Bezogen auf Beschichtung Deck mit Polyacrylamid-Substrate (Protokoll 2.2), ein häufiges Problem, das Glasplättchen der Aktivierung ist die komplexe Natur entsteht, Kupplung Polyacrylamid auf das Glas, Aktivierung Polyacrylamid und dann ECM Kopplung mit dem Polyacrylamid. Ein besonders schwierig und möglicherweise problematischen Schritt wird die Kultivierung HUVECs auf die Fibronektin / Polyacrylamid-Gel nach der Exposition des polyacrylamide-beschichtete Deckgläser bis 2 mM Sulfo-SANPAH (Schritt 2.2.2.6, oben). Es ist entscheidend für den Erfolg von HUVECs auf diesen Substraten die Kultivierung, die Sulfo-SANPAH vollständig aus dem experimentellen System folgende ECM Konjugation entfernt werden. Dies kann am besten dadurch erreicht , mit ddH 2 O Waschen und Inkubation der Deckgläser in ddH 2 O auf einem über Nacht Schüttler. Wenn Zellen, die auf den Polyacrylamid ECMs nicht überleben, oder wenn die Lebensfähigkeit geringer ist als erwartet, erhöht, und wiederholtes Waschen von Sulfo-SANPAH nach Konjugation an Fibronektin (Schritt 2.2.2.9) empfohlen wird, um potenziell dieses Problem lindern. Verwandt Protocol 3 (cDNA-Transfektion und HUVEC Kultur auf einem Deckglas), ist ein großer Einfluss auf den Erfolg der Elektroporation Verfahrens die Handhabung der HUVECs sowohl während Trypsinisierung der Zellen sie aus dem Kunststoffkolben zu entfernen, und nach Abschluss die Elektroporation (Schritte 3,3-3,4, oben). Es ist wichtig, zu kümmernvollständig die HUVECs überwachen, während in Trypsin und nicht die Zeit für die Zellen &quot;round-up&quot; auf der Oberfläche des Kolbens (typischerweise 1-2 min) erforderlich, um nicht überschreiten. Zu viel Zeit in Trypsin ist eine Hauptursache für Tod HUVEC, die typischerweise nicht realisiert ist, bis die Zellen an Fibronektin-beschichtete Deckgläser plattiert sind (Schritt 3.4) und sie dann nicht an dem Substrat zu befestigen. Von ähnlicher Bedeutung, HUVECs (und die meisten primären Zelltypen) nicht gut gehen, wenn für lange Zeit in der Elektroporation Puffer suspendiert. Bei größeren Maßstab Experimenten beispielsweise, wo der Benutzer über fünf oder mehr Bedingungen, die Elektroporation erfordern, ist es besser, um die Zellen in einzelnen Rohren (1 Röhrchen pro Transfektion) pelletiert halten und sie zu mischen, one-at-a-time , in der Elektroporations-Puffer unmittelbar vor der Elektroporation. Dieser Ansatz minimiert Inkubationszeit in Elektroporationspuffers und maximierte HUVEC Überleben. Zusätzlich sofortige Rettung in kompletten Kulturmedien ist auch crtische nach der Elektroporation. Rettungs Verzögerungen von einer Minute oder mehr nach der Elektroporation kann in nahezu vollständigen HUVEC zum Tod führen und sollte daher vermieden werden. Verwandte Zellmigrationsassay (Protocol 9), die Technik der HUVECs mit extrem hoher Dichte Züchten hängt von einer kritischen Änderung (in Schritt beschrieben 9.2) der traditionellen HUVEC-Zellkulturmethode (beschrieben in Protocol 3), das Trocknen des mit Fibronectin beschichteten Deckglas erfordert um HUVEC Kultur in einen sehr kleinen Bereich des Deckglases zu ermöglichen. Oft, wenn das Deckglas nicht vollständig getrocknet wird, oder wenn die vorherige Beschichtung des Deckglases mit Fibronectin (Schritte 2.1 oder 2.2) nicht effizient, die Medien-enthaltenden Zellen, die auf dem Deckglas platziert wird ihre Oberflächenspannung zu verlieren und um die erweitern Kanten des Deckglases, die Dichte der Zellen auf dem Deckglas, dadurch verringert wird. Eine Methode, dieses potentielle Problem zu beheben, ist das Medium aus dem Deck abzusaugen und dannStellen Sie das Deckglas (noch in den 35-mm-Schale) in die Rückseite des Biosicherheitsschrank für 5-10 min. Diese Anpassung kann dazu beitragen, den Luftstrom innerhalb des Gehäuses zu ermöglichen, in das Trocknen der Schüssel zu unterstützen. Wenn sichtbare Flüssigkeit auf dem Deckglas nach dem Lufttrocknen bleibt, aspirieren die Flüssigkeit Flecken und wieder an der Luft trocknen für 5-10 zusätzliche min im Biosicherheitsschrank ermöglichen. Es ist wichtig zu beachten, dass es keine Möglichkeit gibt, vollständig dieses potentielle Problem zu vermeiden, aber es ist weniger geworden ein Problem mit wiederholten Praxis des Protokolls. Es ist auch eine Fehlerbehebung Empfehlung, dass, wenn Deck für die Zellmigration Assay (oder einem Test im Allgemeinen) die Vorbereitung, extra Deck vorzubereiten und haben extra HUVECs ready-to-go im Falle von Problemen auf dem Weg. Mit diesen Problem Überlegungen im Auge, ist es auch wichtig, den Nutzen der Protokolle zu markieren diskutiert und deren Auswirkungen in Zukunft Zellbiologie Forschung. Die Anwendbarkeit auf die polyacrylamid Ansatz ist breit gefächert und umfasst nicht nur zweidimensionale Studien der zell ECM Eingriff (oben beschrieben), sondern auch dreidimensionale Untersuchungen 5. Diese Anwendung ist entscheidend für die Erhöhung unser Verständnis, wie HUVECs Zellform und Migration in physiologischen Umgebungen zu regulieren und sollten Ermittler ein grundlegendes Verständnis dafür, wie morphologische Veränderungen koordiniert mit Zytoskelett-Veränderungen. Während die hier beschriebenen Protokolle auf Messungen der MT Wachstumsdynamik fokussiert sind, kann die Mehrzahl der Protokolle und sollte eine beliebige Anzahl von anderen mikroskopisch meßbaren Aspekte der zell ECM-Wechselwirkungen zu messen angepasst werden. Bezüglich MT Dynamik gibt es zahlreiche MAPs, einschließlich mindestens 14 Familien von kinesins 89, die jeweils mit einem potentiellen Beitrag zu einer HUVEC Polarität und gerichtete Wanderung und alle , die unter Verwendung der vorgestellten Protokolle untersucht werden können. Zukünftige Untersuchungen sollten einelso an Engagement zell ECM im Vergleich zu Krankheitszuständen in normalen ausgerichtet sein. HUVEC Protokolle hier vorgestellten sind anwendbar auf Untersuchungen der normalen vaskulären Homöostase Prozesse sowie Krankheitszuständen, einschließlich Herzerkrankungen, Retinopathie, Tumorwachstum und Metastasierung, um nur einige zu nennen. Konjugieren sichtlich transparent ECMs und Polyacrylamid Substrate zugänglich Einhaltung Mikroskopische Untersuchungen zum Eingriff Studien zell ECM solchen Gefäßangiogenese überwacht dass endothelial Zelle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung werden können. Diese Arten von experimentellen Ansätzen bereits offenbaren wichtige Unterschiede in endothelialen Zellform, Polarität, die Migration und die Wirkungen von Proteinen begonnen, die diese Prozesse 5,31,90 regulieren. Künftige Anstrengungen sollten zu identifizieren wollen, wie die Kombination von ECM-Compliance und Dimensionalität mechanosensing lokal Kontrollproteine ​​dienen können, die gezielt und Zytoskeletts regulieren.

Die Angiogenese wird durch extrazelluläre Signal Cues ausgelöst, die Endothelzellen (ECs) fördern zu polarisieren, wandern mit Richtungs Spezifität und neue Gefäße in Gewebe bilden, die Blutversorgung. Dazu tragen gedacht, um die Angiogenese fahren sind Signale von der extrazellulären Matrix (ECM). Als Reaktion auf körperliche Signale erstrecken ECs neue Zweige mit Richtungsspezifität Richtungsbewegung in die Bildung des vaskulären Netzwerks 1,2 zu führen. Die Architektur der EG - Morphologie und Verzweigung wird durch lokale Regelung der Mikrotubuli (MT) Zytoskelett in einer Weise definiert , die mit der Regulierung von ACTO-Myosin Kontraktilität 3 koordiniert wird. Damit Zweige EG, Myosin-II lokal herunter reguliert werden müssen , zu bilden, was zu einer lokalisierten Membranausstülpungen 4. Zur gleichen Zeit und am gleichen Ort innerhalb der Zelle geworden MT Wachstumsdynamik verändert in langsame und anhaltende MT Wachstum resultierende Zweig elon zu fördernsuchung und Stabilität 5. Diese koordinierte Zytoskelett-Regelung erlaubt ECs ihre Morphologie zu polarisieren gerichtete Migration zu erleichtern. Die Entwicklung eines polarisierten Zellmorphologie erfordert polarisiertem MT Anordnung 6. In der Migration Epithelzellen wachsen MTs langsam und beharrlich speziell an der Vorderkante der Zelle 7-9; während in Neuronen erfordert die Initiierung und Dehnung von Axonen und Dendriten , dass MTs nicht nur vorhanden sind, sondern dass sie durchlaufen dynamisch die Prozesse der Montage und Demontage 10-15. Auf diese Weise lokalisierte Steuerung der Wachstumsdynamik MT bestimmt die Architektur der Zelle und ermöglicht eine schnelle Remodellierung der Zellmorphologie als ECs durch ihre ECM navigieren. MT Wachstumsdynamik von Familien von molekularen Motorproteinen und nicht-Motorproteine ​​reguliert werden, sogenannte Mikrotubuli assoziierte Proteine ​​oder Mikrotubuli interagierender Proteine ​​(von nun an RefeRred als MAPs). MAPs kann vor Ort aktiviert oder inaktiviert werden, in der Regel durch Signalkaskaden an der Zell-ECM - Schnittstelle 16,17 initiiert. Sobald er aktiv ist, MAPs Funktion zum MT durch die Bindung und die Kinetik der MT Montage und Demontage zu verändern; dadurch funktioniert lokal MT Dynamik regeln , um 18 bis 20 Zellform und Polarität zu fördern. Mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) ist ein Kinesin-13 Familie MAP , die 21-23 MT Demontage MT Enden und Paare ATP - Hydrolyse bindet. Diese funktionelle Rolle von MCAK ist bekannt in der mitotischen Spindel 24-28 kritisch zu sein, wie auch während der Inter 29,30. Innerhalb der Interphase ECs wird MCAK-vermittelte MT Demontage durch lokalisierte Aurora-A induzierte Phosphorylierung von MCAK als Reaktion auf Wundrand induzierte Aktivierung des Rac1 kleine GTPase geregelt. Das Ergebnis dieser Signalkaskade ist die Hemmung der MCAK an der Vorderkante von ECs, was zu polarisiertem MT Wachstum in Richtung leading Rand und MCAK-induzierte MT Demontage an der Hinterkante von 31 ECs migrieren. Traditionelle Methoden zur MT Wachstumsdynamik Messung haben typischerweise Handverfolgung entweder fluoreszierend markierten Tubulin oder, in jüngerer Zeit, fluoreszenzmarkierte MT End binding protein 1 oder 3 (EB1 oder EB3, respectively) verwendet. Der fluoreszierende Tubulin Ansatz hat den Vorteil, dass der gesamte MT Array Beschriftung. Da jedoch die meisten mitotischen Zelltypen eine radiale Anordnung von MTs während der Inter 8,32,33, MTs in der Nähe der Zentrosomen halten sind sehr dicht, und als Ergebnis, MT Wachstum und Abbau mit fluoreszierenden Tubulin Tracking ist in der Regel auf die Umfangs begrenzt Regionen der Zelle. Aufgrund dieser Einschränkungen, die Verwendung von fluoreszenzmarkierten EB-Proteine ​​(EB1 oder EB3) die häufigere Ansatz MT Dynamik zu messen war. Denn nur EBs die wachsenden Plus-Enden von MTs beschriften, erscheinen sie als kleine (1-3 &amp; mgr; m), hell fluoreszierende komments, also mit sehr begrenzten Hintergrundfluoreszenz 34-37 eine leicht unterscheidbare Marker der MT Polymerisation bereitstellt. Während die Tatsache, dass nur EBs Etikett eine Teilmenge des MT-Array eine große Stärke des Ansatzes EB darstellt, auch sie eine wichtige Einschränkung betont werden, dass nicht wachsenden MTs nicht vom EB3 Ansatz gekennzeichnet. Dennoch ist die Fähigkeit zu messen und EB3 Kometen im Laufe der Zeit zu verfolgen und MT Wachstum innerhalb subzellulärer Regionen zu visualisieren machen diesen Ansatz ideal für Anwendungen, die regionale Auswertung der MT Organisation erfordern. Eine andere kritische Einschränkung der herkömmlichen Methoden zur Messung MT Wachstumsdynamik hat sehr große Datenmengen, und die Zeit für die Datenanalyse erforderlich. Diese Einschränkung ergibt sich aus der Notwendigkeit, das Handtracking von Hunderten von EB Kometen mit hoher Zeitauflösung. Darüber hinaus müssen diese Messungen in einer statistisch signifikanten Anzahl von Zellen und auch unter einer Vielzahl von Steuer- und Experime durchgeführt durchgeführt werdenntal Bedingungen. Vor kurzem haben diese Einschränkungen durch rechnerische Analysetechniken überwinden speziell bei Tracking EB3 Kometen mit Zeitraffer-Mikroskopie in lebenden Zellen 35 gerichtet. Bei richtiger Anwendung dient diese Rechenansatz sowohl das Potential für menschliche Fehler, die mit der Hand-tracking zusätzlich zur Bereitstellung eines Hochdurchsatzverfahren zur Messung der MT Polymerisation beschränken. Rechnerische Analyse von MT Dynamik der MATLAB-basierten Software - Paket, plusTipTracker, ermöglicht Messungen von MT Wachstum von fluoreszenzmarkierten EB3 Kometen 5,31,35,38 Tracking. Zusätzlich ermöglicht plusTipTracker Software zur Berechnung von Katastrophenereignisse MT (aka Demontage) , basierend auf dem Verschwinden des EB3 Kometen in einem wachsenden MT Spur und ermöglicht subzellulären (aka regional) Analyse der MT Wachstumsdynamik innerhalb benutzerdefinierten interessierenden Bereiche . Für unsere Studien wurden MT Wachstumsdynamik im Vergleich innerhalbverzweigte Regionen im Vergleich zu nicht-verzweigte Regionen oder im Vergleich zu Hinterzellkanten innerhalb führt. Datenausgabe von plusTipTracker Software kann auch farbcodierte Spur Overlays für einzelne Zellen verwendet werden und subzellulären Regionen zu generieren. Hier beschreiben wir die Methode, nach der die Rolle der MCAK untersuchen bei der Modulation der Dynamik MT Wachstum und den Beitrag dieses MT Depolymeraseaktivität zur Regulierung der EG-Morphologie und gerichtete Migration Verzweigung. Unser Ansatz verwendet, um einen primären humanen Zelllinie, menschliche Endothelzellen aus der Nabelvene (HUVECs), die leicht kultiviert werden und sehr zugänglich für die Elektroporation-induzierte, transiente Transfektion von Plasmid-cDNA. Wir haben dann verwendet hochauflösende, Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von HUVECs mit MT End transfizierten Protein Binding 3 (EB3) und mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) -spezifischen cDNA-Konstrukte Auswirkungen auf MT Dynamik zu bewerten HUVECs transfiziert. PlusTipTracker-basierte Rechenbildanalyse von EB3-markierten MT Plusenden war MT Wachstumsgeschwindigkeiten und MT Wachstum Lebensdauer im Zeitraffer Bilder, zu messen und zu vergleichen Effekte der experimentellen Manipulationen auf MT Wachstumsdynamik zu messen. Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung der Dynamik MT und der Identifizierung, wie lokalisierte Regulierung der MT Dynamik innerhalb subzellulären Regionen trägt zu den angiogenen Prozessen der EC Verzweigung und Migration. Diese Techniken sind für Untersuchungen von jeder Karte, die fluoreszenzmarkierten und ausgedrückt in lebenden Zellen werden kann.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;mouse IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara cooled charge-coupled device camera</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 goat anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply &amp;amp; Growth Factors (contents shown below)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)&amp;nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Electronic shutter</td><td>Sutter instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contains the electroporation buffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&amp;ndash;pT288&amp;ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&amp;ndash;&amp;alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk&amp;nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

HUVEC Kultur für Lebendzell-Mikroskopie Abbildung lebender Zellen von HUVECs fluoreszierende Proteine ​​exprimieren erfordert , dass HUVECs werden in einer Umgebung gehalten , die geeignet ist für normales Zellwachstum und Wartung, sowie normale Protein - Expression und Funktion. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll eine gepufferte vorzubereiten verwendet und geschlossenes System, das für das Sammeln von optischen Eigenschaften optimiert Zeitrafferbilder von lebenden Zellen aufrecht erhält. Dünne Streifen von doppelseitigem Klebeband werden auf einen Glasobjektträger (1A) angeordnet und dann das Deckglas des kultivierten HUVECs enthält , wird auf der Oberseite des Bandes wie beispiels invertiert , dass die Zellen gegenüber dem Schieber (1B). Auf diese Weise stellt das Band eine kleine Lücke zwischen den beiden Glasoberflächen und schafft einen Raum , in dem die Zellen in geeigneten Zellkulturmedium gebadet werden (1C, siehe Protokoll 4, oben). ichna letzten Schritt wird das Deckglas auf dem Glasobjektträger eine abgedichtete Vaseline unter Verwendung: Lanolin: Paraffinwachs (1: 1: 1 - Mischung, VALAP; 1D) ein geschlossenes System zu schaffen. Dieser Zellkulturansatz wurde sowohl für die kürzere Zeitsequenz Abbilden EB3 Kometen und für die längere Zeitsequenz Verzweigungs und Migrationsexperimente verwendet. Zusätzlich kann das wachsartige Konsistenz VALAP zum einfachen Entfernen aus dem Glasobjektträger und Deckglas am Ende eines Abbildungs ​​experimentieren, so daß ergänzende Ansätze einschließlich Fixierung und Immunmarkierung (siehe Protokoll 8) erlaubt, können auf dem gleichen Deckglas und Zellprobe durchgeführt werden, dass wurde mit der Live-Cell-Imaging-Ansatz visualisiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Abb . 1: Methodology of HUVEC Kultur lebender Zellen mikroskopischen Abbildung (A) Schneiden 2 Stück doppelseitigen Klebebands in 0,65 cm x 2.50 cm rechteckigen Streifen und befestigen ein Stück doppelseitigen Klebebands horizontal entlang der oberen Kante der Folie, und das andere Stück, entlang der Unterkante des Schiebers. Es ist wichtig , eine kleine Menge an Raum zwischen dem Band und dem Schlitten Kante zum Abdichten der Kammer zu ermöglichen , wie in (D) beschrieben. (B) einer Pinzette entfernen Sie die Deck Verwendung enthält HUVECs und invertieren die Deck (Zellenseite nach unten) auf der Oberseite der Bandstücke. (C) mit einer Mikropipette, dann werden 40 &amp; mgr; l von Bildmedien (vollständige endothelialen basalen Medium , das mit 25 &amp; mgr; M HEPES) zwischen dem Deckglas und dem Glasträger. Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen dem Deckglas und Objektträger vollständig mit Bildmedien und vermeiden Sie Blasen gefüllt ist. Verwenden, um eine Wasserstrahlpumpe entlang der Kante des Deckglases überschüssige Medien zu entfernen, falls erforderlich. (D) Verwenden Sie warmes VALAP (1: 1: 1 Vaseline: Lanolin: Paraffin) um die Ränder des Deckglases zu versiegeln. Überprüfen Sie für Bildmedien Leckages durch leichtes Drücken auf dem Deckglas um. Verwenden Sie zusätzliche VALAP zu beheben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Automatische Verfolgung von EB3 fluoreszenzmarkierten ermöglicht eine umfassende Analyse der gesamten Zelle und regionalen MT Wachstumsdynamik. Die Sammlung von klar, deutlich und sehr Zeit- und ortsaufgelösten mikroskopischen Bildern des EB3 Protein ist auf die Analyse von EB3 Bewegungen innerhalb der Zelle essentiell. HUVEC Expression EB3 fluoreszenzmarkierten variiert von Zelle zu Zelle verbreitet und die Fluoreszenzintensität erhöht typischerweise innerhalb der gleichen Zelle über einen Zeitraum von Stunden. Daher ist es wichtig, diese Veränderungen in der Expression Profil zu identifizieren, um mögliche Auswirkungen der erhöhten EB-Expression auf MT Wachstumsdynamik zu prüfen und zu überwachen. Dies geschieht am besten durch die Auswertung Grau Fluoreszenz intensity Profile für jeden abgebildeten Zelle, und dann die Datenanalyse auf jene Zellen zu beschränken, die einen definierten Bereich von Graustufen-Expressionsprofile anzuzeigen. Erste Bewertung der Expression Profildatensätze ist kritisch und sollte mit MT Wachstumsdynamik Daten verglichen werden, die durch plusTipTracker Software für jede Zelle erhalten wird. Expressionsprofile können gegen MT Wachstumsgeschwindigkeit und MT Wachstum Lebensdauer innerhalb einer experimentellen Gruppe für jede Zelle aufgetragen werden, um den gewünschten Bereich der Graustufendarstellung zu bestimmen und potenzielle Ausreißer zu identifizieren. Abbildung 2 Highlights ein HUVEC auf einem Fibronektin - Substrat kultiviert (siehe Protokoll 2.1, oben) und mit dem Ausdruck in der Nähe von den optimalen Mengen an Mapple-markierten EB3. Fluoreszierende EB3 Kometen sind in einem Zeitraffer-Serie von Bildern über einen Zeitraum von 12 sec (2A) gezeigt. Analyse von EB3 Kometen plusTipTracker Software beinhaltet einen automatisierten, Frame-by-Frame EB3 Komet Dete mitction (grüne und gelbe Punkte, 2B). Kometen innerhalb jedes Rahmens erfasst werden dann verknüpft, abhängig von ihrer Änderung in der Position von Rahmen zu Rahmen, EB3 Spuren und eine visuelle EB3 Spur overlay (2C-F) zu erzeugen. Track-Overlays sind farbcodiert und Farbunterschiede können durch die Parameter vom Benutzer eingegebenen bestimmt werden. Üblicherweise verwenden diese Unterschiede den globalen Mittelwert von MT Wachstumsgeschwindigkeit und das Wachstum MT Lebensdauer 5,31 und teilen damit die Daten in vier Gruppen: langsam und kurzlebig (rot), langsam und langlebig (gelb), schnell und kurz lebte (grün) und eine schnelle und langlebige MT Wachstum (blau; 2G). PlusTipTracker-vermittelte Verfolgung von EB3-markierte MT Wachstumsdynamik ermöglicht auch benutzerdefinierte Regions of Interest (ROIs). PlusTipTracker extrahiert die Spur MT Wachstumsdaten von innerhalb der benutzerdefinierten ROI (2A, B und F), wodurch für den Vergleich von MT Wachstums dynamics in verschiedenen Regionen der gleichen Zelle. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Abbildung 2: EB3 Komet Erkennung, Verfolgung und plusTipTracker Datenausgang (A) Zeitraffer-Film eines HUVEC exprimieren Mapple EB3.. Linke Seite zeigt eine ganze Zelle Ansicht und ganze Zelle Maske (weiße Linie) Demarkieren die Zellgrenzen. Red Box stellt den gezoomten Bereich in den Zeitraffer-Bilder gezeigt (rechte Felder). Rechts Tafeln zeigen roh Grauzeitrafferbilder von EB3 Kometen in aufeinanderfolgenden Abbildungsrahmen (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) Nachweis von plusTipTracker EB3 Kometen aus den Bildern in (A) gezeigt ist . Linke Seite zeigt eine ganze Zelle Ansicht der erkannten Kometen (gelbe Punkte). Red Box stellt den gezoomten Bereich in den Zeitraffer-Bilder gezeigt (rechte Felder). Rechts Platten markieren fünf erkannt EB3 Kometen (rote Pfeile) und Spuren diese fünf Kometen über die 12 Sekunden Abbildungsperiode. Grün<html> dots EB3 Kometen repräsentieren detektiert, der nicht vorhanden war (oder nicht festgestellt wurden) in der vorherigen Zeitintervall. (C) Maximum Intensity Projection von 61 Frames (2 min Film) der EB3 Kometen in (A) gezeigt. (D) plusTipTracker MT Track - Overlay aus den gleichen 61 Frames (2 min Film) in (C) gezeigt. (E) Zoom von Maximum Intensity Projection (roter Kasten in C). (F) Zoom von plusTipTracker MT Track - Overlay von Maximum Intensity Projection (roter Kasten in D). (G) farbkodierte Legende für Track - Overlays in (D) gezeigt , und (F). Bezeichnung als langsam, schnell, kurzlebige oder langlebig ist für alle Wachstumsspuren in einer Gruppe von zehn Mapple-EB3 exprimierenden HUVECs gemessen am Mittelwert berechnet. Zur leichteren Visualisierung Spur Overlays in (D) und (F) werden mit invertierten Pixelintensitäten der Zelle erzeugte Bild in (A) gezeigt ist. Maßstabsbalken = 20 um./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. HUVEC Verzweigung und Muster Migration sind empfindlich Signale aus dem ECM-physikalischen mechano. HUVECs werden auch auf verschiedene Typen von Signalisierungs cues reagieren bekannt und dabei, morphologische Veränderungen unterzogen werden, die eine geeignete zelluläre Antwort auf die bestimmte Signalisierungs cue diktieren (s) 36,40-42. HUVECs kultiviert auf Fibronektin beschichteten Glassubstraten (3A), oder auf steifen 2-dimensionalen Polyacrylamid ECMs (55 kPa) in der Regel eine runde oder längliche Morphologie mit wenigen deutlichen verzweigten Vorsprünge (3B) angezeigt werden soll . Wenn jedoch kultiviert auf sehr weichem 2-dimensionalen Polyacrylamid ECMs (0,7 kPa), HUVECs zeigen eine stark verzweigte Morphologie, die bekannt ist, zur Folge haben Compliance-induzierte nach untenRegulierung der Myosin-II Kontraktilität 4,5,31 (3C). Somit regulieren HUVECs ihre zellulären Morphologie durch ECM mechanosensing, und dies wird durch lokalisierte Modulation der MT Dynamik und acto-Myosin Kontraktilität erreicht. Da HUVECs eine Vielzahl von morphologischen Eigenschaften angezeigt werden, um HUVEC zu messen Verzweigung ist es wichtig, zunächst zu definieren, was eine verzweigte Vorsprung ist, und dann zu bestimmen, wie ein verzweigter Vorsprung objektiv gemessen werden. Eine Technik verwendet eine Vier-Schritt - Ansatz , mit dem ein Zellengrenze oder &quot;Maske&quot; von Hand erzeugt wird , um die Kanten der Zelle Verfolgungs ein Bild einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzvolumenmarker exprimierenden die Zellränder (3D) zu definieren. Nach Maskenerzeugung, Zweig Ursprünge sind durch Ortung größten Krümmungswinkel zwischen dem verzweigten Vorsprung und dem Zellkörper definiert. Eine Linie wird gezogen DEMArk die &quot;Zweig Ursprung&quot; (lila gewinkelten Linien; Abbildung 3E). Filialnummer wird gemessen , indem einfach die Anzahl der Zweige mit einem definierten Zweig Ursprung zu zählen (Abbildung 3F). Verzweigungslänge wird als der Abstand von dem Verzweigungsursprung zum distalen Verzweigungsspitze (Abbildung 3G) gemessen. Zur Aufnahme von kleinen lamellipodialen Projektionen aus der Datenanalyse, zusätzliches Kriterium vermeiden verlangen , dass Äste müssen länger sein ( &quot;Zweiglänge&quot;) als breit (an der &quot;Zweig Herkunft&quot;), und dass Zweige müssen mindestens zehn Mikrometer lang sein 5 , 31. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . 3: Analyse von HUVEC Verzweigungs Morphologie (A - C) DIC Bild Beispiele von HUVECs kultiviert auf Fibronektin beschichteten Glas ECMs (A) steif (55 kPa) Polyacrylamid ECMs (B) und weiche (0,7kPa) Polyacrylamid ECMs (C). Verzweigung wird in HUVECs kultiviert auf 0,7 kPa Polyacrylamid ECMs (C) im Vergleich zu den steiferen ECMs (A, B) dramatisch zugenommen. (D). DIC mikroskopische Aufnahme (linkes Bild) eines transfizierten HUVEC exprimieren eine Mapple-C1-cDNA-Konstrukt (ein Zellvolumen Marker; rechtes Bild). Definieren (E) Herkunft der Zweig durch den größten Krümmungswinkel Ortung (dh der Position , wo die Membran die größte Krümmung zeigt, purpurfarbene Linien) auf beiden Seiten der Branche und schließen Sie dann die Winkel mit einer geraden Linie (blaue Linien) . (F) Identifizieren und verzweigte Vorsprünge auszuwählen , die erweitern&gt; 10 &amp; mgr; m von der &quot;Zweig Ursprung&quot; (definiert in E). Zählen Sie die Anzahl der verzweigten Vorsprünge, die zu erhalten &quot;Zweignummer.&quot; (G) Messen Sie den Abstand von der Mitte der &quot;Zweig Ursprung&quot; der most distale Spitze der Branche das Linienwerkzeug in der Anwendung Anmerkungen und Messungen mit Hilfe von NIS Elements Software, die zu erhalten &quot;Astlänge.&quot; Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Zusätzlich zur Erfassungs ECM Compliance HUVECs auch zur Beseitigung von benachbarten Zellkontakte als induziert durch scratch Verwundung erfassen und darauf zu reagieren. Im Migrationstest, in einer Monoschicht kultiviert HUVECs werden einer Kratzwunde ausgesetzt und Migrationseigenschaften gemessen werden (siehe Protokoll 9, oben). Nach der Induktion der Wunde durch die Monoschicht Verkratzen, polarisieren Wundrand HUVECs durch eine protrusive Vorderkante zu entwickeln , die in die Wunde (4A, t = 0 h) erstreckt. Über einen Zeitverlauf von 10-12 h, polarisiert Wundrand HUVECs wandern in den Wundbereich und füllen dieWunde, eine neue konfluenten einschichtigen Aufbau (4A, t = 11 h). Wie bei HUVEC Verzweigung schlägt aktuelle Hinweise darauf , dass Polarisierung und Migration auf die koordinierte Umorganisation des MT und Aktin - Zytoskelett kritisch abhängig ist 43-49. Dies wird dadurch erreicht, teilweise durch lokale Hemmung der an der Vorderkante MT Demontage MCAK induzierten, aber nicht an der Hinterkante des aufgewickelten Kante HUVECs 31. Die Empfindlichkeit der MT Dynamik wundinduzierten Polarisations durch die Rac1 GTPase initiiert wird, die zahlreiche nachgeschalteten Regulatorproteine ​​Ziele, einschließlich Aurora-A-Kinase, die phosphoryliert und hemmt MCAK an der Vorderkante und anderen Kinasen, die fähig sind, zu hemmen oder MAPs aktivierenden lokal MT Wachstum und Schrumpfung 18,31,36,48,50-53 modulieren. Umfangreiche experimentelle Beweise unterstützt die Vorstellung, dass die Koordinierung der Vorderkante Vorsprung und Hinterkante Kontraktion wird durch Zyklen von Rac1 Aktivierung geregeltMT Montage an der Vorderkante und RhoA Aktivierung acto-Myosin Kontraktilität an der Hinterkante, wodurch der Fahrt gerichtet Motilität 9,41,51,52,54-58 zu fördern. Bis heute gibt es keine etablierte Methode für die automatische Verfolgung von Zellmigration durchführen. Dies ist ein Ergebnis von Schwierigkeiten bei der rechenzell ECM Grenzen zu analysieren, die konsequent zu ändern sind als Wundrandzellen polarisieren und zu migrieren. Fluoreszierend markierten Zellen von Tracking - 59-64, die Bevölkerung von fluoreszenzmarkierten HUVECs in Wundrand Migrationsversuche beträgt ca. 30-40% der Gesamt HUVEC Bevölkerung und damit die Mehrheit der Wundrandzellen Während viele Software - Programme in der Lage sind ein Muss werden durch Phasenkontrast oder DIC-Bildgebung sichtbar gemacht. Zusätzlich ist es wichtig, wenn die Migration wundKante Messung fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Zellen innerhalb der gleichen Wunde auszuwerten, um spezifisch zu identifizieren,Auswirkungen der Expressionskonstrukte sowohl innerhalb des experimentellen Studiengruppen und zwischen den experimentellen Studiengruppen. Derzeit ist der beste Ansatz HUVEC Migration zu messen , um eine Hand - Tracking - Ansatz zu verwenden , bei dem ein Wundrand Zelle zunächst identifiziert und dann werden der Kern und Kernkörperchen identifiziert (Abbildung 4B). Der Nukleolus wird als die Position Determinante für die Zellverfolgung verwendet aufgrund seiner hohen Lichtstreuungs Dichte und relativ geringe Größe. Diese beiden Merkmale der Nukleolus machen es leichter zu identifizieren und Messfehler zu reduzieren, indem die Bereichsbegrenzungs in dem der Benutzer einzelne Spurpositionen platzieren. HUVEC Migration Spuren werden dann durch einen Klick auf den Kernkörperchen in aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Bildrahmen erzeugt. Schließlich werden Wanderungsgeschwindigkeit und Migrationsdistanz zum Ursprung gemessen und für die Kontrolle und experimentelle Zellgruppen (4B) analysiert. <img alt="Abbildung 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Abbildung 4: Analyse der Wundrand HUVECs und Migration Tracking (A) 20X Phasenkontrast - Bilder einer 11 h Zeitraffer-Imaging - Serie von Grund auf neu Wundrand HUVECs (auch bekannt als &quot;Migration Assay&quot;).. Die Wunde und die Richtung der Migration in das Panel t = 0 h angegeben. HUVECs werden gezeigt, um die Wundkante und vorab in die Wunde zu durchqueren, bis eine Monoschicht von Zellen gebildet wird (t = 3,5 h - t = 11 h). (B) Analyse der Migrationstest Zeitraffer - Bildgebung (wie in A gezeigt) erfordert zunächst die Identifizierung einer verfolgbaren HUVEC Wundrand basierend auf Zellenposition (dh Zellen physisch am Rand der Wunde) und Expressionsprofil (d .h. wählen Sie eine grüne Zelle Wundrand , wenn das Experiment Expression von GFP beinhaltet). Mit dem Phasenkontrastbild, identifizieren den Kern und die Kernkörperchen. Hand verfolgen die Kernkörperchen in aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Bilder, die eine Verwendung vonAnwendung Notationen und Messungen in NIS Elements Software Wanderungsgeschwindigkeit und den Abstand zum Ursprung zu bestimmen. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m (A), 20 &amp; mgr; m (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Aufrufe.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

Serie: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Immunologie und Infektion

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Biotechnik

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Medizin

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

Intravitale Multiphotonenmikroskopie in Echtzeit zur Visualisierung fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen zur Erhöhung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

Mikrotubuli Plus-End Dynamics Visualisierung im Huntington-Modell basierend auf humanen primären Hautfibroblasten

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video